李冬華，張 平，張明童，楊 靜，馬 瀟，宋平順，楊平榮

1 甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州730070；2 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

隨著中藥材種植規(guī)范化在甘肅的大力推廣，初加工方法也開始受到重視?？販乜貪窀稍锓ǎ捶蛛A段，機(jī)械化控制溫度與濕度，最終達(dá)到對(duì)某種中藥材快速干燥，易于貯藏，方便炮制，且不添加任何有害化學(xué)物質(zhì)的現(xiàn)代化加工方法［1-5］。特征指紋圖譜是指某種藥材中所共有的、具有特異性的某類或數(shù)類成分的色譜或光譜的譜圖，目前已成為控制中藥或天然藥物質(zhì)量的有效手段［6-7］。本實(shí)驗(yàn)考察了兩種初加工方法所生產(chǎn)的當(dāng)歸飲片中揮發(fā)油成分、醇提取成分以及水提取成分的指紋圖譜，兼顧了當(dāng)歸的親脂性、中等極性和親水性的化學(xué)成分，可以比較全面的比較不同初加工方法的當(dāng)歸飲片的成分特征［8-14］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器GC-2010 plus 型氣相色譜儀（日本島津），Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）。甲醇、甲酸、乙酸、二甲苯均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司），阿魏酸（批號(hào)：110773-201012）及藁本內(nèi)酯（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111737-201608，批號(hào)：111737-201608）。

1.2 試藥實(shí)驗(yàn)所測(cè)不同初加工方法的當(dāng)歸飲片樣品，經(jīng)甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院宋平順主任藥師鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels 根的凈制切片。其初加工方法與來源見表1。

表1 不同初加工方法的當(dāng)歸飲片來源

2 當(dāng)歸揮發(fā)油氣相色譜指紋圖譜比較

2.1 色譜條件色譜柱：DB-5彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：氮?dú)?，流? mL/min；程序升溫：初始溫度60℃，以3℃/min升至250℃，保持16 min；進(jìn)樣口溫度230℃；氫火焰（FID）檢測(cè)器，溫度260℃，分流比為1∶50，進(jìn)樣量：1 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備取藁本內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含4 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備按2015 年版《中華人民共和國(guó)藥典》中揮發(fā)油提取方法［15］，取當(dāng)歸飲片粉末50 克置于圓底燒瓶中，加水300 mL，加數(shù)片沸石，連接揮發(fā)油測(cè)定器，自測(cè)定器上端入口處加適量水，精密加1 mL二甲苯，連接冷凝管，蒸餾8 h，停止加熱，冷卻半小時(shí)后收集油層，0.45 μm 濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得當(dāng)歸揮發(fā)油供試品溶液。

2.4 精密度考察取同一批當(dāng)歸飲片揮發(fā)油供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。結(jié)果指紋圖譜相似度的RSD：0.26%；各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.00%～0.48%。表明儀器的精密度良好。

2.5 重復(fù)性考察取同一批當(dāng)歸飲片6 份，制備揮發(fā)油供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果指紋圖譜相似度的RSD：0.66%；各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.00%～1.03%。表明該分析方法的重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性考察取同一批當(dāng)歸飲片揮發(fā)油供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、12 和24 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果指紋圖譜相似度的RSD：1.15%；各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.00%～1.15%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 當(dāng)歸飲片揮發(fā)油指紋圖譜的建立及比較分別精密吸取各供試品溶液1 μL，進(jìn)樣分析，得到指紋圖譜并統(tǒng)一處理，導(dǎo)出cdf 文件，用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件，進(jìn)行圖形匹配及數(shù)據(jù)匹配，建立供試品指紋圖譜，計(jì)算相似度并比較，見圖1—2。16 批次供試品相似度在0.986～1.000 之間，比較傳統(tǒng)煙熏干燥法的供試品1～8所生成的對(duì)照?qǐng)D譜與現(xiàn)代控溫控濕干燥法的供試品9～16 所生成的對(duì)照?qǐng)D譜，二者相似度為0.998。表明兩種初加工方法所生產(chǎn)的當(dāng)歸飲片中揮發(fā)油成分相似度高，明顯差別。見表2—3。

圖1 不同初加工方法的當(dāng)歸飲片揮發(fā)油氣相指紋圖譜

圖2 不同初加工方法的當(dāng)歸飲片揮發(fā)油氣相指紋圖譜比較

表2 不同初加工方法的當(dāng)歸飲片揮發(fā)油氣相指紋圖譜相似度

表3 不同初加工方法的當(dāng)歸飲片揮發(fā)油氣相指紋圖譜相似度比較

3 當(dāng)歸飲片甲醇提取成分液相色譜指紋圖譜比較

3.1 色譜條件C18色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-1%乙酸水溶液（B）梯度洗脫；流速1.0 mL/min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量10 μL，見表4。

表4 流動(dòng)相梯度洗脫表

3.2 對(duì)照品溶液的制備取阿魏酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含10 μg 的溶液，即得；取藁本內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含4 mg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備取當(dāng)歸飲片粉末（過三號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-甲酸（95∶5）溶液25 mL，密塞，稱定質(zhì)量量，超聲處理（功率250W，頻率40 kHz）60 min，放冷，用甲醇-甲酸（95∶5）補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 精密度考察取同一批當(dāng)歸飲片甲醇提取溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。結(jié)果指紋圖譜相似度的RSD：0.32%；各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.05%～0.75%。表明儀器的精密度良好。

