劉 凱，王 躍，聶 甜，郝敬全，黃 蓉，江勁波

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙410208

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種惡性漿細(xì)胞腫瘤，是一種病死率較高的難治性血 液 惡 性 腫 瘤［1］。 西 醫(yī) 采 用 以 硼 替 佐 米（bortezomib，BTZ）、來那度胺為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)/鞏固化療方案可最大程度地降低腫瘤負(fù)荷，或聯(lián)合造血干細(xì)胞移植以提高患者的遠(yuǎn)期生存［2］。但是，部分患者易在維持治療階段復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)。中醫(yī)藥對(duì)該病的防治取得了一些初步療效。大量研究表明［3］，龍葵總堿（龍葵的提取物）對(duì)于多種腫瘤有明確的增殖抑制作用。本課題組前期使用含龍葵的中藥復(fù)方治療MM，患者遠(yuǎn)期生存率有所提高［4］。龍葵總堿是從龍葵中分離出的活性生物堿，在MM 中的治療中發(fā)揮著較大作用。本研究從NF-κB/IRF4 信號(hào)途徑促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞凋亡為切入點(diǎn)，運(yùn)用蛋白免疫印跡等分子生物學(xué)方法，研究龍葵總堿對(duì)NF-κB/IRF4 信號(hào)途徑各信號(hào)靶點(diǎn)分子的作用，以期闡明龍葵總堿促骨髓瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為MM 維持階段的新藥開發(fā)提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4周齡SPF級(jí)BALB/c裸鼠90只，體質(zhì)量15～20 g，均為雌鼠，購(gòu)自上海寶特生命科學(xué)發(fā)展有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（湘）2013-0005。

1.2 藥物與試劑RPMI-8226 骨髓瘤細(xì)胞株（武漢興旺生物科技有限公司，批號(hào)：5078）；硼替佐米注射劑（西安楊森制藥有限公司，批號(hào)：160823591，規(guī)格：1.0 mg/支）；龍葵總堿（蕪湖甙爾塔醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：20170602）；RPMI1640 培養(yǎng)基（Gibco 公司，批號(hào)：YXQ-511）；胎牛血清（Gibco 公司，批號(hào)：SH30070）；Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：C1062M）；彩色預(yù)染蛋白marker（江蘇碧云天，批號(hào)：P0078），RIPA蛋白裂解液產(chǎn)品來（Fermentas，批號(hào)：P0013E），Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（江蘇碧云天有限公司，批號(hào)：P0006）；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（南京諾維贊生物科技有限公司，批號(hào)：ab9810）；NF-κB（P65）轉(zhuǎn)錄因子試劑盒（ImmunoWay，批號(hào)：YT2306）；人IκB激酶-α（inhibitor kappa-B alpha，IκB-α）試劑盒（Immuno Way，批號(hào)：YT2417）；人磷酸化IκB 激酶-α（p-IκB-α）試劑盒（批號(hào)：ImmunoWay，YP0151）；干擾素調(diào)節(jié)因子4（interferon regulatory factor 4，IRF4）試劑盒（ImmunoWay，批號(hào)：YP0151）；人β 肌動(dòng)蛋白（β-actin）試劑盒（Abcam，批號(hào)：ab8226）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將RPMI-8226 骨髓瘤細(xì)胞株加入含10%胎牛血清加雙抗（青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L）的RPMI 1640 培養(yǎng)液內(nèi)，置于5% CO2及37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 造模與分組

1.3.2.1 造模 除空白組外，其余各組裸鼠均采用劉瑜法［5］建立骨髓瘤移植小鼠模型，通過傳代，擴(kuò)增，收集呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，SPF 環(huán)境下在每只裸鼠右前肢外側(cè)皮下接種細(xì)胞懸液6×105/0.2 mL。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：取瘤組織進(jìn)行病理檢測(cè)，HE染色后見大量原始、幼稚漿細(xì)胞聚集分布，免疫組織化學(xué)染色后見漿細(xì)胞CD138（+）或κ輕鏈（+），血清免疫固定電泳檢測(cè)到M蛋白。

