馮曉丹，毛 雪，王 英，董 秀*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥創(chuàng)新工程技術(shù)中心，沈陽 110847）

卵巢癌是一種具有復(fù)雜分子和基因變化的異質(zhì)性疾病，由于其缺乏有效預(yù)防措施、篩查工具及無癥狀發(fā)展的特點，使其多在癌癥晚期才得以確診，且極易在根治性手術(shù)和化療后復(fù)發(fā)，故在婦科惡性腫瘤中病死率極高[1]。順鉑（cisplatin，DDP）是第一代鉑類抗癌藥物，對于包括卵巢癌在內(nèi)的多種癌癥均有顯著的抗癌作用，臨床運用廣泛，但順鉑的內(nèi)源性和獲得性耐藥極易造成患者后期療效不佳，增加復(fù)發(fā)風(fēng)險，而對正常細(xì)胞過高的毒副作用，也限制了順鉑的臨床用藥，故順鉑與其他抗癌藥物聯(lián)合治療已成為許多癌癥的新治療策略[2]。去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）是蟲類中藥提取物斑蝥素的衍生物，是近年來抗癌藥物的新起之秀，其多靶點、增強免疫反應(yīng)[3]、逆轉(zhuǎn)耐藥[4]等優(yōu)勢，是與順鉑聯(lián)合用藥的較好選擇。本實驗將應(yīng)用流式細(xì)胞分析、熒光染色和Western blot 方法檢測去甲斑蝥素能否增強順鉑對卵巢癌SKOV3 細(xì)胞敏感性，為臨床用藥提供新的治療策略和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 人卵巢癌細(xì)胞株（SKOV3）購于中科院上海細(xì)胞庫去甲斑蝥素（N8784）；順鉑（貨號：P4394-25MG）（美國Sigma 公司）；胎牛血清（FBS）、PBS 磷酸鹽緩沖液、RPMI-1640 培養(yǎng)液（美國Hyclone 公司）；MTT（貨號：M8180），二甲基亞砜DMSO（貨號：D8372），SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（貨號：P1200），普通RIPA 裂解液（組織/細(xì)胞）（貨號：R0020），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號：PC0020）購于北京索萊寶科技有限公司；Annexin-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（KC0001）購于ImmunoWay Biotechnology；Mito-Tracker Green（線粒體綠色熒光探針）（貨號：C1048）購于中國碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)方法 將人卵巢癌細(xì)胞珠SKOV3 接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液的細(xì)胞瓶中，放入5% CO2、37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞形態(tài)、生長狀態(tài)和細(xì)胞數(shù)量，及時換液、傳代，適時進行凍存，保留實驗備用。

1.3 MTT 法檢測聯(lián)合用藥對SKOV3 細(xì)胞活性的影響 將細(xì)胞消化，制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后按2 000 個/孔，200 uL/孔接種于96 孔培養(yǎng)板內(nèi)。次日，按正常對照組、去甲斑蝥素30 μmol/L 組，順鉑10 μg/mL組、去甲斑蝥素30 μmol/L+順鉑10 μg/mL 組依次加藥，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，48 h，72 h。取出96孔培養(yǎng)板，避光下，每孔加入MTT 工作液25 uL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出孔中培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 uL，搖床上震蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm 測定其吸光度值。抑制率（%）=（A490對照-A490給藥）/（A490對照-A490空白）× 100%

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 將SKOV3 卵巢癌的單細(xì)胞懸液以5×105個細(xì)胞/孔的密度接種于6 孔細(xì)胞板中培養(yǎng)。次日，待細(xì)胞貼壁后按1.3 進行分組加藥，計時至指定時間，將原細(xì)胞培養(yǎng)液吸出保留，用特定胰蛋白酶（不含EDTA）消化，加入保留的原培養(yǎng)液吹打，用以制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心5 min，棄上清，加PBS重懸計數(shù)。離心，以400 μL Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，細(xì)胞密度為每毫升1×106個。加入5 μL 的Annexin V-FITC 結(jié)合液，4 ℃，避光，15 min。加入10 μL 的PI 染色液，4 ℃，避光，5 min。室溫下放搖床上震蕩避光孵育15 min，而后用流式細(xì)胞儀進行檢測。

1.5 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞線粒體形態(tài)變化和分布 取對數(shù)生長期的SKOV3 細(xì)胞，經(jīng)洗滌、消化后按照每孔400 μL 細(xì)胞懸液約8 000 個細(xì)胞接種48 孔板。次日，按1.3 加藥處理，每孔給藥400 μL。在藥物作用指定時間后吸出原培養(yǎng)液，加入提前37 ℃預(yù)溫培育的終濃度為200 nM 的Mito-Tracker Green 工作液，培養(yǎng)箱避光孵育40 min，去除Mito-Tracker Green 工作溶液，加入37 ℃預(yù)溫培育的新細(xì)胞培養(yǎng)液，在熒光顯微鏡下進行觀察、拍照、記錄。

