李 奕，丁子惠，袁 月，李 萍

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130117）

卒中是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一[1]。每年約795 000 人新發(fā)或復(fù)發(fā)卒中，其中缺血性卒中占比87%[2]。1996 年起，重組纖溶酶原激活劑（rt-PA）結(jié)合手術(shù)取栓成為缺血性卒中的治療方案[3]，但存在治療時(shí)間窗、rt-PA 潛在不良反應(yīng)及其特定適應(yīng)證等應(yīng)用局限[4]。靶向缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要細(xì)胞組分治療腦缺血是新的研究方向之一[5]，核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）作為抗氧化反應(yīng)表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，已成為預(yù)防和逆轉(zhuǎn)卒中潛在的靶向治療途徑[6]。多項(xiàng)研究表明，中醫(yī)藥治療方法通過調(diào)控Nrf2 防治腦缺血。

1 Nrf2 的生物學(xué)基礎(chǔ)

轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 是細(xì)胞和組織內(nèi)源和外源性應(yīng)激防御機(jī)制的主要調(diào)節(jié)因子，自1994 年發(fā)現(xiàn)以來，在結(jié)構(gòu)、分子機(jī)制、功能、調(diào)節(jié)、下游途徑及其作為疾病治療靶點(diǎn)的意義方面得到了廣泛研究。

1.1 Nrf2 的分子結(jié)構(gòu) 核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）是外源性激活受體（XAR）的主要調(diào)節(jié)因子，調(diào)控參與細(xì)胞抵御外源性物質(zhì)和細(xì)胞應(yīng)激的靶基因表達(dá)。Nrf2 包含7 個(gè)具有堿性亮氨酸拉鏈蛋白（CNC）同源性的功能結(jié)構(gòu)域：Neh1-Neh7（Nrf2-ECH homology），負(fù)責(zé)協(xié)同調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性。保守結(jié)構(gòu)域Neh1，含有3 個(gè)堿性亮氨酸基序（bZip），使Nrf2 得以識(shí)別、結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件（ARE）。在Nrf2 與Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap1）解離后，Neh1 能夠標(biāo)記出Nrf2 移位的核定位信號(hào)。此外，Neh1 還與E2 泛素偶聯(lián)酶共同維持Nrf2 的穩(wěn)定性[7]。Neh2 位于氨基端，是Keap1 與Nrf2 的結(jié)合區(qū)，參與Nrf2 泛素化和蛋白酶體降解，對(duì)Nrf2 起到負(fù)性調(diào)控作用。Neh3 位于羥基端，負(fù)責(zé)調(diào)控ARE 相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活，Neh4 和Neh5 則通過與轉(zhuǎn)錄共激活因子CBP（CREBBP-cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白）相互作用啟動(dòng)Nrf2 下游基因轉(zhuǎn)錄，并關(guān)聯(lián)核輔因子RAC3/AIB1/SRC-3 以增強(qiáng)Nrf2-ARE 相關(guān)的基因表達(dá)[8]。Neh6 和Neh7 均為Nrf2 轉(zhuǎn)錄活性的負(fù)調(diào)控因子，其中，Neh6 基于E3 泛素連接酶β-tRCP 的識(shí)別，建立Keap1 替代降解途徑，Neh7 則通過與維甲酸X 受體α（RXRα）結(jié)合抑制Nrf2 轉(zhuǎn)錄活性[9]。

1.2 Nrf2 的抗氧化調(diào)控機(jī)制 氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）是多種病理過程的主要標(biāo)志之一，是由過氧化氫、超氧化物和羥基自由基等活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生的氧化還原失衡狀態(tài)。這些高活性化合物導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)主鏈斷裂、線粒體去極化和細(xì)胞凋亡，引起細(xì)胞和組織損傷，對(duì)包括大腦在內(nèi)的組織和器官造成嚴(yán)重?fù)p害，是腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的主要前驅(qū)因素[10]。

