嚴(yán)婭娟，陳新利，楊濤，王留寶，吳暉

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，云南 昆明 650032)

0 引言

葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata (Willd.)Ohwi的干燥根。具有解肌退熱，生津止渴，透疹等功效[1]。當(dāng)前報(bào)道葛根的主要藥效成分為黃酮類(lèi)成分葛根素等[2]，此外葛根也含有活性多糖[3]，其多糖具有抗氧化[3]、抑菌[4]及降血糖[5]等活性，但相關(guān)活性較弱。為此，欲獲得理想的活性多糖可通過(guò)對(duì)多糖分子進(jìn)行一定的修飾[6]?；瘜W(xué)修飾是多糖分子修飾方法中運(yùn)用最廣的一類(lèi)方法，其中硫酸酯化最為常用。天然多糖因SO3-基團(tuán)取代多糖分子中的羥基經(jīng)硫酸酯化修飾后，其活性受理化性質(zhì)改變而改變，甚至有新的活性出現(xiàn)，其中，增強(qiáng)抗腫瘤活性為新出現(xiàn)活性中最常見(jiàn)的。當(dāng)前對(duì)硫酸酯化葛根多糖(PLP)的報(bào)道還未出現(xiàn)，因此本文首先采用氯磺酸-吡啶法修飾PLP，得到硫酸酯化葛根多糖(PLPs)，進(jìn)而考察其抗氧化活性、抑制H22腫瘤細(xì)胞的增殖，對(duì)免疫器官作用及對(duì)血清中IL-2 及TNF-α含量的作用，為今后開(kāi)發(fā)葛根多糖提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

葛根多糖(按文獻(xiàn)方法制得[3])；1,1-二苯基苦基苯肼、菲咯嗪、氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、吩嗦硫酸甲酯(PMS)、還原型輔酶I(NADH)、三吡啶吖嗪(TPTZ)購(gòu)于上海Aladdin 試劑公司；四噻唑藍(lán)(MTT，美國(guó)Amresco 公司)；IL-2 及TNF-α試劑盒(南京建成生物工程研究所)；H22細(xì)胞株(上海博谷生物科技有限公司)；無(wú)水乙醇、K2SO4、氯磺酸、氫氧化鈉(NaOH)、吡啶、甲酰胺、BaCl2、三氯乙酸、二甲基亞砜(DMSO)等試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/c 雄性小鼠，體重20±2g，購(gòu)于中科院上海動(dòng)物中心。

1.2 儀器

UV-3600 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)，501-A 型超級(jí)恒溫器(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司)，CHRIST 凍干機(jī)(德國(guó) Marin Christ 公司)，VS-1300L-U 超凈工作臺(tái)(蘇州安泰公司)，Nicolet IS 10 FT-IR 紅外光譜儀(美國(guó)Nicolet 公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 PLP 硫酸酯化衍生物制備及分析

按照參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行硫酸酯化反應(yīng)[7]：在配有冷凝管的50mL 三口燒瓶中裝入25mL 吡啶，將三口燒瓶放置于冰浴里，將氯磺酸5.0mL 逐滴加入，并高速攪拌反應(yīng)物，在滴加反應(yīng)完成后，冰浴裝置撤去，即得到酯化試劑。精密稱取PLP500mg，溶于20mL N,N-二甲基甲酰胺中。使其充分溶解后加入酯化試劑中，反應(yīng)過(guò)程中保持恒溫水浴加熱(65℃)，分別反應(yīng)1.5、2 及2.5h，反應(yīng)完成后再次放置于冰浴中冷卻，加入4mol/L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至中性，濃縮進(jìn)行反應(yīng)物，加入4 倍量無(wú)水乙醇沉淀，離心(4000 r/min，30min)，沉淀物用乙醇洗滌3 次，加10mL 水溶解沉淀物，透析，濃縮，冷凍干燥，得到3 個(gè)葛根多糖硫酸酯化產(chǎn)物PLPs(PLPs1、PLPs2及PLPs3)，進(jìn)行紅外掃描(4000-400cm-1)。

PLPs 中硫酸根含量采用氯化鋇-明膠法測(cè)定；硫酸基的取代度(DS)按下式計(jì)算：

式中，w 為硫的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.2 PLPs 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 多糖對(duì)超氧陰離子自由基(·O2-)的清除作用

式中：A0為對(duì)照實(shí)驗(yàn)(水代替PLP、維生素C 溶液)的吸光度；A1為樣品實(shí)驗(yàn)的吸光度；A2為樣品干擾實(shí)驗(yàn)(0.1M pH=7.4磷酸鹽緩沖液代替NBT 溶液)的吸光度。

