王鋼 田杰祥 周孟茹 李平順*

1.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院風濕骨病科，甘肅 蘭州 73000 2.蘭州大學基礎醫(yī)學院，甘肅 蘭州 73000

人體腸道中大約有100萬億個微生物，包括細菌、古細菌、真菌和病毒。在已鑒定的多種微生物中厚壁細菌、擬桿菌、微藻、放線菌和變形桿菌占大多數(shù)[1]。這些微生物比人類自身具有更多的遺傳表型，但是它們在維持身體健康方面的作用卻被大大忽略了。腸道微生物群(gut microbiota，GM)通過幫助食物消化吸收，分泌代謝產(chǎn)物和保護黏膜屏障功能，在維持人體生理平衡中起主要作用。但是，微生物的失衡會釋放出對器官起作用的蛋白質、肽和代謝產(chǎn)物，從而導致全身性多器官功能障礙[2]。骨骼作為人體的負重器官，具有活躍的新陳代謝，在日?；顒又芯哂兄匾饬x。骨質疏松癥(osteoporosis，OP)的特征是由于骨量和(或)質量的降低而增強了骨骼的脆性，其風險既取決于在20至30歲時達到的峰值骨量，也取決于隨后的年齡依賴性骨量流失的速度。研究表明，峰值骨量變異的50%至85%是由遺傳決定的，但是對于與年齡相關的骨質流失，環(huán)境因素似乎起著更為明顯的作用[3]；GM與宿主之間的共生需要微妙的平衡，一旦破壞，可能會增加OP的風險。最近的研究表明，GM是骨量的調節(jié)劑，主要通過對炎癥和免疫作用介導的，而免疫系統(tǒng)又調節(jié)破骨細胞的生成。因此，免疫系統(tǒng)和微生物群均對骨穩(wěn)態(tài)起著至關重要的作用，這一認識意味著從“骨免疫學”領域向“骨微生物學”[4]的進化。對于這一術語的定論為延遲OP提供了新的理論基礎，并為臨床難治性OP提供了新的治療方向。

1 骨免疫學

1.1 炎癥-免疫系統(tǒng)-骨量流失環(huán)節(jié)

骨免疫學是描述免疫系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)之間相互作用的領域。炎癥和骨量流失之間的聯(lián)系已得到很好的確立，在OP等骨代謝疾病中，破骨細胞(osteoclasts，OC)的骨吸收與活化的T細胞及其產(chǎn)生的OC原性細胞因子密切相關[5]。CD4+T輔助(Th)細胞亞型的失衡可能是OP患者OC增多的第一個驅動因素：①Th1分化產(chǎn)生幾種與骨代謝控制有關的細胞因子(例如IFNγ、TNFα、RANKL、TNFα和RANKL是眾所周知的促OC生成細胞因子)；②Th17在炎癥和OP的發(fā)展中起著至關重要的作用，Th17細胞產(chǎn)生IL-17通過增加RANKL的釋放而參與OC上調，而RANKL的釋放可能與IL-1和TNF-α協(xié)同作用導致骨量流失；③已知T調節(jié)細胞(Tregs)對于維持外周耐受機制和預防自身免疫至關重要，然而炎癥環(huán)境可抑制Tregs的功能活性，Treg相關細胞因子(IL-10、IL-2和TGF-β)將相應減少，致使抑制自身免疫反應作用降低，進一步加劇OP。

T細胞不僅通過細胞因子促進OC活性，而且通過細胞間的相互作用與OC相互影響。OC的行為類似于APC，且它們與樹突狀細胞和巨噬細胞具有相同的前體。OC表達的主要組織相容性復雜分子和共刺激分子參與調節(jié)T細胞對免疫刺激的應答，例如CD80和CD86；CD80和CD86在專業(yè)APC和OC上均有表達，并與活化T細胞上表達的CD28結合[6]。研究表明，T細胞表面表達CTLA-4信號分子，可通過中斷CD80/86和CD28復合物形成以嚴格調控T細胞活化，因此這些分子在OC-T細胞相互作用中起著至關重要的作用。例如，CD80/86信號分子缺陷型小鼠表現(xiàn)出OC分化活躍，主要因CD80/86缺陷型OC不受CTLA-4或Tregs抑制；在人體實驗中，使用CD80/86靶向藥物可減少OC形成，而使用阻斷CTLA-4的靶向藥物可上調OC形成[7]。因此，T細胞和OC之間的相互作用可能是OP中OC增多的基本機制。

