金愈茗 陳子軒 陳權(quán) 沙雷皓 沈誠

1 背景

肺癌是目前全球死亡率最高的癌癥[1]。當(dāng)前大部分肺癌患者在診斷時已經(jīng)處于晚期，晚期肺癌患者5年生存率不足15%，而Ia期肺癌患者的5年生存率可以超過80%[2,3]。因此，如何盡早發(fā)現(xiàn)并診斷肺癌成為提高患者生存率的關(guān)鍵。

隨著診斷技術(shù)的發(fā)展，早期肺癌篩查在過去的幾十年內(nèi)有了一定的發(fā)展與進(jìn)步，胸部X射線、計算機(jī)斷層掃描（computed tomography, CT）、低劑量螺旋CT（low-dose spiral CT, LDCT）、正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography, PET）等技術(shù)的發(fā)展使得肺癌患者的生存率逐漸提高，但肺癌確診的金標(biāo)準(zhǔn)仍為明確的病理結(jié)果，有創(chuàng)操作的風(fēng)險依舊不能避免[4,5]。細(xì)胞學(xué)檢查能夠為以上技術(shù)提供輔助診斷，但由于樣本的獲取及檢測的局限，痰液細(xì)胞學(xué)的檢測效力未能達(dá)到理想的效果[6,7]。因此臨床上迫切需要一種安全性更高、準(zhǔn)確性更高的肺癌診斷方法。

隨著對肺癌的分子機(jī)制研究的深入，基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，更多生物分子被證實參與腫瘤進(jìn)程，促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展。二代測序及深度檢測技術(shù)的出現(xiàn)，大幅度提升了基因檢測的敏感性和特異度[8]，而通過數(shù)據(jù)分析使得準(zhǔn)確測定組織中腫瘤基因的拷貝數(shù)成為可能[9]。液體活檢中基因相關(guān)樣本檢測的潛力凸顯。利用患者的血液、胸腔積液、唾液、痰液等樣本中提取的脫氧核糖核酸（deoxyribo nucleic acid, DNA）片段、微小RNA（microRNA, miRNA）、信使RNA（message RNA, mRNA）、蛋白質(zhì)等能夠獲取腫瘤組織的遺傳信息，該方法無創(chuàng)、易于獲取、可重復(fù)多次提取，具有很強(qiáng)的應(yīng)用前景[10,11]。血液樣本雖然易于提取，但其中相關(guān)基因產(chǎn)物含量低，且容易受機(jī)體其他代謝過程影響[12]；胸腔積液不易受其他過程影響，產(chǎn)物含量較高，但采集操作是有創(chuàng)性的[13,14]。而痰液中產(chǎn)物含量較適宜，且無創(chuàng)不易受其他過程影響，含有多種生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、DNA、miRNA、mRNA，是理想的液體活檢樣本。本文回顧了痰液中生物分子標(biāo)記物在肺癌中的相關(guān)機(jī)制和應(yīng)用價值。

2 痰液中的DNA

正常細(xì)胞在發(fā)生壞死和凋亡過程中可能會將部分DNA釋放到內(nèi)環(huán)境中，而腫瘤細(xì)胞釋放的DNA片段帶有腫瘤特有的遺傳特征，對腫瘤的診斷具有重要價值。對含有腫瘤DNA的痰液進(jìn)行檢測，具有經(jīng)濟(jì)、安全、無創(chuàng)的特點，同時，腫瘤細(xì)胞遺傳物質(zhì)的改變通常發(fā)生于產(chǎn)生臨床癥狀之前，對遺傳物質(zhì)的檢測具有一定的前瞻預(yù)防性，而且，可多次反復(fù)取樣還可以連續(xù)動態(tài)監(jiān)測腫瘤基因，從而提示腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[7,10,15,16]。腫瘤細(xì)胞遺傳物質(zhì)DNA的改變是復(fù)雜且精密的，與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，當(dāng)前用于肺腫瘤細(xì)胞診斷的DNA遺傳特征改變主要包括DNA的突變（DNA mutation）和異常甲基化（aberrant DNA methylation）。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）是檢測DNA變異的常用技術(shù)，該技術(shù)簡單易行、經(jīng)濟(jì)快速、敏感性較高[17]。DNA異常甲基化被認(rèn)為是一種腫瘤細(xì)胞調(diào)控的機(jī)制，甲基化特異性PCR（methylationspecific PCR, MSP）是檢測DNA甲基化的常用方法。

