朱宇，徐文秀，許耀豐，梁國強(qiáng)，朱長樂，張謙

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院蘇州市中醫(yī)院，江蘇 蘇州 215007)

0 引言

代償性心肌肥厚的特征性表現(xiàn)為心臟組織的不平衡生長，心肌細(xì)胞缺血缺氧，從而心肌細(xì)胞萎縮、間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生，研究表明心力衰竭的患者5 年內(nèi)的致死率高達(dá)50%[1]。從心肌肥厚發(fā)展至心力衰竭，心肌細(xì)胞凋亡是重要病理機(jī)制之一，有研究報(bào)道指出川芎嗪有可能減少心肌細(xì)胞凋亡，改善其心功能[2]。本實(shí)驗(yàn)旨在探索川芎嗪對(duì)于壓力負(fù)荷型大鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

選擇健康SPF 級(jí)Sprague-Dawley 雄性大鼠42 只，體重229.0～303.0 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院中醫(yī)藥研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為四組。對(duì)照組：無腹主動(dòng)脈狹窄。模型組：狹窄腹主動(dòng)脈不用藥。低劑量組：狹窄腹主動(dòng)脈，川芎嗪20mg/kg。高劑量組：狹窄腹主動(dòng)脈，川芎嗪80mg/kg。模型組12 只，其余每組10 只。大鼠的飼養(yǎng)、造模、用藥南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院中醫(yī)藥研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心在完成。

1.2 主要儀器、試劑及器械

(1)酶 標(biāo) 儀：芬蘭(Labsystems Multiskan MS)儀器型號(hào)：352型；洗 板 機(jī)：芬蘭(Thermo Labsystems)儀器型號(hào)：AC8；離 心 機(jī)：微量高速離心機(jī)(國產(chǎn)品牌：白洋淀)儀器型號(hào)：TG16W，培 養(yǎng) 箱：儀器型號(hào)：GNP-9080 型，AEG-120 型電子天平(日本)；OlympusBX60 光學(xué)顯微鏡(日本)；DMR+Q550 病理圖像分析儀(德國)。(2)大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-ɑ)elisa 試劑盒，貨號(hào)：DRE20040；大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)基因-2(bcl-2)elisa 試劑盒，貨號(hào)：DRE20331；大鼠Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bax)elisa 試劑盒，貨號(hào)：DRE20154；大鼠白介素-6(IL-6)elisa 試劑盒，貨號(hào)：DRE20064；試劑盒生產(chǎn)廠家：武漢貝茵萊生物技術(shù)有限公司。TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(ROCHE-BM 公司)，批號(hào)12041375001，購自上海蘇尼生物有限公司；注射用青霉素鈉 80 萬u。注射用鹽酸川芎嗪0.12g。(3)手術(shù)器械：各式剪刀12 把，血管鉗，眼科鑷子各6 把，手術(shù)刀片，其余手術(shù)器械若干。

1.3 造模方法

采用腹主動(dòng)脈縮窄法制備壓力超負(fù)荷大鼠模型[3]，對(duì)照組動(dòng)物分離腹主動(dòng)脈但不結(jié)扎，其余步驟同造模組。

1.4 給藥方法

造模成功后低劑量組及高劑量組于造模后第二天分別給予川芎嗪，20 mg/(kg.d)、80mg/(kg.d) 腹腔注射，連續(xù)6 周，對(duì)照組、模型組每天以等容積的生理鹽水肌注，連續(xù)6 周。川芎嗪粉劑臨用時(shí)溶于生理鹽水中。

1.5 光鏡標(biāo)本的制備及病理觀察

稱重結(jié)束后，將左心室組織迅速放置于4%多聚甲醛中備用，由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院江蘇省中醫(yī)院病理科完成光鏡標(biāo)本的制備，病理觀察由兩位病理醫(yī)師采用盲法觀察。

表1 對(duì)比表

1.6 TUNEL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡及凋亡細(xì)胞半定量分析

試劑：In Situ Cell Death Detection Kit,AP(Roche 公司CAT No :11684809910)(1)石蠟切片裱于載玻片上，切片常規(guī)脫蠟。(2)檸檬酸緩沖液修復(fù)8min，磷酸緩沖液沖洗。(3)加蛋白酶消化15 分鐘，磷酸緩沖液洗脫。(4)加堿性磷酸酶標(biāo)記的抗熒光抗體，37℃恒溫箱水浴30 分鐘。(5)BCIP/NBT 顯色10 分鐘，蒸餾水沖洗，適時(shí)終止反應(yīng)。(6)切片晾干，顯微鏡觀察。計(jì)算機(jī)圖像分析儀400 倍視野下，拍攝5 個(gè)陽性視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞核，根據(jù)陽性細(xì)胞所占的百分比作為凋亡細(xì)胞陽性指數(shù)(AI)[4]。AI=凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100。AI 作為心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量的半定量參數(shù)。以上制備過程在江蘇省中醫(yī)院病理教研室完成，病理觀察由兩位病理醫(yī)師采用盲法觀察。

1.7 Western blotting 法檢測(cè)Bcl-2、Bax

Western blotting 法檢測(cè)心肌組織中Bcl-2、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量。取適量心肌組織冰上融化，細(xì)胞裂解液處理，離心并通過電泳將蛋白分開轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉1h，Bax 一抗(1:1000)，Bcl-2 一抗(1:200)37℃溫育過夜，用TBST 洗滌3 次，每次10min，二抗(1:10000),37℃溫育1h，TBST 洗滌3 次，每次10min，滴加熒光底物發(fā)光顯色，用Image Pro Plus 進(jìn)行灰度統(tǒng)計(jì)。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附法定量測(cè)定炎癥介質(zhì)TNF-a、IL-6，操作詳見說明書