1.2 性激素流失-免疫系統(tǒng)-骨量流失環(huán)節(jié)

絕經(jīng)后骨質疏松癥是最常見的代謝性骨骼疾病。其特點是骨礦物質密度降低和骨骼的微結構退化，骨折風險增加。在絕經(jīng)后OP中，OB介導的骨形成與OC介導的骨吸收之間的解偶聯(lián)導致骨量流失。雌激素缺乏是絕經(jīng)后骨量流失的主要驅動力：在雌激素消耗期間，OC的形成和活性增加，這種增加部分是通過雌激素缺乏對免疫系統(tǒng)的影響來介導的。

有關動物和人類的數(shù)據(jù)表明，雌激素可增強細胞和體液免疫反應。在雌激素缺乏期間，免疫反應發(fā)生改變，特別是T細胞變得更加活躍，并能夠產(chǎn)生炎性和促OC生成的細胞因子[8]。雌激素缺乏誘導骨髓T細胞增殖并延長壽命的關鍵機制之一是巨噬細胞和樹突狀細胞的抗原呈遞增加，這歸因于II類反式激活因子(CIITA)(一種轉錄蛋白)的高表達[9]，CIITA可與巨噬細胞和樹突狀細胞的組織相容性復合物II類啟動子結合以發(fā)揮數(shù)量與功能上調的最終作用。另外，CD40/CD40 L系統(tǒng)對于T細胞活化和免疫系統(tǒng)的多種功能至關重要：CD40/CD40 L可促進巨噬細胞的活化和分化、抗體同種型轉換以及B細胞中免疫記憶維持[10]。雌激素缺乏導致T細胞CD40配體(CD40 L)表達的上調促進了基質細胞表達M-CSF、TNFα和RANKL，并下調了OPG表達，導致OC生成顯著增加[11]。

2 骨微生物學

骨微生物學是指微生物群在骨骼健康中的作用，以及微生物群調節(jié)骨骼發(fā)育、骨骼老化和病理性骨量丟失的機制；該研究領域旨在彌合骨骼生理學、胃腸病學、免疫學和微生物學之間的差距[12]。研究表明，GM是骨代謝的關鍵調節(jié)劑，GM菌群失衡可能通過調節(jié)免疫系統(tǒng)參與了OP的骨量丟失；例如，在無菌條件下飼養(yǎng)的小鼠(即具有無菌腸道的小鼠，稱為“無細菌”小鼠)的骨小梁骨量與在常規(guī)條件下飼養(yǎng)的小鼠相比骨骼質量和密度增加，而骨形成沒有改變；同時，“無細菌”小鼠由于腸道黏膜免疫系統(tǒng)不成熟，表現(xiàn)出免疫系統(tǒng)的改變，脾臟中的T輔助細胞數(shù)量明顯減少，這也說明GM負責正確地發(fā)展全身免疫力[13]。這些觀察結果反向表明，免疫系統(tǒng)異?？赡苁荊M失調繼發(fā)OP發(fā)病機制中最關鍵的環(huán)節(jié)，此外，GM還可能通過影響宿主的新陳代謝和內分泌環(huán)境影響骨穩(wěn)態(tài)。因此，本文將從免疫系統(tǒng)、新陳代謝和內分泌環(huán)境以及其他因素回顧GM對骨代謝的影響。

3 微生物群影響骨骼健康機制

3.1 新陳代謝

3.1.1脂多糖(LPS)：LPS主要存在于革蘭氏陰性菌中，通過激活轉化生長因子(TGF)和Toll樣受體來刺激炎癥，上調OC活性。GM通過維持腸道細胞健康緊密連接并維持黏液保護層來調節(jié)細胞的通透性，腸道菌群失調會增加腸道細胞的通透性，導致更多的LPS進入循環(huán)系統(tǒng)，導致代謝功能障礙(腸道菌群失調會增加腸道pH值并降低鈣吸收)和炎癥(LPS可以上調骨干S端區(qū)域的炎性介質，如IL-1、COX-2、TNF)[14]。Chongwatpol等[15]和Amar等[16]對大鼠實施LPS藥丸干預以模擬慢性炎癥的體內模型，發(fā)現(xiàn)LPS顯著降低了骨小梁體積與骨礦物質密度。

