刁夏堯 郭超 李單青

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占所有肺癌病例的85%，NSCLC主要包括三種組織病理學類型：腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌[1,2]。盡管醫(yī)療技術的發(fā)展一定程度上改善了肺癌患者的預后，但NSCLC仍是全球癌癥死亡的主要原因之一[3]。淋巴轉移（lymphatic metastasis）是NSCLC常見的轉移途徑和獨立預后因素，NSCLC術后病理判定的淋巴轉移情況已被證明是決定患者長期預后的最重要因素之一，甚至出現淋巴微轉移也可預測患者預后不良[4-6]。在過去，淋巴管系統(tǒng)常被認為在腫瘤轉移中起被動的作用，但越來越多的研究顯示，淋巴管在其中發(fā)生了主動的改變以促進腫瘤轉移，這其中就包括淋巴管生成（lymphangiogenesis）的過程。淋巴管生成指由腫瘤內和腫瘤周圍原有的淋巴管進一步新生出更多淋巴管以促進了腫瘤淋巴轉移的過程，從而導致患者的預后不良[7]。淋巴管生成需要淋巴管內皮細胞（lymphatic endothelial cells, LECs）一系列生物學行為的相互協(xié)調，包括增殖、發(fā)芽、遷移和成管，這些事件與血管生成的過程相類似[8]。近年來，隨著對分子生物學研究技術的不斷進展，對腫瘤淋巴管生成的分子機制以及NSCLC的淋巴轉移機制研究也逐漸深入?，F將其目前的研究現狀作一綜述。

1 腫瘤相關淋巴管生成的分子機制

1.1 血管內皮生長因子家族（vascular endothelial growth factors, VEGFs） 在腫瘤轉移的過程中，腫瘤微環(huán)境中存在多種促淋巴管生成因子，促進LECs的增殖和形態(tài)改變。其中VEGF-C-VEGFR-3和VEGF-D-VEGFR-3軸被認為是腫瘤相關淋巴管生成的主要驅動因素[9]，其中又以VEGF-C促進LECs生長的效果最為顯著[10]。VEGF-C/D通過與LECs上的受體酪氨酸激酶VEGFR-3結合，激活蛋白激酶C依賴的細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）1或ERK2通路級聯(lián)以及蛋白激酶B（protein kinase B,PKB/AKT）的磷酸化，然后其下游通路會進一步介導LECs的生長及遷移[11,12]。VEGF-C/D對LECs的這一調控過程與VEGF-A通過結合VEGFR-2對血管生成進行分子調控的過程相似[13]。

除VEGF-C/D-VEGFR-3軸自身外，許多分子也可通過調控此通路在腫瘤相關淋巴管生成中發(fā)揮重要作用。例如，環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2, COX2）可以通過催化合成前列腺素以促進VEGF-C的生成，進而促進肺腺癌相關的淋巴管生成和淋巴轉移[14]。相似的是，前列腺素脫氫酶（prostaglandin dehydrogenase, PGDH）也可以通過調控前列腺素的合成以促進VEGF-D介導的淋巴管生成[15]。此外，膠原蛋白和鈣結合表皮生長因子結構域-1（collagen and calcium-binding EGF domain-1, CCBE-1）可以增強VEGF-C的蛋白水解以促進LECs的成管及遷移并促進腫瘤淋巴管生成[16]。VEGF-C/D除了可與VEGFR-3結合，神經纖毛蛋白-2（neuropilin-2, NRP-2）也可以作為VEGFR-3的共同受體或VEGF-C/D的獨立受體介導信號通路以誘導LECs生長、遷移、重建和淋巴管生成[17,18]。由此可見，許多淋巴管生成相關的分子及通路都是圍繞VEGF-C/D-VEGFR-3通路進行調控的。

另一方面，一些NSCLC的預后分析也同樣證明了VEGF家族在NSCLC中調控淋巴管生成及淋巴轉移的重要意義。首先，VEGF-C的表達量與NSCLC的淋巴管密度（lymphatic vessel density, LVD）、淋巴轉移和患者預后相關[19,20]。此外，一項研究指出白介素（interleukin, IL）-7/白介素7受體（IL-7 receptor, IL-7R）介導的VEGF-D上調與NSCLC的LVD和不良預后密切相關[21]。

