翁洪亮，李興達，李鳳利，王明敬，徐以燕

(臨沂市中心醫(yī)院，山東 臨沂 276400)

0 引言

術(shù)后認知功能障礙主要是指麻醉后患者定向力、抽象思維、記憶力等功能出現(xiàn)障礙，部分患者還可伴有社會活動減退現(xiàn)象，直接影響其社交能力，成為圍術(shù)期最為多見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的并發(fā)癥[1]。其中七氟醚屬于臨床常用的吸入型麻醉藥物，其安全性已被臨床公認，且手術(shù)期間可穩(wěn)定患者的血流動力學(xué)，并減低肌松藥物的劑量，促進患者盡快蘇醒[2]。但隨著七氟醚的廣泛運用，臨床關(guān)于患者麻醉后躁動以及認知功能障礙發(fā)生率較多的報道隨之增多，但七氟醚可對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮保護功效，但臨床學(xué)者關(guān)于其對認知能力的影響仍存在較大爭議[3-4]。隨后臨床發(fā)現(xiàn)NRG1(神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1)對七氟醚麻醉致認知功能障礙的保護作用存在一定影響，但目前相關(guān)報道較少，本文對此展開實驗，闡述如下。

1 資料與方法

1.1 動物與分組

選擇清潔級成年的30 只SD 大鼠，依據(jù)隨機雙盲法分成三組各10 只，其中正常組：大鼠僅僅尾靜脈注射生理鹽水；模型組：3%七氟醚麻醉大鼠；NRG1 組：大鼠尾靜脈注射10μg/kg 的NRG1，持續(xù)一周。

1.2 方法

創(chuàng)建認知功能障礙大鼠模型：麻醉前，大鼠禁飲禁食，放入透明麻醉吸入箱進行吸入麻醉，將麻醉箱一側(cè)孔與麻醉機(德國Drager 公司，DragerFabius 型)連接，另一側(cè)孔與多功能監(jiān)測儀(美國GE 公司，solar8000M 型)相連，密切關(guān)注流出氣體的麻醉濃度。所有大鼠給予1.5%異氟醚，維持性吸入2h，使麻醉箱維持30%氧濃度。麻醉手術(shù)組大鼠在吸入箱內(nèi)接受麻醉后，快速轉(zhuǎn)移至預(yù)充相同氣體以及吸入麻醉藥的大鼠面罩內(nèi)，實施麻醉與手術(shù)，對其右側(cè)股動脈進行插管，并連接多功能監(jiān)護儀，清除腹部皮膚毛發(fā)，常規(guī)消毒后，給予腹正中切口，執(zhí)行腹腔探查術(shù)，分別檢查其腸道、肝、腎等重要器官，手術(shù)時長2h 左右。術(shù)中密切關(guān)注大鼠動脈血壓、心率等體征，并提供腹腔加溫生理鹽水滴注補液及保溫處理。分別在術(shù)中0.5h、1h、2h 收集其動脈血實施血氣分析。術(shù)中嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，術(shù)后選擇青霉素鈉50u/g 進行腹腔注射，1 次/d，預(yù)防感染，等待傷口完全愈合、拆線。

Morris 水迷宮實驗：水迷宮直徑設(shè)置成130 cm，深度30 cm，水溫度23℃左右，平臺高28 cm，置于第Ⅳ象限。實驗前24h 將大鼠投入水中，使其適應(yīng)實驗環(huán)境條件。整個實驗期間水迷宮外的參照物均維持不變，且要求操作者每次實驗均站在同一位置，實驗時長7d。

定位定航實驗：將大鼠從不同象限面向池壁放入水中，觀察其在120 s 內(nèi)尋找平臺的時長，即是逃避潛伏期。若大鼠120 s內(nèi)未尋找到平臺，潛伏期計成120s。所有大鼠反復(fù)3 次，每次間隔30 s，最后統(tǒng)計平均值?？臻g探索實驗：實驗第7d，撤走平臺，隨意選擇一個象限將大鼠放入水中，觀察大鼠120s 內(nèi)游泳的軌跡。

實驗第7d 后，各組大鼠均經(jīng)股動脈放血，放在室溫下自然凝固，隨后以2500 r/min 進行離心操作，時間控制在10 min，收集血清，放在-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒎叛菘撕蟮拇笫罂焖贁囝^取腦，置于冰上，利用彎眼科鑷將腦組織正中失狀縫位置左右皮質(zhì)打開，得到海馬組織，放入EP 管內(nèi)，存放在-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 觀察指標(biāo)

選擇4%多聚甲醛妥善固定海馬組織，時間24h，分別選擇95%、85%、75%酒精依次脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，蘇木精染色，自來水清洗，選擇1%鹽酸酒精分化，伊紅復(fù)染，最后梯度酒精脫水，二甲苯透明，利用中性樹脂固定，選擇光學(xué)顯微鏡，仔細觀察海馬組織病理變化。

利用ELISA 法測定大鼠海馬組織中Aβ(β淀粉樣蛋白)及APP 的表達，選擇100μg 海馬組織，分別加入蛋白酶抑制劑、烷基硫酸鈉，裂解勻漿，置于4℃條件下，以12000 r/min 離心，時間10 min，取上清液，嚴(yán)格遵照Aβ及APP 試劑盒說明書進行測定。

