竇世華 謝鴻生 楊林

根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer, IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥數(shù)據(jù)，肺癌估計有220萬新發(fā)和180萬死亡病例[1]。其中，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌總數(shù)的85%[2]。對于早期術(shù)后患者，推薦臨床訪視和X線計算機(jī)斷層掃描（computed tomography, CT）作為腫瘤監(jiān)測的主要手段。雖然CT掃描可以檢測到術(shù)后患者的疾病進(jìn)展早于X線，但兩組患者的總體生存率沒有統(tǒng)計學(xué)差異[3]，表明傳統(tǒng)的放射學(xué)方法在術(shù)后隨訪中可能已經(jīng)達(dá)到極限。如何識別根治性手術(shù)后的分子殘留病灶（molecular residual disease, MRD）、預(yù)測疾病復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移和指導(dǎo)術(shù)后治療，這仍然是一系列亟需解決的問題。本文將綜述循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）與MRD的關(guān)系、ctDNA的檢測方法、ctDNA的應(yīng)用，以及通過MRD的檢測結(jié)果指導(dǎo)術(shù)后輔助治療可產(chǎn)生顯著的臨床相關(guān)性。

1 ctDNA與MRD的關(guān)系

ctDNA是血液中腫瘤衍生的片段化DNA，ctDNA直接來自腫瘤或循環(huán)腫瘤細(xì)胞，主要由單鏈或雙鏈DNA以及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成，存在于血漿或血清中[4]。ctDNA中常包含突變、缺失、插入、重排、拷貝數(shù)異常以及甲基化等相關(guān)基因突變信息[5]。目前以ctDNA作為MRD的指標(biāo)最常見[6]，對晚期肺癌的研究[7-12]表明，ctDNA分析在腫瘤基因突變譜檢測、疾病進(jìn)展監(jiān)測、評判腫瘤負(fù)荷和預(yù)測藥物療效等方面具有重要的臨床價值。在腸癌、乳腺癌、肌層浸潤性尿路上皮癌及肺癌等術(shù)后患者中，基于術(shù)后血漿ctDNA發(fā)現(xiàn)MRD，相較與影像學(xué)顯示出對腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移預(yù)測的明顯優(yōu)勢[13-17]。在2021年第18屆中國肺癌高峰論壇上對肺癌MRD達(dá)成了專家共識：肺癌MRD指的是經(jīng)過治療后，傳統(tǒng)影像學(xué)（包括正電子發(fā)射體層顯像/CT（positron emission tomography/CT, PET/CT）或?qū)嶒炇曳椒ú荒馨l(fā)現(xiàn)，但通過液體活檢發(fā)現(xiàn)的腫瘤來源分子異常，代表著肺癌的持續(xù)存在和臨床進(jìn)展可能。肺癌分子殘留病灶：指的是在外周血可穩(wěn)定檢測出豐度≥0.02%的ctDNA，包括肺癌驅(qū)動基因或其他的I類/II類基因變異[18]。經(jīng)過治療后仍能測出豐度≥0.02%的ctDNA，表明存在MRD。

2 ctDNA MRD常用的檢測方法

DNA測序技術(shù)的進(jìn)步和我們對腫瘤分子生物學(xué)的理解，通過檢測術(shù)后MRD識別疾病復(fù)發(fā)的高風(fēng)險患者，并在輔助治療環(huán)境下調(diào)整臨床方案，以優(yōu)化風(fēng)險分層，這一目標(biāo)是可以用現(xiàn)有技術(shù)實現(xiàn)的[19]。