Nrf2 作為細(xì)胞抗氧化的重要轉(zhuǎn)錄因子[11]，在正常生理?xiàng)l件下，與Keap1 在ETGE 和DLG 基序處結(jié)合，維持連續(xù)泛素化和蛋白酶體降解。在應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2 脫離蛋白酶體的降解機(jī)制，DLG 基序從KEAP1中的DGR 域釋放，在胞漿聚集并移位至核內(nèi)與小Maf蛋白（MafF，MafG 和MafK）形成二聚體。靶基因啟動(dòng)子中的ARE 序列TGCnnn（G/C）Tca（T/C）與異源二聚體結(jié)合并激活相關(guān)表達(dá)，從而轉(zhuǎn)錄下游基因。Nrf2 常見下游基因產(chǎn)物包括抗氧化酶，如血紅素加氧酶1（HMOX-1）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）、過氧化物氧化還蛋白（PRDX）-1、谷胱甘肽還原酶（GR）；解毒代謝酶NAD（P）H 醌脫氫酶1（NQO1）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGT）等[12]。此外，下游其他參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、泛素化、磷酸化、細(xì)胞周期、增殖與凋亡的基因類別，也已被證明為潛在的Nrf2 調(diào)節(jié)內(nèi)源性可編碼基因。在維持細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)中起著基本作用，并涉及細(xì)胞解毒、抗炎、NADPH 再生和中間代謝等多種細(xì)胞保護(hù)功能。

2 Nrf2 在中醫(yī)藥治療腦缺血中的作用機(jī)制

缺血性卒中是由于血管破裂或堵塞，導(dǎo)致局部血液供應(yīng)突然中斷，并在相應(yīng)腦組織中啟動(dòng)缺氧和低血糖狀態(tài)。神經(jīng)細(xì)胞膜去極化導(dǎo)致N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDA）的激活劑谷氨酸釋放，這些非選擇性陽離子通道的開放造成鈣超載及神經(jīng)細(xì)胞死亡，線粒體產(chǎn)生過多氧化物，進(jìn)而阻礙抗氧化防御，導(dǎo)致缺血后炎癥和腦組織損傷增加[13]。此外，由于血流恢復(fù)，還會(huì)發(fā)生血管壁結(jié)構(gòu)蛋白降解和血腦屏障障礙，進(jìn)一步增強(qiáng)組織氧合，生成ROS，加劇炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡和OS 損傷[11]。研究表明，Nrf2 可通過抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥損傷、調(diào)節(jié)自噬以及促血管生成等作用機(jī)制減輕缺血后繼發(fā)性腦損傷。

2.1 抗氧化應(yīng)激 腦缺血期間，過度的氧化刺激使Nrf2 從Keap1 中解離，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與ARE 結(jié)合，激活下游抗氧化酶等細(xì)胞保護(hù)蛋白的靶基因表達(dá)。WANG J 等[14]利用局灶性腦缺血（MCAO）實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MCAO 后24 h，小鼠缺血皮層Nrf2、HO-1 和SOD 抗氧化酶的蛋白表達(dá)水平增高；3 d 后，HO-1，NQO1，SOD2 和GPx 蛋白表達(dá)增至1.8～3.6 倍。其中，假手術(shù)組Nrf2 和HO-1 陽性細(xì)胞檢測(cè)含量較少，表明Nrf2 和HO-1 在非缺血性皮層區(qū)域表達(dá)較低，在缺血區(qū)域顯著增加。王力波等[15]構(gòu)建Nrf2 敲除PC12細(xì)胞系，證實(shí)Nrf2 在腦缺血后的氧化應(yīng)激過程中起抑制作用。胡躍強(qiáng)等[16]通過線栓法制備MCAO 模型，提示清熱化瘀方可通過調(diào)控Nrf2/ARE 通路發(fā)揮抗氧化作用。趙秋陽等[17]對(duì)CIRI 模型大鼠進(jìn)行百會(huì)、四神聰針刺治療，缺血腦組織中Nrf2 表達(dá)水平顯著升高，說明針刺可通過調(diào)控Nrf2 提高SOD、GSH-px 含量，從而治療CIRI。更多研究表明，在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中均檢測(cè)到Nrf2 和HO-1，表明抗氧化物在大多數(shù)皮層細(xì)胞中可同時(shí)表達(dá)。通過中醫(yī)藥干預(yù)控制活性氧水平和預(yù)防氧化應(yīng)激是解決缺血后繼發(fā)性腦損傷和改善卒中預(yù)后的潛在治療策略[14-17]。

