劉穎馮達(dá)斌 王績釗 張丞 張露張明鑫 陳南征

作者單位：710061 西安 1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；711500 商洛 2鎮(zhèn)安縣人民醫(yī)院胸外科；710061西安 3西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科；710061 西安 4西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科；710077西安 5西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

食管鱗癌是我國常見的惡性腫瘤之一，目前缺乏有效的治療措施［1］。放療是食管鱗癌主要的治療方式之一，尤其是對于喪失手術(shù)機會，如頸部及晚期食管鱗癌患者。但在放療中患者常出現(xiàn)放射抗拒，導(dǎo)致治療失敗，僅15.6%～16.0% 的患者可獲得完全緩解［2］。放療聯(lián)合靶向治療或免疫治療亦尚不能有效延長食管鱗癌患者生存期［3-5］。近年來，中藥提取物在腫瘤防治中的作用被越來越多報道?？鄥A（Matrine）屬喹諾里西啶類，是中藥苦參含量最高的生物堿成分。有研究發(fā)現(xiàn)苦參堿通過抑制肝癌細(xì)胞中的AKT/GSK3β/βcatenin信號通路降低β-catenin轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖能力［6］。也有研究報道苦參堿可增強人宮頸癌細(xì)胞對放射性的敏感性［7］。在食管癌中，苦參堿也已被報道可抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖能力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］。而臨床應(yīng)用復(fù)方苦參注射液可降低食管癌的急性放療副作用［9］。但復(fù)方苦參能否改善食管鱗癌的放療效果及其分子機制，目前仍少有研究報道。本研究通過構(gòu)建放射抵抗食管鱗癌細(xì)胞株，探討苦參堿是否參與調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞的放射敏感性，為臨床進一步提高其放療療效提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

食管鱗癌細(xì)胞Eca-109及正常食管上皮細(xì)胞HEEC均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基及10%胎牛血清購自美國Gibco公司。SYBR Premix Dimmer Eraser Kit、The NucleoSpin miRNA Kit和Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green Kit均購自日本TaKaRa公司。RAD21抗體及二抗購自美國CST公司。miR-433-3p過表達(dá)、miR-433-3p敲減、RAD21過表達(dá)、RAD21敲減慢病毒及相應(yīng)的對照病毒均購自上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

食管鱗癌放療抵抗細(xì)胞Eca-109R為本課題組前期構(gòu)建。Eca-109R、Eca-109及HEEC細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基及10%胎牛血清，在37℃、5% CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

按照操作指南，使用TransFast Transfection Reagent輔助轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，構(gòu)建miR-433-3p過表達(dá)、miR-433-3p敲減、RAD21過表達(dá)、RAD21敲減的Eca-109R細(xì)胞及相應(yīng)的對照細(xì)胞。采用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染情況，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。實驗分組：不同劑量照射組為分別經(jīng) 0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy及 8 Gy 劑量照射的轉(zhuǎn)染前后的Eca-109和Eca-109R細(xì)胞；不同濃度苦參堿處理組分別以0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL和5.0 mg/mL苦參堿處理轉(zhuǎn)染前后的Eca-109和Eca-109R細(xì)胞，設(shè)未經(jīng)處理的相應(yīng)對照組。

1.3 qRT-PCR檢測RAD21和miR-433-3p的表達(dá)

用Trizol試劑盒提取目的細(xì)胞的總RNA。RAD21用GoScript反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)建立cDNA；利用SYBR Premix Dimmer Eraser Kit完成qRT-PCR，以GADPH為內(nèi)參。miR-433-3p用The NucleoSpin miRNA Kit完成microRNA純化，Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green Kit進行qRT-PCR，U6為內(nèi)參。PCR 反應(yīng)條件：95℃ 15 s；60℃1min，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的表達(dá)。引物序列：RAD21Forward為 5′-GGATAAGAAGCTAACCAAAGCCC-3′，Reverse 為 5′-CTCCCAGTAAGAGATGTCCTGAT-3′；miR-433-3p Forward 為 5′-GGAGAAGTACGGTGAGCCTGT-3′，Reverse 為 5′-GAACACCGAGGAGCCCATCAT-3′；GAPDH Forward 為 5′-ACAGCCTCAAGATCATCAGC-3′，Reverse 為 5′-GGTCATGAGTCCTTCCACGAT-3′；U6 Forward 為 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，Reverse 為5′-TCATCCAAATACTCCACACGC-3′。

1.4 Western blot檢測RAD21蛋白表達(dá)

用RIPA獲取細(xì)胞總蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。室溫條件下以TBST及5%脫脂牛奶封閉 1 h，加入 RAD21一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，次日與二抗（1∶4 000）孵育1 h。使用ECL試劑顯影，應(yīng)用Image J圖像分析軟件，以GAPDH內(nèi)參照，計算相對蛋白表達(dá)量。