1.2 其他促淋巴管生成因子 目前除了VEGF-C/D外，還發(fā)現了許多其他的促淋巴管生成因子，包括成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor, FGF）[22,23]、表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）[24]、血管生成素（angiopoietins, ANGPTs）[25]、腎上腺髓質素（adrenomedullin, AM）[26,27]、1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate, S1P）[28]和促紅細胞生成素（erythropoietin,EPO）[29]等。例如：FGF-2可與VEGF-C發(fā)揮協(xié)同作用，通過與FGFR-1結合作用于LECs，從而促進淋巴管生成。然而，這種效應僅出現在VEGFR-3激活的LECs[23]，有研究[30]顯示FGF-2與VEGFR-3在NSCLC中共表達預示患者預后不良。相似的是，EGF與黑色素瘤中的VEGF-C和同源盒基因轉錄因子1（prospero homeobox protein 1, Prox-1）表達相關，腫瘤來源的EGF與VEGF-C協(xié)同作用以促進LECs的生長[24]。Holopainen等[25]通過對NSCLC荷瘤小鼠的動物實驗發(fā)現ANGPT2阻斷抗體可以減少淋巴結和肺轉移，并抑制腫瘤相關淋巴管生成。此外，AM可直接激活ERK下游信號通路以促進LECs生長[27]。Nagahashi等[28]證實了鞘氨醇激酶1的產物S1P介導了腫瘤相關的淋巴管生成，而且這一過程不依賴于VEGF-A或VEGF-C。Lee等[29]的研究表明EPO既可以通過ERK1/2-和PI3K-依賴通路直接誘導LECs的增殖、遷移和成管，也可以通過促進巨噬細胞產生VEGF-C以促進淋巴轉移。由此可見，一些分子可以不依賴于VEGF-C/D的信號通路，直接發(fā)揮促進淋巴管生成及淋巴轉移的作用。而且許多促淋巴管生成因子的作用及調控機制還未在NSCLC中進行驗證，仍需要進一步研究去探索及證實。

1.3 淋巴管生成抑制因子 目前已經確定了許多促淋巴管生成因子，但其實也存在一些淋巴管生成抑制因子。例如，轉化生長因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）在LECs中轉導信號并抑制它們的增殖、遷移和成管，并且還可以抑制LECs的標志物［淋巴管內皮細胞透明質酸受體1（lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor 1, LYVE-1）和Prox-1］的表達[31]。此外，骨形態(tài)發(fā)生蛋白9（bone morphogenetic protein 9, BMP-9）屬于TGF-β超家族，可以作用于其受體的激活素受體樣激酶1（activin receptorlike kinase, ALK-1）從而下調Prox-1和細胞周期蛋白的表達，進而抑制LECs的增殖，并且導致了LECs向血管內皮細胞的去分化作用[32]。因此，促淋巴管生成因子和淋巴管生成抑制因子可能共同決定了LECs的生物學行為。當兩者之間的作用出現失衡時，可能會使機體出現病理狀態(tài)[33]。

2 腫瘤微環(huán)境與LECs的相互作用

2.1 腫瘤細胞與LECs的相互作用 腫瘤細胞本質是追求持續(xù)地增殖，因此生長的壓力迫使其在腫瘤微環(huán)境中不斷尋求有利于自身生存和生長的條件，其中就包括LECs[34]。多項研究證實，腫瘤細胞不僅是淋巴管生成的關鍵促進因子VEGF-C/D的重要來源[35,36]，也高表達多種其他的促淋巴管生成因子，例如ANGPT2、FGF-2和血小板衍生生長因子BB（platelet-derived growth factor-BB, PDGF-BB）[23,25,37]。其中，PDGF-BB也被證實是一種介導淋巴管生成的因子[37]，并且PDGF-BB和VEGF-C共表達與NSCLC的淋巴管生成和患者預后不良相關[38]。有許多研究揭示了趨化因子與趨化因子受體在腫瘤相關淋巴管生成中的作用，尤其是在腫瘤誘導LECs遷移中的作用。例如：腫瘤細胞來源的CC趨化因子配體（CC-chemokine ligand, CCL）27/28可以與CC趨化因子受體（CC-chemokine receptor, CCR）10結合，從而促進LECs的募集[39]。腫瘤細胞可以產生各種因子作用于相應的LECs受體，進而誘導LECs的增殖、遷移以及成管。相反的，一些研究發(fā)現LECs也可以向腫瘤細胞發(fā)出遷移信號。Shields等[40]發(fā)現LECs來源的CCL21可以與腫瘤細胞表達的CCR7相結合，從而促進腫瘤細胞遷移。相似的是，當淋巴結的LECs受到局部的炎癥因子刺激，可產生CCL1與CCR8相結合，使腫瘤細胞向淋巴結遷移[41]。