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 13.0 for Windows 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，進(jìn)行單因素方差分析，多個(gè)樣本均數(shù)兩兩比較采用q 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心臟組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

(1)對(duì)照組：心肌細(xì)胞形態(tài)大小正常，心肌纖維走行整齊，心肌細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，居細(xì)胞中央，心肌間質(zhì)及微血管等結(jié)構(gòu)正常。(2)模型組、低劑量組、高劑量組鏡下改變類似：心肌細(xì)胞纖維走行整齊，部分心肌細(xì)胞纖維變性，心肌間質(zhì)無明顯水腫，可見凋亡小體。詳見如下附圖。

2.2 凋亡細(xì)胞陽性指數(shù)

正常組凋亡細(xì)胞陽性指數(shù)(6±1.528)%，模型組為(34.10± 7.691)%，低劑量組為(21.05±6.974)%，高劑量組(30.20±7.021)%。正常組與模型組相比兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，正常組與低劑量組及高劑量組分別比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，但模型組與低劑量組及高劑量組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且高劑量組與低劑量組相比兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(Bcl-2/Bax)

正常組與模型組、低劑量組相比兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，正常組與高劑量組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組與低劑量組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組與高劑量組比較兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，高劑量組與低劑量組之間兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，低劑量組與模型組之間無明顯差異。

2.4 腫瘤壞死因子(TNF)和白介素-6(IL-6)

腫瘤壞死因子(TNF):各組與正常組對(duì)比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，低劑量組與模型組對(duì)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與高劑量組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，低劑量組與高劑量組對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。白介素-6(IL-6)：模型組、低劑量組與正常組對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，但高劑量組與正常組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，低劑量組與模型組相比兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，低劑量組與高劑量組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。詳見表1。

3 討論

心肌細(xì)胞凋亡是壓力負(fù)荷后導(dǎo)致心肌重構(gòu)的重要方式，也是最終導(dǎo)致心力衰竭的促進(jìn)因素。壓力負(fù)荷可導(dǎo)致心肌肥厚，加速細(xì)胞凋亡，而抑制凋亡是延緩心力衰竭發(fā)生的重要機(jī)制之一。目前普遍認(rèn)為線粒體凋亡途徑中的Bcl-2/Bax 家族[5]參與了細(xì)胞凋亡，研究[6-7]發(fā)現(xiàn)線粒體膜上的離子通道通過調(diào)節(jié)Cyt-c 的釋放導(dǎo)致Caspase 系統(tǒng)的激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bcl-2 可抑制凋亡的發(fā)生，而Bax 促進(jìn)凋亡的產(chǎn)生，二者的比值直接與凋亡的活躍程度有關(guān)，比值升高說明凋亡受到抑制，比值下降則提示凋亡增加。我們的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型組、低劑量組Bcl-2/Bax 的比值明顯下降，高劑量組Bcl-2/Bax 的比值有所升高，說明模型組及低劑量組心肌細(xì)胞凋亡增加，而高劑量組心肌凋亡有所減少，這從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的角度證明了高劑量川芎嗪抑制了心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并且是通過觀察Bcl-2/Bax的比值有效預(yù)測(cè)的。

腫瘤壞死因子(TNF)是一種中分子量蛋白質(zhì)，由激活的淋巴細(xì)胞受內(nèi)毒素刺激后產(chǎn)生的，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的稱為TNF-a，是介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)的細(xì)胞因子。IL-6 是一種多功能的細(xì)胞因子，可促進(jìn)T 細(xì)胞、B 細(xì)胞分解及活化，刺激免疫反應(yīng)細(xì)胞增殖、分化，能夠誘導(dǎo)急性期反應(yīng)蛋白產(chǎn)生，與局部炎癥反應(yīng)有關(guān)[8]。TNF-a 和IL-6 均是重要的炎癥介質(zhì)，在多種炎癥疾病發(fā)揮重要作用[9-10]。有報(bào)道指出，IL-6 通過抑制caspase-3 的激活而延遲中性粒細(xì)胞(Neu)的凋亡[11]，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞凋亡失衡，從而使炎癥介質(zhì)釋放增多[12]，川芎嗪可以通過使caspase-3 活性降低，從而減少心肌細(xì)胞的凋亡[13]。依據(jù)目前已知的研究結(jié)果可以推斷，炎癥介質(zhì)IL-6 通過抑制Neu 的凋亡而使其凋亡失衡，從而使炎癥介質(zhì)的釋放增多，可是從目前的結(jié)果看，對(duì)比模型組，高劑量組TNF-a、IL-6 較低劑量組下降，故認(rèn)為川芎嗪在對(duì)于抑制Neu 的凋亡方面并無協(xié)同作用，反而可能起著逆轉(zhuǎn)IL-6誘導(dǎo)的Neu 的凋亡。而在心肌細(xì)胞中，我們觀察病理、Bcl-2、Bax 兩種蛋白及其比值，可以清晰的心肌細(xì)胞凋亡明顯下降。故我們大膽猜測(cè)，川芎嗪對(duì)中性粒細(xì)胞及心肌細(xì)胞的凋亡可能有雙相調(diào)節(jié)作用，或者川芎嗪在該兩種細(xì)胞內(nèi)仍有不同的通路發(fā)揮作用，從而起到調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)、抑制細(xì)胞凋亡的作用。