3.1.2膽汁酸：膽汁酸經(jīng)歷“腸肝循環(huán)”，并在厭氧細菌的影響下轉化為次級膽汁酸；GM通過法尼醇X受體(Farnesoid X receptor，F(xiàn)XP)和膜結合G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled bile acid receptor，TGR5)信號傳導可改變次級膽汁酸的量和類型，從而產(chǎn)生不同的代謝作用[17]。某些類型的適量次級膽汁酸是TGR5的激動劑，刺激TGR5可以增加胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)的產(chǎn)生，GLP-1是一種腸內激素，可以激活甲狀腺C細胞增殖并促進降鈣素分泌，從而抑制骨吸收；GLP-1還可以刺激OB增殖并抑制OC[18]。另外，過量單羥基化的石膽酸(lithocholic acid，LCA)可作為一種維生素D受體(VDR)配體影響維生素D刺激OPG和RANKL的基因表達，間接控制骨骼的基因翻譯；同時，LCA可能損害OB線粒體并降低OB活性[19]。因此，過量的LCA可能在OP的發(fā)病機理中起作用。

3.1.3短鏈脂肪酸(SCFA)：結腸中的細菌可以將難消化的碳水化合物發(fā)酵成SCFA，包括乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽。另外，氨基酸的腸細菌發(fā)酵也會產(chǎn)生SCFA。SCFA具有通過膜蛋白(SLC5A8、GPR41、GPR43、GPR109A)影響Tregs的發(fā)育能力，可以促進抗炎環(huán)境，抑制骨量流失。具體機制如下[20]：①GPR109A被丁酸酯激活，通過誘導IL-18分泌抑制炎癥；②被乙酸鹽激活的GPR43通過誘導炎癥細胞凋亡促進炎癥的消退；③被丁酸酯激活的GPR41通過抑制NF-κB的激活來抑制OC數(shù)量與活性；④SLC5A8通過抑制組蛋白脫乙酰基酶(HDAC)抑制炎癥。

3.2 免疫系統(tǒng)

免疫系統(tǒng)是宿主防御系統(tǒng)，在正常情況下，GM和免疫系統(tǒng)可維持人體健康；但是，由于各種因素引起的腸道菌群失衡也會通過免疫系統(tǒng)促進疾病的發(fā)展。在無菌小鼠中，復雜微生物的移植可以減輕骨髓祖細胞的消耗和單核細胞增殖的障礙[21]；這一發(fā)現(xiàn)表明GM與免疫細胞的發(fā)育有關，免疫系統(tǒng)與OP的發(fā)展密不可分。

3.2.1輔助性T細胞和B細胞：腸道微生物失衡會抑制Th1、Th2、Tregs細胞分化，誘導Th17細胞分化，從而誘導OC的分化和增殖，加劇骨量流失。Th17細胞對于激活先天免疫機制(包括誘導上皮細胞產(chǎn)生抗菌肽和募集中性粒細胞)非常重要，同時Th17 細胞被認為是OP發(fā)病機制中的主要效應細胞。將分段絲狀細菌(SFB)移植到無菌小鼠中可增加Th17細胞的數(shù)量，并輕度增加Th1細胞的數(shù)量；SFB似乎穿透了回腸末端的黏液層，與上皮細胞接觸，并誘導肌動蛋白聚集，誘發(fā)Th17極化信號[22]；SFB引發(fā)Th17極化信號通路的可能機制：①SFB影響了參與Th17細胞極化的抗菌蛋白RegIIIg的表達；②SFB通過腸上皮細胞產(chǎn)生可能影響DC細胞因子的血清淀粉樣蛋白A誘導Th17細胞分化；③Th17細胞的分化取決于腸道樹突狀細胞對SFB抗原的MHCII依賴性抗原呈遞。Treg細胞的分化是由短鏈脂肪酸誘導的，在小鼠中，厚壁細菌，尤其是梭狀芽胞桿菌可促進Tregs在結腸固有層中的積累，抑制炎性環(huán)境從而下調OC分化與形成，對骨質具有保護作用。