1.3.2.2 分組 以非造模裸鼠為空白組，模型組隨機(jī)分成5 組。空白組［生理鹽水10 mL/（kg·d），灌胃］，模型組［生理鹽水10 mL/（kg·d），灌胃］，硼替佐米組［硼替佐米0.1 mg/（kg·d），皮下注射］，龍葵總堿高［龍葵總堿50 mg/（kg·d），灌胃］、中［龍葵總堿25 mg/（kg·d），灌胃］、低［龍葵總堿12.5 mg/（kg·d），灌胃］劑量組，每組15只。連續(xù)灌胃14 天（20 g 小鼠龍葵的累及致死量為30 mg）［4］；連續(xù)皮下注射14天，每日2次，每次0.1 mL。

1.3.3 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 先將模型組小鼠的新鮮瘤體組織剪成1～2 mm2大小，放入組織研磨器中加入1～2 mL 生理鹽水；轉(zhuǎn)動(dòng)研磨，研至勻漿；加入10 mL生理鹽水，沖洗研磨器；離心后收集瘤細(xì)胞懸液，棄上清，先用預(yù)冷PBS 收集細(xì)胞，再用改良型1640 培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至1×105個(gè)/mL，每孔50 μL 接種于96 孔培養(yǎng)板（即每孔0.5×104個(gè)/mL），即在RPMI8226 細(xì)胞中所需濃度為：分別設(shè)空白組（僅有培養(yǎng)基）、對(duì)照組（50 μL 培養(yǎng)基+50 μL 細(xì)胞）、藥物組（50 μL 龍葵總堿+50 μL 細(xì)胞），在藥物組分別加入50 μL 已配置的不同濃度龍葵總堿（50 mg/L、25 mgl/L、12.5 mg/L），每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，種于96 孔板，置于37℃、5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～72 h。每孔加入10 μL 試劑盒中7sea-cell counting kit 溶液，同步設(shè)調(diào)零孔，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光值（OD）。

1.3.4 流式細(xì)胞分析法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 同上取瘤組織細(xì)胞，加入500 μL的Binding Buffer至懸浮細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC 混勻后，加入5 μL Propidium Iodide（PI），混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min；在1 h之內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測(cè)。

1.3.5 采用Western blot檢測(cè)p-IκB-α、NF-κB、P65 與IRF4 表達(dá)量 把組織塊放入勻漿器內(nèi)，用干凈的剪刀盡量剪碎。剪碎勻漿器內(nèi)的組織，加入RIPA 裂解液，盡量碾碎組織，30 min 后用移液器移至1.5 mL 離心管中，勻漿器內(nèi)加入適當(dāng)RIPA裂解液（含1%PMSF），置于冰上進(jìn)行勻漿。每20 mg組織加入0.15～0.25 mL裂解液。4℃條件下，離心半徑：13.5 cm，12 000 r/min，離心5 min，取細(xì)胞全蛋白即上清液，分裝于1.5 mL離心管中，-20℃保存，采用Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量（制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)樣品蛋白含量），采用SDS-PAGE 凝膠電泳（清洗玻璃板和灌膠與上樣），后在PVDF 膜上墊3張濾紙，然后將凝膠平鋪于PVDF 膜上，加入用封閉液稀釋的一抗，25℃孵育1 h，加入羊抗兔或抗鼠的第二抗體，同樣用封閉液稀釋，稀釋比為1∶2000，37℃孵育1 h。再次洗膜后通過顯色儀器進(jìn)行ECL 顯影。采用美國(guó)Bio-RadChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，成像圖片利用圖像分析軟件IPP 6.0，對(duì)圖像進(jìn)行累積光密度（IOD）分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓瘤細(xì)胞增殖活性與模型組比較，硼替佐米組，龍葵總堿高、中、低劑量組對(duì)骨髓瘤細(xì)胞抑制率均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與龍葵總堿低劑量組比較，硼替佐米組、龍葵總堿高劑量組對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的抑制率均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；硼替佐米組與龍葵總堿高劑量組對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的抑制率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；硼替佐米組，龍葵總堿高、中、低劑量組在48 h與72 h時(shí)對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示龍葵總堿具有明顯的抑制增殖效應(yīng)，且呈時(shí)間依賴性。見表1。