基因測序的主要策略為檢測腫瘤特異性突變或預(yù)定義的基因組區(qū)域（靶向ctDNA策略）。此類型分析基于非常靈敏的技術(shù)使用，一類是PCR的分析，如二代的實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）、突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)（amplification refractory mutation system, ARMS）和三代的微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR, DdPCR）；PCR技術(shù)在ctDNA檢測中從二代到三代的迭代完成了特異性和靈敏性提升（靈敏度從0.1%到0.001%[20-22]），但因不能全面檢測驅(qū)動變異之外的突變，這限制了它在多重檢測中的應(yīng)用。另一類是基于二代測序（next generation sequencing, NGS）的方法，NGS檢測ctDNA技術(shù)路線有兩大方向，一個是基于tumor-na?ve的路線，代表研究有Lung-CLiP研究[23]，研究者采用腫瘤個體化分析深度測序法（cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPP-Seq），其平均測序深度達(dá)23,570×，將檢出的分子突變信息結(jié)合基因組捕獲區(qū)域的基因拷貝數(shù)變異（copy number variations, CNV）等信息，納入評估模型。但在整體98%特異性下，I期、II期、III期NSCLC敏感性僅為41%、54%、67%；另一個是基于tumor-informed的路線，代表方法為個體化定制監(jiān)控方案（personalized cancer monitoring, PCM），Zviran等[24]以原發(fā)腫瘤突變譜為基礎(chǔ)，利用全基因組測序（whole genome sequencing, WGS）對整個基因組進(jìn)行檢測（MRDetect技術(shù)），通過觀測整個基因組尋找腫瘤組織已經(jīng)存在的突變，應(yīng)用極大的廣篩ctDNA測序代替加深深度測序來提高敏感性?；诖?，Signatare首先使用全外顯子測序（whole exome sequencing, WES）的方法，篩選出腫瘤組織攜帶的變異，然后針對這些突變定制患者專屬的基于擴(kuò)增的NGS panel，通過超高深度100,000×的深度測序，最大化地對每個患者特有的腫瘤變異進(jìn)行個體化跟蹤。另一家公司ArcherDX在這個基礎(chǔ)上，在單點測序上增加了單分子標(biāo)簽技術(shù)（unique molecular identifiers, UMI），又進(jìn)一步提升了單點檢測的敏感性。Signatare和ArcherDX這兩種方法均可以歸納為PCM。PCM在特異性監(jiān)控的同時，能達(dá)到對0.01%到0.1%級別的變異豐度較好的覆蓋，基本實現(xiàn)早期腫瘤患者ctDNA變異的覆蓋。但這一方法學(xué)仍有一定的局限性，由于腫瘤的克隆進(jìn)化及二次原發(fā)腫瘤的存在，患者新原發(fā)病灶的跟蹤、監(jiān)測以及新克隆的出現(xiàn)，對于基于tumor-informed的PCM來說是無法覆蓋的。例如在TRACERx研究[16]中，I期采用Signatera，II期采用ArcherDX，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中大約12%的患者復(fù)發(fā)腫瘤病灶從分子上定義是一個新原發(fā)的腫瘤，而對于這種新原發(fā)病灶來說PCM的方法無法做到覆蓋和監(jiān)控。而MRD的檢測維度也是不斷豐富，除了基于ctDNA變異的單一監(jiān)控維度，ctDNA甲基化也成為MRD研究中重要的角色。

3 基于ctDNA的MRD檢測陽性預(yù)示NSCLC術(shù)后較差的無復(fù)發(fā)生存期（relapse-free survival, RFS）與復(fù)發(fā)

在非轉(zhuǎn)移性肺癌患者中，部分患者可以通過初次手術(shù)切除、放射治療和包括化療在內(nèi)的綜合治療方法治愈[25,26]。在一線治療之后影像學(xué)只能監(jiān)測到宏觀疾病復(fù)發(fā)，但是由于治療后腫瘤組織的壞死等因素，影像學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)或進(jìn)展病灶時，患者的全身腫瘤負(fù)荷已明顯升高。因此，NSCLC根治術(shù)后MRD檢測是否能識別有復(fù)發(fā)風(fēng)險的患者，并且可以在腫瘤負(fù)荷最低的情況下進(jìn)行個性化輔助治療是一個值得深入研究的課題[17,27]。