2.2 抗炎癥損傷 炎癥是由損傷引發(fā)的宿主防御機(jī)制，在缺血性腦損傷的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。腦缺血性損傷和血流再灌注會(huì)引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括氧化應(yīng)激、興奮性毒性和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)組織損傷和細(xì)胞凋亡[18]。缺血后神經(jīng)系統(tǒng)炎癥為卒中治療提供了新的方向。彭嘯宇[19]研究表明，山藥多糖通過激活Nrf2/HO-1 通路進(jìn)而降低TNF-α、IL-6、IL-1β 水平，抑制炎性表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Nrf2/HO-1 表達(dá)可減輕炎癥反應(yīng)，通過中醫(yī)藥干預(yù)可抑制神經(jīng)組織炎癥反應(yīng)，在腦缺血中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。HOU Y等[20]認(rèn)為，Nrf2 通過作用于硫氧還蛋白-1（Trx1）/硫氧還蛋白互作蛋白（TXNIP）復(fù)合物下調(diào)NLRP3 炎癥小體活性，證明NLRP3 在腦缺血再灌注的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。朱慧淵等[21]建立改良MCAO 模型，發(fā)現(xiàn)腦組織中Nrf2 及炎癥因子IL-1β 蛋白及Mrna 表達(dá)升高，丹參紅花配伍能夠通過調(diào)控Nrf2，減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而抑制相關(guān)炎癥反應(yīng)。而NLRP3 炎癥小體參與膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，激活胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體與半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1），進(jìn)一步影響其他炎癥介質(zhì)的分泌[20]。

2.3 調(diào)節(jié)自噬 自噬是指細(xì)胞對(duì)自身胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器的吞噬作用，通過形成自噬小體，包裹部分胞內(nèi)物質(zhì)與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，繼而將內(nèi)容物降解。自噬是真核細(xì)胞降解長(zhǎng)半衰期蛋白和受損細(xì)胞器的主要調(diào)節(jié)代謝機(jī)制[22]。在饑餓、缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏和感染等應(yīng)激條件下，自噬可以被激活，為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和能量。此外，自噬還可以去除受損的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和異常折疊的蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)自噬在心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、感染和免疫中發(fā)揮作用，可能是治療這些疾病的靶點(diǎn)。自噬對(duì)缺血性中風(fēng)有雙向作用，通過調(diào)節(jié)自噬可以減輕腦缺血損傷。選擇性自噬接頭蛋白p62 在氧化應(yīng)激下，通過與Keap 1 相互作用激活Nrf2，介導(dǎo)自噬。此外，Nrf2 與ARE 序列結(jié)合，增強(qiáng)p62 蛋白的表達(dá)，從而形成p62 和Nrf2 之間的正反饋回路[23]。PRASAD S等[24]在短暫性中動(dòng)脈閉塞（tMCAO）模型中發(fā)現(xiàn)，自噬受體蛋白p62 和Nrf2-EpRE 信號(hào)通路的保護(hù)作用抑制了大鼠腦缺血時(shí)的OS 損傷，并增強(qiáng)了Nrf2 活性，減少大鼠腦梗死體積，減輕缺血后神經(jīng)認(rèn)知功能障礙。通過使用Nrf2 激活劑可以提高神經(jīng)細(xì)胞活性，降低血腦屏障通透性，并激活細(xì)胞保護(hù)基因轉(zhuǎn)錄。