1.5 CCK-8檢測細(xì)胞活性

取 100 μL目的細(xì)胞懸液，以 1×105/孔接種于96孔板中。每個實驗組設(shè)置3個復(fù)孔，設(shè)置3個對照組復(fù)孔，加入PBS。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h及120 h時每孔加入20 μL CCK-8溶液（5 mg/mL），用酶標(biāo)儀測定450 nm處的光密度（OD）值，分別計算各組細(xì)胞存活率并繪制細(xì)胞生存曲線，通過生存曲線計算苦參堿抑制的IC50。

1.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-433-3p與RAD21的靶向關(guān)系

構(gòu)建含有 RAD21 3′UTR野生型（Wt）及突變型（Mut）的熒光素酶報告基因，質(zhì)粒載體為pmirGLO。突變型突變位點參考RAD21 3′UTR與miR-433-3p的結(jié)合位點。將RAD21-Wt及RAD21-Mut分別與miR-433-3p及對照病毒（NC）在Eca-109細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染，具體轉(zhuǎn)染分組如下：⑴RAD21-Wt及miR-433-3p共轉(zhuǎn)染；⑵RAD21-Wt及NC共轉(zhuǎn)染；⑶RAD21-Mut及miR-433-3p共轉(zhuǎn)染；⑷RAD21-Mut及NC共轉(zhuǎn)染。檢測轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞的螢火蟲熒光值；所有熒光值均用海腎熒光值標(biāo)準(zhǔn)化。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用R 3.3.1進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用配對樣本t檢驗分析Eca-109R與其親本Eca-109細(xì)胞的qRT-PCR結(jié)果。使用獨立樣本t檢驗分析其他分組情況的qRT-PCR及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果。使用重復(fù)測量方差檢驗分析CCK-8結(jié)果。取雙側(cè)P值，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿對Eca-109R細(xì)胞活性的影響

經(jīng)不同劑量（0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy 及 8 Gy）照射后，Eca-109R細(xì)胞活性較Eca-109細(xì)胞明顯增強（P＜0.05），見圖1A。經(jīng)不同濃度（0.5 mg/mL、1.0 mg/mL，2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL 和 5.0 mg/mL）苦參堿處理后，Eca-109R細(xì)胞活性被抑制，其IC50為0.41 mg/mL，見圖1B。用0.41 mg/mL苦參堿處理Eca-109R細(xì)胞，在不同劑量照射下，苦參堿處理組的Eca-109R細(xì)胞活性低于未加入苦參堿的對照組細(xì)胞（P＜0.05），見圖 1C。

圖1 苦參堿對Eca-109R細(xì)胞活性的影響Fig.1 The influence of Matrine on cell viability of radio-resistant Eca-109R cells

2.2 miR-433-3p對Eca-109R細(xì)胞活性的影響

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-433-3p在Eca-109細(xì)胞中的表達(dá)低于HEEC細(xì)胞（P＜0.05），見圖2A。在Eca-109R細(xì)胞中miR-433-3p的表達(dá)也較親本細(xì)胞Eca-109表達(dá)降低（P＜0.05），見圖 2B。過表達(dá)miR-433-3p后 Eca-109R細(xì)胞活性明顯降低（P＜0.05），見圖2C；敲減miR-433-3p表達(dá)后Eca-109R細(xì)胞活性增強（P＜0.05），見圖 2D。不同劑量照射后，miR-433-3p過表達(dá)顯著抑制Eca-109R細(xì)胞活性（P＜0.05），見圖2E；敲減 miR-433-3p則增強Eca-109R細(xì)胞活性（P＜0.05），見圖2F。

圖2 miR-433-3p參與調(diào)控Eca-109R細(xì)胞放射抵抗Fig.2 miR-433-3p was involved in regulating radio-resistance of Eca-109R cell

2.3 RAD21對Eca-109R細(xì)胞活性的影響

qRT-PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示，RAD21在Eca-109R細(xì)胞中的表達(dá)高于親本Eca-109細(xì)胞（P＜0.05），見圖 3A～B。敲減 RAD21 后，Eca-109R 細(xì)胞活性降低（P＜0.05），見圖 3C；過表達(dá) RAD21 后，Eca-109R細(xì)胞活性明顯增強（P＜0.05），見圖3D。不同劑量照射后，RAD21敲減明顯降低Eca-109R細(xì)胞活性（P＜0.05），見圖3E；RAD21過表達(dá)則增強Eca-109R細(xì)胞活性（P＜0.05），見圖3F。

圖3 RAD21參與調(diào)控Eca-109R細(xì)胞放射抵抗Fig.3 RAD21 was involved in regulating radio-resistance of Eca-109R cells

2.4 miR-433-3p與RAD21的相互作用

在Eca-109R細(xì)胞中過表達(dá)miR-433-3p后，RAD21表達(dá)下調(diào)，見圖4A；而敲減miR-433-3p后，RAD21表達(dá)升高，見圖4B。進一步雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，RAD21-Wt+miR-433-3p組熒光素活性顯著降低，而RAD21-Mut+miR-433-3p組熒光活性未發(fā)生明顯改變，提示miR-433-3p可能與RAD21的3′UTR區(qū)域相互作用，見圖4C。過表達(dá)RAD21可以逆轉(zhuǎn)miR-433-3p對Eca-109R細(xì)胞活性的抑制作用（miR-433-3p vs miR-433-3p+RAD21，F(xiàn)=4.554，P＜0.05），見圖 4D。