3.5 重復(fù)性考察取同一批當(dāng)歸飲片6 份，制備甲醇提取溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果指紋圖譜相似度的RSD：0.86%；各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.06%～1.35%。表明該分析方法的重復(fù)性良好。

3.6 穩(wěn)定性考察取同一批當(dāng)歸飲片甲醇提取溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、12和24 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果指紋圖譜相似度的RSD：1.65%；各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.08%～1.55%。表明供試品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.7 當(dāng)歸飲片甲醇提取成分指紋圖譜的建立及比較分別精密吸取各批供試品溶液10μL，進(jìn)樣分析，得到各指紋圖譜，統(tǒng)一處理后，導(dǎo)出cdf 文件，使用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件，進(jìn)行圖形匹配及數(shù)據(jù)匹配后，建立供試品指紋圖譜，計(jì)算相似度，并進(jìn)行比較。見圖3—4。

16 批次供試品相似度在0.921～0.998 之間，傳統(tǒng)煙熏干燥法的供試品1～8 所生成的對(duì)照?qǐng)D譜與現(xiàn)代控溫控濕干燥法的供試品9～16 所生成的對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行比較，二者相似度為0.987。均表明兩種初加工方法所生產(chǎn)的當(dāng)歸飲片中醇溶性成分相似度高，沒有明顯差別。見表5—6。

表5 不同初加工方法的當(dāng)歸飲片甲醇提取成分液相指紋圖譜相似度比較

表6 不同初加工方法的當(dāng)歸飲片甲醇提取成分液相指紋圖譜相似度

圖3 不同初加工方法的當(dāng)歸飲片甲醇提取成分液相指紋圖譜

圖4 不同初加工方法的當(dāng)歸飲片甲醇提取成分液相指紋圖譜比較

4 當(dāng)歸飲片水提取成分液相色譜指紋圖譜比較

4.1 色譜條件與“3.1”項(xiàng)下色譜條件一致。見表4。

4.2 對(duì)照品溶液的制備與“3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液的制備一致。

4.3 供試品溶液的制備取當(dāng)歸飲片粉末（過三號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水-甲酸（95∶5）溶液25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，煮沸并保持微沸60 min，放冷，用水-甲酸（95∶5）補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

4.4 精密度考察取同一批當(dāng)歸飲片水提取溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。結(jié)果指紋圖譜相似度的RSD：0.43%；各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.05%～0.88%。表明儀器的精密度良好。

4.5 重復(fù)性考察取同一批當(dāng)歸飲片6 份，制備水提取溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果指紋圖譜相似度的RSD：0.82%；各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.06%～1.69%。表明該分析方法的重復(fù)性良好。

4.6 穩(wěn)定性考察取同一批當(dāng)歸飲片水提取溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、12 和24 min 進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果指紋圖譜相似度的RSD：1.22%；各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.08%～1.68%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4.7 當(dāng)歸飲片水提取成分指紋圖譜的建立及比較分別精密吸取各批供試品溶液10 μL，進(jìn)樣分析，得到各指紋圖譜，統(tǒng)一處理后，導(dǎo)出cdf 文件，使用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件，進(jìn)行圖形匹配及數(shù)據(jù)匹配后，建立供試品指紋圖譜，計(jì)算相似度，并進(jìn)行比較。見圖5—6。

16 批次供試品相似度在0.717～0.995 之間，表明個(gè)別供試品之間水溶性成分存在一定的差異，但傳統(tǒng)煙熏干燥法的供試品1～8 所生成的對(duì)照?qǐng)D譜與現(xiàn)代控溫控濕干燥法的供試品9～16 所生成的對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行比較，二者相似度為0.936，表明兩種初加工方法所生產(chǎn)的當(dāng)歸飲片中水溶性成分較為相似，沒有明顯差別。見表7—8。

圖5 不同初加工方法的當(dāng)歸飲片水提取成分液相指紋圖譜

圖6 不同初加工方法的當(dāng)歸飲片水提取成分液相指紋圖譜比較

表7 不同初加工方法的當(dāng)歸飲片水提取成分液相指紋圖譜相似度

表8 不同初加工方法的當(dāng)歸飲片水提取成分液相指紋圖譜相似度比較

5 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)以阿魏酸對(duì)照品和藁本內(nèi)酯對(duì)照品作為參照物，利用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件進(jìn)行分析，對(duì)兩種初加工方法，即傳統(tǒng)煙熏干燥法和現(xiàn)代控溫控濕干燥法，所生產(chǎn)的當(dāng)歸飲片中揮發(fā)油成分、醇溶性成分和水溶性成分進(jìn)行了指紋圖譜的比較，其相似度分別為0.998、0.987、0.936，表明兩種初加工方法所生產(chǎn)的當(dāng)歸飲片整體化學(xué)特征較為近似，所含成分沒有明顯差別，不會(huì)影響其質(zhì)量和功效?？紤]到環(huán)境保護(hù)和現(xiàn)代規(guī)?；a(chǎn)模式，應(yīng)該提倡現(xiàn)代控溫控濕干燥法作為新型初加工方法，并加以推廣。