Keohavong等[18,19]的工作證明了KRAS突變及p53突變可能適用于對肺癌高危人群中的痰液篩檢，但當(dāng)前對KRAS和p53基因檢出時間和肺癌進(jìn)展間關(guān)系的研究仍待完善。多項研究[20-22]顯示，p16、PAX5α、GATA5、SULF2等基因的異常甲基化在肺癌早期篩查中的特異性超過70%。Hulbert等[16]的病例對照研究同樣發(fā)現(xiàn)了HOXA7、SOX17等基因的異常甲基化檢測的特異性超過80%。但這些基因用于篩查的敏感度不高，均低于70%。由于肺癌的發(fā)生涉及到復(fù)雜的遺傳信息調(diào)控過程，當(dāng)前的研究嘗試將多種基因同時檢測，以期提高敏感性，研究顯示，同時對多個基因甲基化檢測可以提高肺癌篩查和早期診斷的敏感性[23,24]，可以將敏感性提高到98%，而機(jī)器學(xué)習(xí)的方法也可以通過多基因組合檢測診斷出91%的肺癌[16,25,26]。痰液中多基因聯(lián)合檢測具有高特異性和敏感性，有望成為肺癌篩查和早期診斷的方向，需要更大樣本、更多基因的聯(lián)合研究和深入分析提供進(jìn)一步的支持。

LDCT與痰液中DNA異常甲基化檢測的結(jié)合也能使肺癌篩查的效率提高，對在LDCT上發(fā)現(xiàn)可疑結(jié)節(jié)的患者進(jìn)行痰液生物活性物質(zhì)檢測能夠得到63%-86%的敏感性和75%-92%的特異性[16]；Leng等[27]的研究也提示痰液生物活性物質(zhì)檢測能夠排除1/3 LDCT的假陽性。而針對肺癌的診斷上，根據(jù)大量的病例研究和動物實驗表明，原癌基因KRAS和抑癌基因p53在肺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[28]。Somers等[29]對肺腺癌患者的痰液進(jìn)行了研究，結(jié)果提示KRAS基因的點突變可以在肺腺癌患者的痰液中檢測到，為后續(xù)的檢測的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。Destro等[18]在一項對照實驗中發(fā)現(xiàn)，肺癌患者中痰液樣本檢測出KRAS突變（79%）而對照組無一陽性，雖然當(dāng)前針對痰液中KRAS和p53對于肺癌診斷的研究仍未有統(tǒng)一的結(jié)論，但KRAS和p53在肺癌發(fā)展中起著核心作用，結(jié)合痰液檢測的無創(chuàng)性特點，痰液中KRAS和p53檢測在今后肺癌的診斷技術(shù)中仍具有潛力。除了單基因檢測，聯(lián)合檢測DNA甲基化和miRNA被證實可以顯著提高檢測的特異性和敏感性。研究[30]顯示，同時檢測2種miRNA（miR-31, miR-210）和2種DNA甲基化（RASSF1A和3OST2）能夠獲得87%的敏感度和90%的特異性。痰液中生物活性物質(zhì)在肺癌診斷中具有很大的潛力，為了進(jìn)一步驗證檢測的敏感度和特異性，需要多中心、大樣本臨床研究提供更充分的證據(jù)[18,19]。