Peng等[27]研究表明，未檢測到ctDNA（ctDNA轉(zhuǎn)為陰性）患者的RFS和總生存期（overall survival, OS）明顯好于術(shù)后可檢測到ctDNA（ctDNA仍為陽性）的患者（P<0.05）。當(dāng)與美國癌癥分期聯(lián)合委員會（American joint Committee on cancer, AJCC）分期一起使用時，ctDNA提供了一個相對精確的風(fēng)險分層。Ohara等[28]用CAPP-seq檢測ctDNA，術(shù)后ctDNA陽性提示更短的RFS（P=0.015）。Chen等[29]發(fā)現(xiàn)術(shù)后3 d檢測ctDNA與無病生存期（disease-free survival, DFS）密切相關(guān)（P=0.018），基于以上，我們將有可能在術(shù)后動態(tài)監(jiān)控MRD，并且這一指標(biāo)具有預(yù)測肺癌復(fù)發(fā)的可能性。Chaudhuri等[17]的研究中，與治療結(jié)束后未檢測到ctDNA的患者相比，在治療后任一時間點均可檢測到ctDNA的患者的生存率顯著降低（P<0.001）（表1）。綜上所述，通過MRD檢測可以更早識別有復(fù)發(fā)風(fēng)險的患者，是NSCLC根治術(shù)后的一個實用預(yù)后因素。

表1 ctDNA 在早期NSCLC術(shù)后的應(yīng)用Tab 1 Application of ctDNA after early NSCLC surgery

術(shù)后ctDNA檢測比影像學(xué)檢查更早提示疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)，Xia等[8]表示甲基化水平和最大等位基因頻率（maximum allelic fraction, maxAF）的降低反映了治療效果，而逐漸升高反映了即將到來的疾病進(jìn)展（progressive disease, PD）。在使用放射成像評估PD之前，分別有6例和5例患者平均提前3.0個月和1.9個月觀察到甲基化水平和maxAF升高。Peng等研究[27]表明19例（63.3%）患者術(shù)后ctDNA先于影像學(xué)表現(xiàn)或臨床癥狀出現(xiàn)，平均時間為12.6個月。而用ctDNA檢測腫瘤復(fù)發(fā)的中位時間比CT檢測提前165 d[29]，Chaudhuri等[17]根據(jù)實體腫瘤的療效評價標(biāo)準(zhǔn)1.1版（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Version 1.1, RECIST 1.1）標(biāo)準(zhǔn)也證實了其研究中72%的患者（共19例）的ctDNA檢測先于CT進(jìn)展，中位時間為5.2個月。綜上所述，術(shù)后ctDNA檢測比影像學(xué)檢測更靈敏，能更早提示疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)，有助于患者腫瘤負(fù)荷處于較低狀態(tài)下進(jìn)行輔助診斷，從而可能指導(dǎo)后續(xù)治療起到提高患者預(yù)后水平的作用。但確切的提前時間還需進(jìn)行前瞻性的研究或大量的回顧性研究來證實。

4 ctDNA MRD的檢測指導(dǎo)早期NSCLC術(shù)后輔助治療

據(jù)統(tǒng)計，接受手術(shù)的NSCLC患者的5年OS從Ia1期的92%到IIIb期的26%[30]。所以即使是在早期疾病，也產(chǎn)生了臨床上對輔助治療的需求，以根除MRD。從2021年中國臨床腫瘤學(xué)會（Chinese Society Of Clinical Oncology,CSCO）[31]和2021年美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）第1版[32]發(fā)布的《非小細(xì)胞肺癌診療指南》對比，可以看出針對早期NSCLC行根治性手術(shù)后輔助治療方法的不同。

在CSCO指南中，Ib期NSCLC（包括有高危因素的）因為缺乏高級別證據(jù)支持，一般不推薦輔助化療，IIa期患者根治術(shù)后可考慮含鉑雙藥方案輔助化療（2B類證據(jù)）。而NCCN指南中表示Ib期-IIa期NSCLC根治術(shù)后建議觀察或高危人群進(jìn)行化療，IIb期-IIIa期行化療，對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）突變陽性的Ib期-IIIa期患者根治術(shù)后無論是否接受輔助化療，均可以使用奧希替尼靶向輔助治療。高危因素包括：①低分化腫瘤[包括肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（不包括分化良好的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤）]；②血管侵犯；③楔形切除；④腫瘤>4 cm；⑤內(nèi)臟胸膜受累和淋巴結(jié)狀態(tài)不明（Nx）。