利用實時熒光定量PCR 法測定Aβ及APP mRNA 的表達，依據(jù)trizol 試劑盒要求提取肺組織中總RNA，并檢測總RNA純度，將獲得的RNA 利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成CDNA，最后利用Realtime PCR 擴增，其結(jié)果選擇2-ΔΔCt 法分析。

western blot 法測定Aβ及APP 蛋白表達，勻漿肺組織，加入適量RIPA 裂解液，離心操作后收集上清液，得到總蛋白。按照BCA 試劑盒說明書要求檢測蛋白濃度。蛋白上樣，實施凝膠電泳，后濕法轉(zhuǎn)PVDF 膜。一抗溶液孵育，4℃過夜；二抗溶液中室溫孵育1-2 h。取膜漂洗，加入ECL 曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

表1 三組Morris 水迷宮實驗結(jié)果的對比

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 三組Morris 水迷宮實驗結(jié)果的對比

NRG1 組的游泳速度、逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、停留時長、游泳距離與其他三組相比差異顯著(P＜0.05)。見表1。

2.2 三組NRG1、Aβ 以及APP mRNA 的對比

NRG1 組的NRG1、Aβ、APP mRNA 與其他三組相比差異顯著(P＜0.05)。見表2。

表2 三組NRG1、Aβ 以及APP mRNA 的對比

3 討論

術(shù)后認知功能障礙作為麻醉后極為常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，臨床癥狀以記憶力降低、注意力不集中、精神錯落等現(xiàn)象為主，部分患者可維持?jǐn)?shù)周甚至數(shù)年，直接影響患者的日常生活以及機體健康[5]。一旦出現(xiàn)后，可延長患者治療周期以及住院時長，不僅給患者機體健康帶來危害，同時可能增加家庭經(jīng)濟負擔(dān)，受到醫(yī)療界重點關(guān)注[6]。

臨床經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)[7]，年齡、手術(shù)、麻醉以及患者身體狀況等因素均是引發(fā)術(shù)后認知功能障礙的主要原因，尤其是在全身麻醉中，其麻醉藥物可對患者大腦意識、學(xué)習(xí)記憶能力造成不同程度的抑制，才可滿足手術(shù)需要的麻醉深度，但術(shù)后藥物的清除程度可能難以快速促進患者大腦神經(jīng)功能恢復(fù)，甚至可能造成β淀粉樣堆積，促進神經(jīng)元凋亡。Xiong 等學(xué)者曾開展實驗[8]，選擇小鼠作為觀察對象，分別給予七氟醚麻醉進行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)顯著的認知缺陷，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)七氟醚能夠?qū)GF 進行干擾，使膽堿能變性，進而引發(fā)認知功能障礙。而認知功能障礙的病理特征以Aβ水平升高為主，而NRG1 作為神經(jīng)分裂癥上的易感基因，尤其是在癲癇或者阿爾茲海默病等精神疾病上，可發(fā)揮一定的神經(jīng)保護效果，因此臨床推測其對麻醉造成的認知功能障礙也存在保護作用，同時可抑制Aβ表達，但尚未有相關(guān)報道證實[9]。本文對此展開實驗，從結(jié)果中看到：NRG1組的游泳速度、逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、停留時長、游泳距離與其他三組相比差異顯著(P＜0.05)。NRG1 組的NRG1、Aβ、APP mRNA 與其他三組相比差異顯著(P＜0.05)，提示NRG1 組水迷宮檢查結(jié)果更優(yōu)，同時可改善NRG1、Aβ、APP mRNA 表達水平。其中Aβ作為認知功能障礙中常見的標(biāo)志物，其與神經(jīng)功能損害存在一定相關(guān)性，而手術(shù)、麻醉、炎癥反應(yīng)等均可直接影響機體中Aβ的代謝，促進其生成，因此Aβ在認知功能障礙的發(fā)生中具有重要意義。Yu 等學(xué)者[10]曾選擇胃部手術(shù)患者作為觀察對象，對比術(shù)后認知功能障礙者與未發(fā)生者的血清Aβ水平，發(fā)現(xiàn)前者水平更高于后者，進一步證實了發(fā)現(xiàn)隨著Aβ水平的增加，患者神經(jīng)功能的損傷隨之加重，甚至引發(fā)認知功能障礙。而NRG1 作為表皮生長因子蛋白，可刺激ErbB 受體酪氨酸激酶，進而控制神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)，直接影響大腦生理功能、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。由于NRG1 中具備表皮生長因子樣核心基團，可促進軸突生長、神經(jīng)元遷移、突觸產(chǎn)生。另外海馬以及皮層的神經(jīng)活動與大腦學(xué)習(xí)記憶存在密切關(guān)聯(lián)性，因此NRG1 可控制多類神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生，并在海馬神經(jīng)以及皮層網(wǎng)絡(luò)活動上具備重要意義，最終影響大腦記憶能力[11]。從本文研究結(jié)果中看到，NRG1 不僅能夠?qū)κ笊窠?jīng)進行保護，同時還可改善認知功能障礙現(xiàn)象，其機制與抑制Aβ堆積有關(guān)。

綜上所述，NRG1 運用于七氟醚麻醉認知功能障礙中效果突出，對認知功能進行保護，為后續(xù)臨床防治提供指導(dǎo)價值。