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）相關(guān)基因突變被認(rèn)為是肺腺癌發(fā)生的機(jī)制之一，痰液中EGFR突變對于診斷的影響也在研究之中，研究發(fā)現(xiàn)EGFR突變可能與女性或非吸煙患者的肺腺癌有關(guān)，肺癌的不同亞型可能會成為影響EGFR突變檢出率的原因，同時，當(dāng)前研究較小的樣本量所能具備的代表性也值得進(jìn)一步探究[31-34]。在臨床治療中，針對EGFR突變的靶向藥被廣泛證實有顯著的療效，EGFR突變的檢測對非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）有著重要的作用[35,36]，研究[33]顯示，在已經(jīng)明確診斷為EGFR突變型NSCLC的患者中，30%-50%的患者可以在痰液中檢出這一突變，且所有對照組中均不能檢出。另一項相似的研究的結(jié)果[37]顯示，痰液中檢測EGFR突變可以得到46.2%的敏感度和100%的特異性。雖然敏感度不夠理想，但這些研究揭示了痰液EGFR突變檢測可以在早期獲得肺癌患者EGFR突變狀態(tài)。間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）也是NSCLC的常見治療靶點，針對此基因突變的許多靶向療法具有顯著的療效[38]，但當(dāng)前尚未有針對痰液中ALK突變的檢測研究。針對其他靶點如MET、BRAF的研究同樣缺乏[30]。

3 痰液中的miRNA

miRNA是一種穩(wěn)定的非編碼單鏈小核苷酸序列，它們主要通過與位于靶mRNA 3’-非翻譯區(qū)（untranslated area,UTR）內(nèi)的種子序列結(jié)合來調(diào)控致癌和/或抑瘤基因，最終導(dǎo)致靶mRNA失活和降解，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與調(diào)控腫瘤進(jìn)程。大量研究[39-41]發(fā)現(xiàn)，miRNA基因的異常表達(dá)與肺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，一類miRNA作為抑癌基因發(fā)揮作用，如let-7家族（let-7a、let-7c）、miR-1[42]可抑制癌細(xì)胞的增殖及耐藥，miRNA-1、miRNA-206[43]可通過減少腫瘤血管生成而抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)miRNA-126、miRNA-494也有一定致癌作用[44-47]。另一類則作為致癌基因發(fā)揮作用，其高表達(dá)可促進(jìn)肺癌的進(jìn)展，如miR-103-a可增加血管生長因子的表達(dá)[48]，miR-31可引起腫瘤支持可溶性因子與侵襲性增加[49]，miRNA-17家族（miRNA-17、miRNA-18a、miRNA-19a、miRNA-20a、miRNA-19b-1、miRNA-92a-1）[50]、miRNA-335[51]、miRNA-155[52]、miRNA-183[53]均在肺癌組織中表達(dá)增加。

肺癌亞型傳統(tǒng)上依賴于切除標(biāo)本、支氣管鏡活檢、細(xì)針穿刺的組織病理學(xué)觀察，這些樣本的采取方式對患者的侵襲性大[54-56]，然而研究人員[57,58]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性miRNA以穩(wěn)定的形式存在于痰液中，且對RNA酶具有抗性，此外在7 d內(nèi)的痰液樣本中也可以被檢測出來，過去15年里痰液中miRNA檢測越來越多地被用于腫瘤早期篩查與診斷。Zhang等[59]為評估痰液標(biāo)本中miRNA的異常表達(dá)是否可以作為NSCLC的有用生物標(biāo)志物，納入了14篇文章，包括1,009例NSCLC患者和1,006例健康者對照，結(jié)果顯示聯(lián)合敏感性、特異性、陽性似然比（positive likelihood ratio,PLR）、陰性似然比（negative likelihood ratio, NLR）、診斷優(yōu)勢比（diagnostic odds ratio, DOR）和曲線下面積（area under the curve, AUC）分別為0.75（95%CI: 0.72-0.78）、0.88（95%CI: 0.86-0.90）、5.70（95%CI: 4.82-6.75）、0.30（95%CI: 0.26-0.34）、22.43（95%CI: 17.48-28.79）、0.89，提示痰液標(biāo)本中的miRNA可能是NSCLC的無創(chuàng)性診斷生物標(biāo)志物。