1.6 免疫印跡法檢測蛋白表達 將細(xì)胞懸液以濃度5×105個細(xì)胞/皿接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。次日，按1.3 分組加藥，藥物作用指定時間后，在冰上經(jīng)PBS 淋洗、裂解液裂解后提取蛋白。用BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白變性后凍存待用。將變性的等量蛋白加入SDS-PAGE 凝膠孔中。用12% SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，分離完畢后以濕轉(zhuǎn)的方式將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。將膜放入5%的脫脂牛奶中，室溫封閉1 h，TBST 清洗2 次，加入一抗孵育，放置4 ℃冰箱中，孵育過夜。次日，用TBST洗膜4 次，每次10 min，添加二抗，室溫孵育1 h 。加入ECL 發(fā)光液后曝光，掃描記錄圖像。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。各組間數(shù)據(jù)比較應(yīng)用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 去甲斑蝥素聯(lián)合順鉑對卵巢癌細(xì)胞的生長抑制作用 分別加入去甲斑蝥素（30 μmol/L）、順鉑（10 μg/mL）和去甲斑蝥素（30 μmol/L）+順鉑（10 μg/mL）作用于卵巢癌細(xì)胞，分別于24、48、72 h 檢測藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。如圖1 所示，去甲斑蝥素和順鉑聯(lián)合用藥后，去甲斑蝥素可有效提高卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，在24 h 的生長抑制作用最為理想。

圖1 NCTD 聯(lián)合順鉑對卵巢癌細(xì)胞的生長抑制作用

2.2 去甲斑蝥素聯(lián)合順鉑對卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在早期凋亡中，去甲斑蝥素能明顯增強順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡作用。相較于去甲斑蝥素（30 μmol/L）、順鉑（10 μg/mL）單獨用藥組，去甲斑蝥素與順鉑聯(lián)合用藥組（30 μmol/L+10 μg/mL）的細(xì)胞凋亡率明顯升高。見圖2，圖3。

圖2 去甲斑蝥素聯(lián)合順鉑用藥的流式分析結(jié)果

圖3 去甲斑蝥素聯(lián)合順鉑用藥對細(xì)胞凋亡的影響（，n =3）

2.3 去甲斑蝥素聯(lián)合順鉑對卵巢癌細(xì)胞線粒體形態(tài)的改變 在用Mito-Tracker Green 特異性標(biāo)記去甲斑蝥素（30 μmol/L）、順鉑（10 μg/mL）和去甲斑蝥素+順鉑（30 μmol/L+10 μg/mL）用藥后卵巢癌細(xì)胞中的線粒體發(fā)現(xiàn)，與正常對照組細(xì)胞中線粒體形態(tài)相比，去甲斑蝥素（30 μmol/L）與順鉑（10 μg/mL）單獨用藥組出現(xiàn)少部分呈點塊狀形態(tài)的線粒體，而去甲斑蝥素與順鉑聯(lián)合用藥組細(xì)胞中點塊狀線粒體數(shù)量明顯增加，聚集分布于核周，具有顯著差異性，提示去甲斑蝥素促進了順鉑對卵巢癌細(xì)胞線粒體形態(tài)的改變，見圖4。

2.4 去甲斑蝥素與順鉑聯(lián)合用藥對卵巢癌細(xì)胞中procaspase-3 蛋白表達的影響 通過蛋白免疫印跡的方法檢測用藥后卵巢癌細(xì)胞中procaspase-3 蛋白表達，發(fā)現(xiàn)與正常對照組比較，在去甲斑蝥素（30 μmol/L）與順鉑（10 μg/mL）組中均出現(xiàn)不同程度的procaspase-3蛋白表達下降，而去甲斑蝥素與順鉑（30 μmol/L+10 μg/mL）聯(lián)合用藥組中procaspase-3 蛋白表達下降程度增加，見圖5。