2.2 腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）與LECs的相互作用 CAFs已被證實是腫瘤微環(huán)境的基質細胞中的關鍵細胞，這是因為它們在大多數實體腫瘤中含量豐富，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移[42]。研究[43-45]表明，CAFs可以分泌大量VEGF-C以及其他的淋巴管生成因子，如HGF和PDGF，以誘導腫瘤相關的LECs增殖。Wang等[46]發(fā)現賴氨酰氧化酶樣蛋白2（lysyl oxidase-like protein 2, LOXL2）可以刺激CAFs分泌大量促淋巴管生成因子VEGF-C和基質細胞衍生因子1α（stromal cell-derived factor 1α, SDF-1α），以促進淋巴管生成及腫瘤淋巴轉移。與腫瘤細胞和LECs間相互作用相似，LECs也可以反過來作用于CAFs。Thomson等[47]證實了表達非典型趨化因子受體4（atypical chemokine receptors 4, ACKR4）的CAFs可以被LECs來源的CCL21所調控，并且通過免疫熒光染色發(fā)現這種CAFs在空間上也與淋巴管相鄰，為兩者間相互作用提供了空間上的可能性。

2.3 腫瘤相關免疫細胞與LECs的相互作用 在腫瘤的發(fā)展過程中，腫瘤相關免疫細胞可影響腫瘤微環(huán)境，調控腫瘤的生存、增殖和轉移等生物學行為，其中包括巨噬細胞、T細胞、樹突狀細胞（dendritic cells, DCs）等[48]。巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中含量最豐富的免疫細胞[49]，可以通過分泌脂質運載蛋白2（lipocalin 2, LCN2）激活VEGF-C-VEGFR-3通路來促進淋巴管生成。同時，Watari等[50]研究發(fā)現NSCLC的腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages,TAMs）在受到IL-1β的刺激后，可以大量分泌VEGF-C/D以啟動和維持淋巴管生成。另外，調節(jié)性T細胞（regulatory T cells, Tregs）可通過淋巴毒素（lymphotoxins, LTs）作用于LECs上的LTβ受體，從而誘導其產生趨化分子并促進LECs的跨內皮遷移[51]。相反的，LECs也可以作用于免疫細胞，調控其增殖、遷移等。例如淋巴結內LECs可表達一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2, NOS2）以促進產生一氧化氮，抑制T細胞的增殖[52]。Moran等[53]的研究發(fā)現，LECs產生的生長因子和趨化因子是產生被膜下淋巴竇巨噬細胞的必要因素。此外，腫瘤相關LECs還可分泌CCL21與DCs表面表達的受體CCR7相結合，促進其進入淋巴系統(tǒng)，進而向淋巴結內的T細胞呈遞抗原[54]。

2.4 腫瘤細胞外基質（extracellular matrix, ECM）對LECs的作用 腫瘤ECM是指在腫瘤微環(huán)境中為不同類型細胞提供生存環(huán)境并參與其生物學活動的非細胞成分[55]。ECM對腫瘤相關LECs也同樣有支持作用和促進淋巴管生成的作用。一方面，ECM蛋白可以為LECs提供必要的結構支持，如膠原蛋白和纖維粘連蛋白等[56,57]。此外，LECs表達的整聯(lián)蛋白（integrins）可促進細胞與ECM的纖維粘連蛋白相粘附，這是LECs錨定的必要條件，同時還會使LECs的VEGFR-3磷酸化以促進淋巴管生成[58,59]。另一方面，通過基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）可以使ECM發(fā)生重塑，形成更疏松的環(huán)境進而促進淋巴管生成。例如，MMP-2作為一種膠原酶，可以驅動LECs在膠原基質中遷移[60]。此外，ECM能夠產生透明質酸（hyaluronic acid,HA），然后與LECs的標志物LYVE-1相結合，促進其增殖和遷移并顯著促進腫瘤內淋巴管生成[61]。