肺癌患者痰液中miRNA-21、miRNA-155、let-7a的含量與良性肺疾病患者與健康者的的痰液中含量差異顯著，miRNA-21與miRNA-155在肺癌患者痰液中含量增高，而let-7a含量則相反[60]。Yu等[58]納入36例肺癌患者和36例健康者對其痰液進(jìn)行標(biāo)記物優(yōu)化，鑒定出7種表達(dá)顯著改變的miRNA，4種在肺癌患者中高表達(dá)，3種低表達(dá)，最終選擇4種miRNA（miRNA-21、miRNA-486、miRNA-200b和miRNA-375）組合，其對診斷肺腺癌的靈敏度和特異度分別為80.6%和91.7%。Roa等[61]檢測肺癌患者痰液中5種miRNA（miR-21、miR-143、miR-155、miR-210、miR-372）含量增加，隨后進(jìn)行雙盲定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對診斷肺癌的敏感度和特異度分別為83.3%和100%。Xing等[62]通過實時定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction, RT-PCR）對48例I期肺鱗癌患者和48例健康人的痰中miRNA標(biāo)記，鑒定出6種miRNA，其中3種過度表達(dá)，另外3種表達(dá)不足，最終篩選出3種miRNA（miRNA-205、miRNA-210和miRNA-708），其在區(qū)分肺鱗癌患者和正常受試者方面具有73%的敏感性和96%的特異性。Ulivi等[63]和Su等[64]同樣采用多種miRNA聯(lián)合檢測肺癌的方式，也擁有較好的檢測能力。

提示痰液miRNA檢測對肺癌的早期篩查與診斷有一定價值和意義，痰中的miRNA表達(dá)水平極為穩(wěn)定，收集后1 d-7 d每天基本不會改變[65]。但該方法具有一定局限性，從患者身上采集的樣本中細(xì)胞數(shù)量不同可能導(dǎo)致miRNA含量不穩(wěn)定，且許多患者伴有呼吸肌疲勞、無力等癥狀，這使痰液的采集變得十分困難，部分患者痰液量減少甚至無痰。并且目前僅有少數(shù)miRNA能提供較好的診斷效果，而miRNA對癌癥的調(diào)控作用也未能在診斷中有所反映。基于痰液miRNA對于肺癌診斷和篩查無疑是良好的工具，但對利用miRNA的定量分析對肺癌預(yù)后治療、隨訪的評價作用未有報道，或許可成為研究的新方向。

4 痰液中的mRNA

mRNA，是由DNA單鏈作為模板通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生、攜帶遺傳信息、能參與蛋白質(zhì)合成的一類單鏈核糖核酸。相較于miRNA，mRNA在痰液中降解快，因此有必要盡快對采集后的痰液標(biāo)本進(jìn)行檢測或及時保存；目前常應(yīng)用RTPCR法對mRNA序列進(jìn)行檢測，對肺癌進(jìn)行診斷和篩查。

Dong等[67]應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR,RT-PCR）法檢測104例肺癌患者痰液標(biāo)本，并與傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果比較，肺癌患者痰標(biāo)本Survivin mRNA的陽性率為60.6%（63/104），提示痰液mRNA作為肺癌篩查的可能性。Sun等[68]應(yīng)用實時定量RT-PCR法檢測了75例肺癌組織和71例相應(yīng)痰標(biāo)本中APRIL mRNA的表達(dá)，并進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明肺癌、肺部良性疾病和健康志愿者的APRIL mRNA表達(dá)陽性率分別為81.7%（58/71）、3.2%（2/62）和1.5%（1/65）；肺癌患者痰液中APRIL mRNA的表達(dá)水平明顯高于良性肺部疾病患者和健康志愿者。印記位點調(diào)節(jié)物兄弟因子（brother of the regulator of imprinted sites, BORIS）作為癌基因也在肺癌患者痰液中被檢測到，BORIS陽性則有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理結(jié)果為進(jìn)展期的提示[69]，提示了其在預(yù)后、治療方面的作用。