2.2 骨髓瘤細(xì)胞凋亡與模型組比較，硼替佐米組，龍葵總堿高、中、低劑量組瘤細(xì)胞凋亡率均增高（P＜0.05）。與龍葵總堿低劑量組相比較，硼替佐米組、龍葵總堿高劑量組瘤細(xì)胞凋亡率均增高（P＜0.05）。龍葵總堿高劑量組與硼替佐米組比較，瘤細(xì)胞凋亡率無差異（P＞0.05），提示龍葵總堿具有明顯的促細(xì)胞凋亡作用，且呈劑量依賴性。見表2、圖1。

2.3 骨髓瘤細(xì)胞p-IκB-α、NF-κB.P65 與IRF4 表達(dá)與模型組比較，硼替佐米組、龍葵總堿高、中劑量組p-IκB-α、NF-κB與IRF4表達(dá)均減少（P＜0.05），而其負(fù)調(diào)控因子IκB-α 水平升高（P＜0.05）。與龍葵總堿低劑量組比較，龍葵總堿高劑量組、硼替佐米組瘤細(xì)胞p-IκB-α、NF-κB P65 與IRF4 表達(dá)均減少（P＜0.05）。與硼替佐米組比較，龍葵總堿高劑量組瘤細(xì)胞p-IκB-α、NF-κB、p65 與IRF4 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示龍葵總堿抑制骨髓瘤細(xì)胞IκB-α 磷酸化，引起NF-κB 失活，減少瘤細(xì)胞IRF4 表達(dá)，說明龍葵總堿能通過抑制IκB-α 磷酸化和NF-κB/IRF4信號(hào)通路促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性。見表3、圖2。

表1 各組小鼠骨髓瘤細(xì)胞增殖活性比較（±s） %

表1 各組小鼠骨髓瘤細(xì)胞增殖活性比較（±s） %

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，#表示P＜0.01；與硼替佐米組比較，Δ表示P＜0.05，○表示P＞0.05；與龍葵總堿低劑量組比較，●表示P＜0.05

組別模型組硼替佐米組龍葵總堿低劑量組龍葵總堿中劑量組龍葵總堿高劑量組鼠數(shù)15 15 15 15 15 48 h 72 h抑制率（%）1.12±0.74 27.38±1.67#●11.59±1.79*Δ 16.77±1.53#Δ 28.61±2.98#○●吸光度0.717±0.006 0.574±0.015 0.689±0.033 0.624±0.021 0.569±0.018抑制率（%）0.89±0.26 19.89±2.13*●3.79±4.57*Δ 6.58±3.52*Δ 20.61±2.54#○●吸光度0.748±0.006 0.547±0.012 0.587±0.013 0.569±0.009 0.534±0.022

表2 各組小鼠RPMI-8226骨髓瘤細(xì)胞凋亡率比較（±s）

表2 各組小鼠RPMI-8226骨髓瘤細(xì)胞凋亡率比較（±s）

注：與模型組比較，*表示P＜0.05；與硼替佐米組比較，Δ表示P＜0.05，○表示P＞0.05；與龍葵總堿低劑量組比較，●表示P＜0.05

凋亡率0 13.4±2.14 41.5±2.78*●24.8±0.74*Δ 33.2±1.49*Δ 46.7±0.97*○●組別空白組模型組硼替佐米組龍葵總堿低劑量組龍葵總堿中劑量組龍葵總堿高劑量組鼠數(shù)15 15 15 15 15 15