2.4 血管生成 血管生成是由已有的血管發(fā)展形成新的毛細(xì)血管，在缺血性卒中后的組織重塑過程中起著重要作用。微循環(huán)功能的重建能夠促進(jìn)腦卒中的恢復(fù)，加強(qiáng)血運(yùn)重建是卒中的治療前景之一[25]。氧化應(yīng)激通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)血管生成，在腦缺血性疾病中起著抑制修復(fù)性血管生成的作用。Nrf2/HO-1 參與血管生成的調(diào)控過程，HO-1 對(duì)血管原損傷具有保護(hù)作用，過表達(dá) HO-1 可激活 VEGF 生成。Nrf2 參與調(diào)控缺血區(qū)血管生成，保護(hù)內(nèi)皮表型，維持腦血管的功能完整性，并通過血管生成的重要調(diào)節(jié)因子，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）發(fā)揮作用[26]。任丹君[25]采用MCAO 模型，研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后血管新生內(nèi)皮細(xì)胞增加，大鼠腦梗死區(qū)域 VEGF、VEGFR2 表達(dá)升高，證實(shí)訶子組分可通過血管生成發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。劉文星[27]通過體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)TCE 可通過激活Nrf2/HO-1 上調(diào) CD31、VEGF 表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用，進(jìn)而促使血管新生，保護(hù)腦部功能。解燕昭[28]發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)性腦梗死后，應(yīng)用益母草堿可促進(jìn) Nrf2 核轉(zhuǎn)位，激活 Nrf2 信號(hào)通路及其下游HO-1 表達(dá)，增加促血管生長(zhǎng)因子VEGF 表達(dá)。而Nrf2-/-小鼠中的VEGF 表達(dá)未見增加，提示中藥有效成分通過激活Nrf2 及其下游HO-1，進(jìn)一步上調(diào)VEGF 表達(dá)促進(jìn)血管生成。

3 靶向Nrf2 治療腦缺血藥物進(jìn)展

3.1 人參皂苷 人參(Panax ginseng C.A.Meyer)是使用最廣泛的中草藥之一，屬于五加（Araliaceae）科Panax屬。藥理研究表明，從人參中提取的有效成分人參總皂苷，包括人參皂苷Rg1、Rb2、Re、Rd 等40 余種活性單體，具有抗炎、抗氧化和神經(jīng)元凋亡抑制等藥理活性，在神經(jīng)保護(hù)方面具有一定的研究前景。人參皂苷Rg1 在腦缺血損傷中發(fā)揮顯著神經(jīng)保護(hù)的主要機(jī)制與抗氧化和抑制細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。研究證實(shí)，人參皂苷Rg1可減輕OGD 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，通過下調(diào)細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2 水平，上調(diào)細(xì)胞核中的Nrf2 表達(dá)，提升HO-1 的mRNA 和蛋白水平及核轉(zhuǎn)移速度，從而在模型動(dòng)物和細(xì)胞中調(diào)控Nrf2/HO-1 與PPARγ/HO-1 表達(dá)水平[29]。人參預(yù)處理有助于改善神經(jīng)功能缺損，防止病灶體積急劇增大，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞，激活野生組小鼠Nrf2靶標(biāo)抗氧化蛋白[16]。人參皂苷治療組Nrf2、HO-1、SOD 較模型組增加，MDA 降低，提示人參通過Nrf2途徑激活腦缺血后的神經(jīng)保護(hù)作用[30]。