Chen等[70]建立了一種新的PCR方法：Template-Ready PCR（TRPCR），提高了PCR的靈敏度；應(yīng)用這種方法檢測858例肺癌患者和480例非惡性肺部疾病志愿者的痰液標(biāo)本中的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase, HTERT）mRNA，其陽性率分別為84.15%（722/858）和3.96%（19/480），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。由于mRNA易降解的特性，其痰液檢測受到限制，未有研究報道其生物學(xué)特性在肺癌復(fù)發(fā)、隨訪等方面的作用，但mRNA具有的基因特性仍具有較大潛力。

5 痰液中的蛋白質(zhì)

21世紀(jì)以來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)不斷得到發(fā)展與補(bǔ)充，利用該技術(shù)檢測對應(yīng)的生物標(biāo)志物在疾病的篩查、診斷和預(yù)后中發(fā)揮著不可或缺的重要作用。肺癌患者的痰液中可以檢測出敏感性好、特異性高的生物標(biāo)志物，將會大大提高肺癌早期檢測成功率，從而更好地進(jìn)行肺癌的治療和預(yù)后[71]。

Rangel等[73]利用透明質(zhì)酸（hyaluronan, HA）區(qū)分腫瘤患者和無腫瘤患者的敏感性為80%，特異性為66%，擁有較好的敏感度，在肺癌篩查方面具有較大潛力。Yu等[72]研究了I期肺癌患者的診斷方式，在痰上清液中利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)EN01蛋白水平增高，敏感性為58%，特異性為80%。Pio等[74]證實了肺癌患者痰中存在補(bǔ)體因子H的水平升高，補(bǔ)體因子H檢驗的敏感性和特異性分別為80%和88%；他們認(rèn)為分子生物標(biāo)記物的測量，如補(bǔ)體因子H，未來可能作為細(xì)胞學(xué)檢測的輔助手段用于惡性肺部疾病的診斷。Li等[75]利用蛋白芯片和ELISA技術(shù)開發(fā)了三種腫瘤抗原相關(guān)自身抗體（tumor antigen-associated autoantibody,TAAb）DDX6、ENO1和14-3-3ζ作為診斷肺癌的生物標(biāo)志物，其敏感性和特異性分別為81%和83%。

對痰液中蛋白質(zhì)的檢測擁有較高的特異性和敏感度，具有良好的診斷性作用，而通過蛋白質(zhì)定量檢測來判斷肺癌進(jìn)展程度的報道較少。

6 展望

痰液中生物標(biāo)志物具有良好的肺癌診斷能力，但痰液標(biāo)本收集則會干擾診斷的能力，故對痰液標(biāo)本的收集是值得研究的方向。痰液中生物標(biāo)志物大多為RNA，其穩(wěn)定性不高，易分解，采樣后及時檢測也是提高檢測能力的方法之一。血液中存在可評估腫瘤進(jìn)展和治療效果的生物標(biāo)志物，而痰液中也可能存在類似的物質(zhì)，除用于肺癌診斷也可用于對肺癌狀態(tài)的實時檢測。痰液中存在多種可用于檢測的物質(zhì)，聯(lián)合診斷往往可以提高診斷的能力，目前較多研究為同類物質(zhì)的聯(lián)合檢測，而不同物質(zhì)如miRNA聯(lián)合蛋白或miRNA聯(lián)合DNA的檢測方式還未有報道。同樣生物活性物質(zhì)的檢測也可與LDCT聯(lián)合診斷肺癌并提高二者的準(zhǔn)確性[16]。

由于血清和血漿相比于痰和全血，具有更大的特異性和敏感性[66]，近年來對痰液生物活性物質(zhì)的研究熱度有所降低，較少研究利用定量檢測對肺癌進(jìn)程進(jìn)行分析，而痰液中含有大量可檢測的生物標(biāo)志物，隨著檢測方式的不斷改進(jìn)，其在肺癌的診斷甚至治療預(yù)后中的作用將會越來越大。