B淋巴細胞通過磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物的雷帕霉素靶標(mTOR)信號轉導途徑控制RANKL/OPG比率，從而調節(jié)骨細胞的生長速度；腸道菌群會影響mTOR轉錄因子的表達，若敲除TSC1表達(mTOR的負調節(jié)劑)會導致RANKL/OPG比值增加，從而加速OC增殖[23]；同時，腸道菌群也會影響B(tài)細胞發(fā)育和B細胞的OPG產(chǎn)生，OPG除了可直接抑制RANKL促進OB活性，還可通過調節(jié)自噬相關基因和AMP激活的蛋白激酶/mTOR/p70S6K信號傳導來抑制OC的分化和骨吸收[24]。

3.2.2NOD1和NOD2信號：NOD1在許多類型的細胞中均有表達，通過識別高表達于革蘭氏陰性菌的肽聚糖來誘導促炎信號；NOD2在非造血細胞、骨髓衍生細胞和淋巴細胞中廣泛表達，NOD2可以與革蘭氏陽性、陰性菌的所有肽聚糖結合，通過NLR與細菌肽結合并吸引受體相互作用蛋白(receptor interaction protein，RIP2)，刺激NF-κB信號通路，上調炎性因子誘導OC生成[25]。在微生物群引起的牙周炎模型中驗證了NOD2對骨吸收的作用，而在缺乏NOD2的小鼠中，骨吸收和OC數(shù)量顯著減少，這表明GM誘導的骨吸收依賴于NOD2信號[26]。

3.2.3Wnt信號：Wnt/β-catenin信號通路在OP發(fā)病中的核心作用得到公認，其對OB分化、生長、凋亡及功能表達具有重要意義。Wnt/β-catenin信號通路可以被某些細菌抑制，例如核梭形桿菌和脆弱擬桿菌可以使結腸巨噬細胞極化為M1狀態(tài)，從而產(chǎn)生內源性炎癥細胞因子(以TNF為主)，這些事件稱為微生物誘導的旁觀者效應(microbial-induced bystander effects，MIBE)[27]。研究表明，TNF通過抑制Wnt3和誘導Wnt抑制因子1(Wnt inhibitory factor 1，WIF1)以抑制Wnt/β-catenin信號通路[28]，從而導致骨量減少骨質流失。

3.3 內分泌環(huán)境

3.3.1性激素：據(jù)報道，某些GM可能具有代謝性激素并影響其活性的能力。例如，腸道共生梭菌梭狀芽胞桿菌通過羥類固醇水解酶和其他酶將糖皮質激素轉化為雄激素[29]；而編碼β-葡糖醛酸糖苷酶的微生物參與雌激素的腸肝循環(huán)[1]。許多研究已經(jīng)證實雌激素、雄激素在骨代謝中的作用，但其作用機制非常復雜，需要更多的人類研究來證實腸道微生物群是否可以通過調節(jié)性激素系統(tǒng)的轉化直接影響骨骼代謝。

3.3.2胰島素樣生長因子1和胰高血糖素樣肽1：胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)是上調軟骨細胞和OB分化與活性的關鍵因子，其機制主要通過Akt-mTOR途徑調節(jié)并誘導eNOS水平持續(xù)升高，從而促進OB分化與炎性因子表達[30]。腸L細胞分泌的胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)可促進OB分化并抑制間充質干細胞且促進其并轉化為脂肪；GLP-2具有很強的腸道親和力，并可以通過轉化生長因子β-SMAD2/3-iNOS-NO-半胱天冬酶3-B細胞信號通路抑制OC的增殖[31]。GM失衡會導致IGF-1、GLP-1、GLP-2水平降低，從而間接影響OB、OC的功能和數(shù)量，最終導致OP[32]。