3.2 銀杏內(nèi)酯 銀杏內(nèi)酯為銀杏葉的內(nèi)酯類活性成分，張?chǎng)┑萚31]在研究中通過激活Nrf2/ HO-1 通路以驗(yàn)證其神經(jīng)保護(hù)功效，結(jié)果顯示在tMCAO 后7 d，對(duì)照組小鼠腦梗死體積下降，腦水腫和神經(jīng)功能缺損減輕，急性膠質(zhì)細(xì)胞活化抑制，Nrf2-/-組則相反，表明銀杏內(nèi)酯作用過程中的Nrf2 依賴性。銀杏內(nèi)酯A 還可作為免疫調(diào)節(jié)劑，有效減少中性粒細(xì)胞和T 細(xì)胞浸潤(rùn)，降低梗死區(qū)域中活化小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量[32]，并通過防止內(nèi)皮間連接破壞，控制腦含水量，穩(wěn)定血腦屏障（BBB）[31]。CLAUSEN B H 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯通過抗炎細(xì)胞因子IL-10 和IL-12p70 減輕急性腦損傷引起的腦水腫和神經(jīng)功能缺損，進(jìn)一步證實(shí)了MMF 的神經(jīng)保護(hù)作用。

3.3 丹參酮IIA 丹參酮IIA（TSA）是從中藥丹參中提取的脂溶性菲醌化合物。通過TSA 預(yù)處理激活Nrf2，可在MCAO 后的24 h 至1 個(gè)月內(nèi)減少皮質(zhì)損傷和感知運(yùn)動(dòng)障礙。研究表明，TSA 對(duì)Nrf2 的激活顯著降低了胞質(zhì)硫氧還蛋白互作蛋白、NLRP3 炎性小體及下游因子caspase-1、IL-1β、IL-18 的表達(dá)，發(fā)揮Nrf2介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用[17]。

3.4 川芎嗪 川芎嗪（TMP）是川芎的主要成分之一，用于治療中風(fēng)等心腦血管和神經(jīng)疾病。TMP 可清除腦組織損傷所增加的自由基，緩解病理改變，并通過腦部水腫的減輕，改善腦部神經(jīng)功能[34]。研究發(fā)現(xiàn)TMP通過激活Nrf2/HO1 通路減輕缺血后腦損傷，降低炎癥因子[35]和中性粒細(xì)胞[36]。川芎與冰片合用可減少鈣超載，減輕超微結(jié)構(gòu)變化、神經(jīng)元凋亡，并增加γ-氨基丁酸(GABA)及下丘腦甘氨酸（Gly）含量，在緩解神經(jīng)元興奮毒性損傷，鈣超載和超微結(jié)構(gòu)異常方面具有協(xié)同作用[37]。

3.5 姜黃素 姜黃素（Curcumin）是從姜科、天南星科根莖中提取的酚類色素，能夠透過血腦屏障將姜黃素的細(xì)胞保護(hù)作用擴(kuò)展至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，已被證明可減輕多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括神經(jīng)退行性疾病、腦缺血、腦出血和腦外傷[38]。其神經(jīng)保護(hù)作用的發(fā)揮與Nrf2、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活化相關(guān)。姜黃素已被證明可通過Akt/ Nrf2 通路減少tMCAO 大鼠的腦梗死體積，減輕神經(jīng)功能障礙并降低氧化應(yīng)激水平[39]。體外研究表明，姜黃素可減少小膠質(zhì)細(xì)胞遷移，從而觸發(fā)具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)特性的細(xì)胞表型[40]。

除上述中藥有效成分外，還有許多天然產(chǎn)物，合成化合物和臨床藥物，例如：銀杏、丹皮酚、異槲皮素、熊果酸、異鼠李素HP-1c、天麻素、雙環(huán)醇、重組人促紅細(xì)胞生成素和omega-3 脂肪酸等，通過Nrf2 減輕缺血性腦損傷。

4 小結(jié)

目前研究表明，Nrf2 在維持細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)中起著基本作用，Nrf2 的適度激活有利于減輕腦缺血后各項(xiàng)損傷，靶向Nrf2 可能成為預(yù)防和逆轉(zhuǎn)腦缺血的新型治療策略。仍需深入研究Nrf2 在腦缺血中的作用機(jī)制及激活途徑，為尋找中醫(yī)藥治療腦缺血潛在靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。