圖4 miR-433-3p與RAD21的相互作用Fig.4 The crosstalk between miR-433-3p and RAD21

2.5 苦參堿在Eca-109R細(xì)胞中通過調(diào)控miR-433-3p/RAD21發(fā)揮生物學(xué)功能

用0.41 mg/mL苦參堿處理Eca-109R細(xì)胞后，miR-433-3p表達(dá)較未處理組明顯升高（P＜0.05），見圖 5A；RAD21蛋白表達(dá)下降（P＜0.05），見圖 5B。苦參堿能夠解除miR-433-3p敲減對Eca-109R細(xì)胞活性的促進作用（F=5.213，P＜0.05），見圖 5C?？鄥A處理后，敲減miR-433-3p的Eca-109R細(xì)胞中RAD21表達(dá)較未處理Eca-109R細(xì)胞降低（P＜0.05），見圖5D。

圖5 苦參堿在Eca-109R細(xì)胞中通過調(diào)控miR-433-3p/RAD21發(fā)揮生物學(xué)功能Fig.5 Matrine regulated Eca-109R cells biological function by regulating miR-433-3p/RAD21

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿可以通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞中microRNA的表達(dá)，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。有研究用microRNA芯片檢測苦參堿作用的胃癌細(xì)胞SGC-7901中的microRNA表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)共有128種miRNAs差異表達(dá)，且這些差異表達(dá)的microRNAs的生物學(xué)功能主要富集在細(xì)胞周期調(diào)控及MAPK信號通路，參與調(diào)控腫瘤進展［10］。LIAO 等［11］也發(fā)現(xiàn)，苦參堿作用于肺癌細(xì)胞后可上調(diào)其miR-133的表達(dá)，進而抑制EGFR/Akt/MMP-9通路激活。ZHAO等［12］用苦參堿處理甲狀腺癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)其可介導(dǎo)miR-21表達(dá)下調(diào)，且通過miR-21/PTEN/Akt信號通路抑制甲狀腺癌細(xì)胞的活性。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度苦參堿處理Eca-109R細(xì)胞后，Eca-109R細(xì)胞活性均受抑制，而敲減miR-433-3p能增強Eca-109R細(xì)胞活性，用0.41 mg/mL苦參堿處理Eca-109R細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)能夠解除miR-433-3p敲減對Eca-109R細(xì)胞活性的促進作用。說明在食管鱗癌細(xì)胞中，苦參堿可能通過上調(diào)miR-433-3p，增強食管鱗癌的放射敏感性。

miR-433-3p在多種腫瘤中被報道發(fā)揮抑癌作用。SUN等［13］在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達(dá)miR-433-3p，可以顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體內(nèi)外增殖能力，及侵襲遷移能力。miR-433-3p通過靶向作用于CREB，在體內(nèi)外水平增加膠質(zhì)瘤對替莫唑胺的敏感性。同樣，SHI等［14］在食管癌中也發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-433-3p可以抑制食管鱗癌的體外增殖和侵襲能力。RAD21是DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵蛋白，一般通過同源重組修復(fù)途徑參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)；RAD21還可與單鏈DNA末端結(jié)合，介導(dǎo)DNA與DNA的相互作用，協(xié)同同源重組修復(fù)相關(guān)蛋白Rad51參與同源重組修復(fù)途徑，與放療敏感性相關(guān)［15］。RAD21在肝細(xì)胞肝癌中被發(fā)現(xiàn)可促進放射線誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)過程，降低肝細(xì)胞肝癌對放射治療的敏感性［16］。RAD21敲減后的消化道腫瘤小鼠模型也對全身照射更加敏感［17］。因此推測RAD21可能作為miR-433-3p的下游基因而介導(dǎo)食管癌的放射抵抗。本研究通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-433-3p可作用于RAD21的3′UTR，并下調(diào)RAD21，且不管是敲減RAD21還是經(jīng)不同劑量照射后敲減RAD21，Eca-109R細(xì)胞的活性均被被抑制，而過表達(dá)RAD21可以逆轉(zhuǎn)miR-433-3p對Eca-109R細(xì)胞活性的抑制作用，說明下調(diào)RAD21可以增強Eca-109R細(xì)胞放射敏感性，而miR-433-3p可能通過靶向負(fù)調(diào)控RAD21發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，苦參堿可以抑制放射抵抗食管鱗癌細(xì)胞Eca-109R的增殖能力，并增加Eca-109R細(xì)胞對電離輻射的敏感性?？鄥A可能通過調(diào)控miR-433-3p/RAD21信號通路，影響食管鱗癌的同源重組修復(fù)過程，從而增強其電離輻射敏感性。