3.3.3血清素：血清素同神經(jīng)遞質一樣在大腦中產(chǎn)生，其直接靶標是OB，血清素與血清素受體(主要是Htr1b)結合，可抑制Htr1b/PKA/CREB/細胞周期蛋白信號傳導，通過促進骨形成和抑制骨吸收而對OP產(chǎn)生積極影響[33]。

3.3.4瘦素：瘦素是一種來源于脊椎動物雙細胞的激素，可調節(jié)骨量、能量消耗和食欲等生理過程。一些證據(jù)表明微生物群與瘦素水平有關：使用萬古霉素可導致大鼠瘦素水平急劇下降；大量細菌種類(如乳球菌、黏液螺旋菌、乳桿菌和雙歧桿菌)與周圍瘦素水平呈正相關；而其他細菌種類(如梭菌、普氏桿菌、擬桿菌和同種異位菌)與瘦素水平呈負相關[34]。當瘦素與瘦素受體(leptin receptor，ObRb)結合可抑制血清素的合成與釋放[35]，因此GM失衡可最先影響瘦素從而減少血清素，抑制骨形成和促進骨吸收，導致OP形成。

3.3.5甲狀腺激素：GM通過調節(jié)葡萄糖醛酸苷酶和硫酸鹽活性來影響甲狀腺素的肝腸循環(huán)[36]。在甲狀腺素中，降鈣素(由甲狀腺C細胞分泌)可以抑制甲狀旁腺素，從而減少骨動員，促進OC凋亡，并延遲OP的發(fā)作。

3.4 其他

一氧化氮合酶(NOS)：GM可以驅動致病菌或細菌脂多糖誘導的NF-κB與誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)啟動子結合，從而上調iNOS的轉錄；在機械應力作用下，iNOS可增加OB數(shù)量，但同時也可通過增加RANKL水平促進OC的產(chǎn)生[37]。GM還促進內皮NOS(endothelial NOS，eNOS)的釋放，eNOS mRNA可調節(jié)骨細胞的產(chǎn)生、炎性介質的釋放(例如TNF-α、IL-1、IL-6)[38]。在NOS缺乏的大鼠中，骨小梁礦化和軟骨細胞功能降低；而iNOS缺陷大鼠比eNOS缺陷大鼠發(fā)展出更嚴重的OP，這表明GM主要通過影響iNOS活性來維持骨穩(wěn)態(tài)[39]。

同型半胱氨酸：腸道菌群失調導致空腸中葉酸的吸收減少，導致高同型半胱氨酸血癥；高同型半胱氨酸血癥不僅會導致細胞外基質降解和骨血流量減少，而且還會對骨骼健康產(chǎn)生有害影響[40]。

4 GM相關療法與展望

高纖維益生菌補充劑、SCFA飲食和糞便微生物移植(fecal microbial transplantation，F(xiàn)MT)是研究最多的療法，它們均具有抗炎作用，并能維持腸道菌群的平衡。其中以SCFA飲食療法研究較多[41]：①SCFA促進Treg發(fā)育并刺激Treg免疫反應，從而減弱由GM引起的免疫系統(tǒng)異常；②SCFA可降低腸道pH值，增加鈣結合，上調蛋白質轉錄和維生素D受體水平來增加鈣的吸收。FMT是一種將糞便及其相關微生物群從健康的供體中取出并放置于接受者體內的方法，現(xiàn)已成為人類艱難梭菌感染的公認治療方法，也有研究報道FMT在動脈粥樣硬化、肥胖癥和腫瘤疾病中可能有效[42]；而骨病可能成為簡化FMT程序的另一種應用，推測未來可能會在個性化藥物的發(fā)展方面對重度OP患者的微生物群進行分析，并嘗試通過飲食、益生元、益生菌或FMT將微生物群轉變?yōu)楦吖趋辣Ｗo性的成分。總之，GM可以通過影響宿主代謝、免疫力和內分泌環(huán)境來調節(jié)骨代謝，這可能為OP的新預防和治療策略提供了理論基礎，并為OP的免疫調節(jié)和靶向治療提出了新的思路。但是，GM與OP的關系仍需要進一步研究，尤其是特定微生物在OP中的作用以及來自實驗動物研究的觀察數(shù)據(jù)需要在人類研究中進一步驗證。