3 腫瘤相關淋巴管生成的調控機制研究進展

上述大量關于淋巴管生成的機制研究為腫瘤包括NSCLC提供了許多潛在的診斷標志物及治療靶點。但是目前關于淋巴管生成的細胞內機制的研究仍舊比較缺乏。近年來，隨著對非編碼RNA的研究逐漸深入，這一類原先被認為是無調控功能的副產物引起了廣大研究人員的重視，越來越多腫瘤相關淋巴管生成的分子機制得到了進一步闡明。

微小RNA（microRNA, miRNA）作為一種小非編碼RNA，因其對基因表達的轉錄后調控而受到關注，miRNA可直接靶向mRNA以調控轉錄或破壞其穩(wěn)定性來發(fā)揮作用。Hu等[62]發(fā)現miR-128的表達水平在NSCLC中呈低表達，并且還證實miR-128直接與VEGF-C的mRNA 3’-UTR結合以抑制VEGF-C表達。此外，在NSCLC細胞中過表達miR-128可以觀察到VEGFR-3的表達下調。該項研究最終闡明miR-128在NSCLC中可以靶向VEGF-C-VEGFR-3通路以抑制淋巴管生成。miRNA還可以在其他多種腫瘤中調控淋巴管生成，例如miR-655和miR-526b在乳腺癌中對淋巴管生成呈促進作用[63]，miR-548k也通過VEGF-C-VEGFR-3通路在食管鱗癌中發(fā)揮正向調控[64]，而miR-27b對胃癌中的淋巴管生成卻是呈抑制作用[65]。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）是一類長度約200個核苷酸的非編碼RNA。與miRNA不同，lncRNA可與RNA、DNA、蛋白質等分子相互作用，從而調控mRNA轉錄、基因表達和蛋白質功能等[66]。目前關于lncRNA調控淋巴管生成的研究主要集中于其他腫瘤，針對NSCLC的研究還比較缺乏。例如：Sun等[67]研究發(fā)現高表達lncRNA ANRIL的結直腸癌患者會出現VEGF-C、VEGFR-3和LYVE-1的高表達。進一步的研究表明，抑制ANRIL表達顯著降低了LECs的侵襲、遷移和成管。綜上所述，ANRIL可能作為結直腸癌淋巴管生成的驅動因素。除此之外，lncRNA BLACAT2也被證實可以通過與WDR5蛋白直接結合以調控VEGF-C，從而促進膀胱癌淋巴管生成[68]。

環(huán)狀RNA（circular RNA, circRNA）代表一類新型非編碼RNA，其具有共價環(huán)狀結構，源自前體mRNA的非規(guī)范剪接，與線性對應序列的核酸相比其結構更加穩(wěn)定[69]。circRNA通常定位于細胞質，這類circRNA大部分起miRNA海綿（miRNA sponges）的作用[70]。與lncRNA情況類似，目前尚缺乏circRNA在NSCLC的淋巴管生成方面的研究，但在膀胱癌及胰腺癌中已有相關報道。首先，Zhu等[71]報道了在膀胱癌中circEHBP1通過海綿吸附miR-130a-3p，以抑制該miRNA對TGFβR1的表達下調作用，而TGFβR1可使SMAD3發(fā)生磷酸化，因此circEHBP1可以間接增強SMAD3的磷酸化，進而促進VEGF-D依賴的淋巴管生成作用。此外，Kong等[72]也證實了circNFIB1也可通過吸附miR-486-5p以抑制其對PIK3R1的轉錄后調控，最終導致胰腺癌中VEGF-C依賴的淋巴管生成及淋巴轉移受抑。

4 總結與展望

淋巴轉移是NSCLC的主要轉移途徑之一，也是預測患者預后不良的重要因素，是否發(fā)生淋巴轉移是對NSCLC患者進行臨床分期以及進一步制定治療策略的重要依據。淋巴管生成在促進腫瘤淋巴轉移的過程中起至關重要的作用。因此無論是過去對于腫瘤細胞與LECs之間信號通路的揭示，還是近年來對于腫瘤微環(huán)境與LECs間相互作用的探索，甚至是目前細胞內非編碼RNA對淋巴管生成的相關調控研究，都對于發(fā)現新的腫瘤標志物和治療靶點有重要意義。然而目前相關研究主要集中于乳腺癌、黑色素瘤以及膀胱癌等癌種，針對NSCLC的研究相對缺乏，尤其是非編碼RNA方向的研究。因此，需要不斷深入對于NSCLC相關淋巴管生成的分子機制研究，以期抗淋巴管生成的靶向治療會成為NSCLC治療的新方向。