圖4 去甲斑蝥素聯(lián)合順鉑對卵巢癌細(xì)胞線粒體形態(tài)的改變（線粒體熒光染色）

圖5 去甲斑蝥素聯(lián)合順鉑用藥對procaspse-3 表達的影響

3 討論

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進步，有了更好的手術(shù)技術(shù)和更多的化療方案，但臨床目前使用的對卵巢癌一線化療反應(yīng)良好的鉑類化合物和紫杉烷類藥物，仍會在大多數(shù)患者中出現(xiàn)復(fù)發(fā)和化療耐藥現(xiàn)象[5]。探索改善一線治療藥物療效和化療藥物后期療效的方法勢在必行。凋亡是指在多種基因調(diào)控下細(xì)胞主動死亡的過程[6-8]，在清除不穩(wěn)定基因或異常生長的細(xì)胞方面中起著至關(guān)重要的作用，是機體發(fā)育和維持體內(nèi)平衡的重要途徑。通常，癌癥的發(fā)生多與癌細(xì)胞避開凋亡這一程序性死亡途徑相關(guān)[9]，故抗癌藥物多是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、縮小瘤體實現(xiàn)抗癌的目的[10-12]。去甲斑蝥素是蟲類中藥斑蝥提取物斑蝥素的衍生物，對于多種癌細(xì)胞均有顯著的抑制作用。去甲斑蝥素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方式有多種，既可以觸發(fā)線粒體途徑誘導(dǎo)黑色素瘤[13]、人前列腺癌[14]和胃癌[15]細(xì)胞凋亡，又可以引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)人腎癌[16]細(xì)胞凋亡。實驗[17]證明去甲斑蝥素能通過抑制c-met 蛋白的表達逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞A549/DDP 細(xì)胞對順鉑耐藥，增強了肺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。

本課題組前期實驗旨在驗證去甲斑蝥素對卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的抑制作用，當(dāng)去甲斑蝥素作用于卵巢癌細(xì)胞后可使促凋亡蛋白 Bax 表達水平上升，抗凋亡蛋白 Bcl-2 表達水平下調(diào)以及procaspase-3 的表達降低，同時還可以通過介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生引起G2/M 期的調(diào)控因子p21 蛋白表達上調(diào)和cyclin B1 蛋白表達下調(diào)，調(diào)控細(xì)胞周期，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥素能有效促進順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞活性。這一結(jié)果與郭紀(jì)偉等[19]在去甲斑蝥素作用于肺癌細(xì)胞實驗中結(jié)果相同，即去甲斑蝥素增強了腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性。在用Mito-Tracker Green 線粒體綠色熒光探針染色實驗中，去甲斑蝥素和順鉑聯(lián)合用藥可明顯破壞細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)，可能與去甲斑蝥素作用于卵巢癌細(xì)胞后ROS 水平升高，Bax/ Bcl-2 比率上調(diào)誘發(fā)線粒體損傷相關(guān)。在既往的研究中顯示，高水平的ROS 可以引發(fā)線粒體損傷，介導(dǎo)線粒體凋亡途徑的，ROS 可引發(fā)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，進而引起線粒體跨膜電位降低，釋放細(xì)胞色素C，引發(fā)Caspase 的級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤凋亡[20]。Bax/Bcl-2 比率上調(diào)可以引發(fā)線粒體膜電位崩潰，釋放細(xì)胞色素C，活化Caspase 引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)[21-22]。故可從以上2 個方面，對去甲斑蝥素聯(lián)合順鉑用藥損傷卵巢癌細(xì)胞線粒體機制進行后續(xù)實驗補充證明。

Caspase 家族在細(xì)胞凋亡的起始和執(zhí)行中都發(fā)揮重要作用，其中就包含第一個被信號激活的啟動者Caspase（Caspase-2，-8，-9 和-10）和執(zhí)行凋亡任務(wù)的執(zhí)行者Caspase（Caspase-3，-6 和-7），許多傳統(tǒng)的癌癥療法都是通過間接激活這些Caspases 來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以清除癌細(xì)胞[23-24]。研究顯示在大多腫瘤細(xì)胞中，如淋巴瘤、白血病等，由于凋亡被抑制，凋亡的執(zhí)行者Caspase-3 的酶原procaspase-3，會在腫瘤中出現(xiàn)過表達的現(xiàn)象，通常Caspase-3是以procaspase-3的形式存在，只有在接受到凋亡信號時才會被活化為Caspase-3 執(zhí)行凋亡指令[25-26]。本實驗免疫印跡結(jié)果顯示與對照組相比，去甲斑蝥素、順鉑組均可減少細(xì)胞內(nèi)procaspase-3蛋白的表達，順鉑和去甲斑蝥素聯(lián)合用藥顯著降低了細(xì)胞內(nèi)procaspase-3 蛋白的表達，抑制了腫瘤的發(fā)生，提示聯(lián)合用藥后藥物可能依賴Caspase 途徑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，去甲斑蝥素在卵巢癌的體外實驗中，可促進順鉑對卵巢癌細(xì)胞的抑制作用，為臨床去甲斑蝥素輔助順鉑治療卵巢癌提供了新的理論依據(jù)和研究方向。