綜上兩份指南存在的分歧，而在早期NSCLC根治術(shù)后的輔助治療中，MRD的檢測結(jié)果指導(dǎo)術(shù)后輔助治療可產(chǎn)生顯著的臨床相關(guān)性。Chaudhuri等[17]用CAPP-seq檢測ctDNA，在MRD出現(xiàn)36個月后，可檢測到ctDNA的患者100%疾病進(jìn)展，而未檢測到ctDNA的患者93%（HR=43.4,P<0.001）疾病無進(jìn)展，MRD未檢出ctDNA的患者遠(yuǎn)期生存率明顯高于檢測到ctDNA的患者（P<0.001）。Chen等[29]發(fā)現(xiàn)術(shù)后3 d檢測ctDNA陽性的患者，接受輔助治療的RFS為269 d，未接受輔助治療的RFS為111 d（P=0.018），ctDNA的變化與治療療效相關(guān)，且術(shù)后3 d檢測ctDNA與DFS相關(guān)。在Kuang[33]對于術(shù)后ctDNA陽性的患者研究中，與化療后ctDNA清零患者相比，化療后ctDNA陽性患者的RFS較差（HR=8.68, P=0.022）。對于術(shù)后ctDNA陰性的患者，化療后ctDNA陰性與化療后ctDNA陽性患者相比有更好的遠(yuǎn)期療效（HR=4.76, P=0.047）。該研究表明，化療后ctDNA狀態(tài)與RFS密切相關(guān)，有可能指導(dǎo)術(shù)后強(qiáng)化治療。

綜上所述，治療后ctDNA可以由陽性轉(zhuǎn)陰性，意味著手術(shù)或輔助治療方案可以清除MRD，從而改變其疾病進(jìn)展和生存。而ctDNA繼續(xù)呈陽性或者是由陰轉(zhuǎn)陽，可能預(yù)示著存在MRD，這可能是一個提示改變治療方案的信號（表1）。

5 總結(jié)

目前以ctDNA作為MRD的指標(biāo)最常見，基于ctDNA提示MRD的研究在腸癌、乳腺癌、肌層浸潤性尿路上皮癌及肺癌等術(shù)后患者的隊列中，都顯示出對腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移預(yù)測的明顯優(yōu)勢?，F(xiàn)各類方法學(xué)在MRD場景孰優(yōu)孰劣還值得進(jìn)一步細(xì)分和探索，而NSCLC本身的分子克隆行為并不均一，從可能影響MRD監(jiān)控效能的腫瘤基因變異數(shù)量考慮，驅(qū)動變異與非驅(qū)動變異的腫瘤，腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden, TMB）有極大的差異。一般來說，攜帶驅(qū)動變異的患者整體腫瘤基因變異遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于并不攜帶驅(qū)動變異的患者，對于這兩類人群我們應(yīng)該如何去選擇合適的MRD檢測技術(shù)需進(jìn)一步論證。MRD檢測能夠方便、精準(zhǔn)、高效是支持它在臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)，而且ctDNA能比NSCLC治療后的影像監(jiān)測更早的預(yù)示著疾病的復(fù)發(fā)，給及時調(diào)整治療方案提供了寶貴的時間。在早期NSCLC根治術(shù)后輔助治療研究中，對合適的治療方式存疑，而MRD可以作為一個理想的預(yù)測因素，對早期NSCLC根治術(shù)后患者進(jìn)行精準(zhǔn)的指導(dǎo)，從而提高患者的存活率和為改善預(yù)后作出貢獻(xiàn)。此結(jié)論仍需大型前瞻性、隨機(jī)對照臨床研究對此進(jìn)行深一步論證。