表3 各組小鼠瘤組織細(xì)胞蛋白相對(duì)含量比較（%）

圖1 各組小鼠骨髓瘤細(xì)胞凋亡率（Q2和Q3為凋亡細(xì)胞）

圖2 各組小鼠β-actin、IκB-α、p-IκB-α、NF-κB、P65、IRF4表達(dá)

3 討論

MM 的自然病程個(gè)體差異較大，具有明顯差異性［6-7］，且尚無法治愈，臨床治療的目的是實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格的完全緩解、分子水平緩解，減少其復(fù)發(fā)、改善其生存質(zhì)量。

中醫(yī)學(xué)在治療MM 方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，多發(fā)性骨髓瘤依據(jù)其臨床癥狀，可將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“骨痹”“骨蝕”等范疇。中藥龍葵（solanum nigrum）具有軟堅(jiān)散結(jié)的作用，龍葵總堿（生物堿）是龍葵抗腫瘤的主要成分，對(duì)胃癌、肝癌、白血病等具有廣泛的抗腫瘤活性［8-9］。

前期研究表明，NF-κB 信號(hào)通路激活是骨髓瘤細(xì)胞凋亡受抑的重要機(jī)制［10-12］。在NF-κB 信號(hào)通路中，其活化與IκB 激酶（IκB kinase，IKK）起了決定性的作用，在上游各種活化信號(hào)的刺激下，IKK 激酶復(fù)合物中的IKKγ作用于下游的IκB-α，將其磷酸化后降解IκB-α，從而釋放出NF-κB，NFκB 活化后在核定位信號(hào)的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)位入核，啟動(dòng)下游靶基因的活化。而IRF4 是NF-κB/IRF4 信號(hào)通路下游重要的靶基因［13］，在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中，IRF4 基因過度表達(dá)，使得患者體內(nèi)腫瘤性漿細(xì)胞負(fù)荷增高［14］。

在本實(shí)驗(yàn)中，將不同濃度的龍葵總堿干預(yù)骨髓瘤小鼠進(jìn)行瘤組織分離，并予以NF-κB、P65、IRF4、IκB- α、p-IκB- α 蛋 白 的 提 取 并 進(jìn) 行Western blot 方法檢測(cè)蛋白，結(jié)果提示龍葵總堿處理后細(xì)胞中NF-κB P65、IRF4、p-IκB-α 蛋白表達(dá)量明顯降低，而負(fù)調(diào)控因子IκB-α 水平明顯升高，其機(jī)制為下游的IκB-α 蛋白被磷酸化后降解IκB-α，從而釋放出NF-κB，NF-κB活化后在核定位信號(hào)的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)位入核，啟動(dòng)下游靶基因的活化，IRF4是NF-κB/IRF4信號(hào)通路下游重要的靶基因，入核后的NF-κB 可與IRF4 基因的啟動(dòng)子結(jié)合，增加IRF4 基因的轉(zhuǎn)錄這說明龍葵總堿對(duì)于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的促凋亡作用與轉(zhuǎn)錄因子IRF4 蛋白和NF-κB 家族中的主要調(diào)控抑制凋亡蛋白P65 的下調(diào)有關(guān)。

綜上所述，龍葵總堿通過抑制磷酸化IκB-α，引起NF-κB失活，促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞IRF4表達(dá)減少，從而促使骨髓瘤細(xì)胞凋亡，其促骨髓瘤細(xì)胞凋亡和抗骨髓瘤細(xì)胞增殖效應(yīng)呈劑量與時(shí)間依賴趨勢(shì)。本研究為更全面地闡釋龍葵總堿抗多發(fā)性骨髓瘤的作用機(jī)制，及進(jìn)一步為尋找中藥治療MM 的作用靶點(diǎn)研究提供了客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。