2.2.2 多糖對(duì)羥基自由基(·OH)的清除作用

于試管中加入不同濃度的PLP 樣品(PLP、PLPs1、PLPs2及PLPs3)及維生素C 溶液(0.1、0.5、1.0、1.5、3.0 及 5.0mg/mL)溶液1.0mL，分別加入2.4mL 磷酸鹽緩沖液(0.1M pH=7.4)和0.6mL H2O2 溶液(40 mmol/L)。將反應(yīng)體系混合均勻，10min 后測(cè)吸光度于分光光度計(jì)230 nm 處，PLP、維生素C 溶液和H2O2 溶液用水代替，作空白實(shí)驗(yàn)調(diào)零用。每個(gè)試樣做3 次平行試驗(yàn)取平均值，清除率計(jì)算公式同以上式2。

2.2.3 多糖對(duì)1,1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)的清除作用

于試管中加入不同濃度的PLP 樣品(PLP、PLPs1、PLPs2及PLPs3)及維生素C溶液(0.1、0.5、1.0、1.5、3.0 及 5.0 mg/mL) 1.0mL，分別加入0.2mL DPPH 溶液(0.4mmol/L)，再加入2.0mL 水。將反應(yīng)體系混合均勻，30 min 后測(cè)吸光度于波長(zhǎng)517 nm 處。用無(wú)水乙醇配制DPPH 溶液。PLP、維生素C 溶液用水代替，DPPH溶液用無(wú)水乙醇代替，作空白實(shí)驗(yàn)調(diào)零用。每個(gè)試樣做3 次平行試驗(yàn)取平均值。清除率計(jì)算公式同以上式2。

2.3 PLPs 體內(nèi)抑制H22 腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

從H22荷瘤小鼠腹腔中抽取腫瘤細(xì)胞液，用生理鹽水調(diào)節(jié)其細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL，臺(tái)酚藍(lán)試劑進(jìn)行染色，于顯微鏡下觀察，細(xì)胞存活率不小于95%。取潔凈級(jí)BALB/c 的無(wú)菌雄性小鼠(20±2g)，右腹股溝皮下植入0.1mL 瘤細(xì)胞懸液。植入后，小鼠飲食自由。24 h 后，將小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組：模型組(0.9% NaCl)；陽(yáng)性對(duì)照組(Cyclophosphamide，Cy，30mg/kg)；PLP、PLPs1、PLPs2及PLPs3高、低劑量組(200、100 mg/kg)，每組10 只。每天用相應(yīng)藥物灌胃一次，10 天后稱取重量，將小鼠處死，各組于小鼠眼眶靜脈叢取血，離心，并分離血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)操作，計(jì)算血清中TNF-α和IL-2含量。同時(shí)稱量腫瘤、脾臟及胸腺重量。計(jì)算腫瘤抑制率、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。

Wc 為對(duì)照組平均腫瘤重量，Wt 為實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤重量。

“江涵秋色碧潭潭，飲馬胡兒不敢南?！鼻锔邭馑畷r(shí)，站在飲馬河古渡口，看大河茫茫，奔流而下，歷史的慷慨激昂如在眼前。是誰(shuí)讓我與這樣一條大河相伴，一生它都會(huì)在我夢(mèng)里奔流不息。曾幾何時(shí)，兩岸蔥翠的柳條邊，被砍伐殆盡，日夜轟鳴的抽沙船，攪動(dòng)著它的安寧，超載的運(yùn)沙車(chē)，碾壓著坎坷的路面往來(lái)穿梭……每次路過(guò)長(zhǎng)吉公路北線勝利橋時(shí)，看著千瘡百孔的河道和不復(fù)清澈的河水，我的內(nèi)心，都如失群的孤鳥(niǎo)般不停地哀泣。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 建立數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料所有數(shù)據(jù)均以±s 表示，組間樣本均數(shù)差異比較選用T 檢驗(yàn)，以α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 PLPs 硫酸基取代度

PLP 及PLPs 硫含量及取代度見(jiàn)表1，紅外光譜圖見(jiàn)圖1。由圖1 可知，C-O-S 的拉伸振動(dòng)為822 cm-1處的吸收峰，這是硫酸酯鍵的特征吸收峰，表明多糖鏈上已連接了硫酸基團(tuán)。且PLPs3在此處的吸收峰強(qiáng)度高于PLPs1及PLPs2，說(shuō)明PLPs3中硫酸基含量最高[9]。

由表1 可知，多糖硫含量受硫酸酯化影響而明顯增加；硫酸基含量受不同反應(yīng)時(shí)間的PLPs 衍生物隨著反應(yīng)時(shí)間增加的影響而增加、取代度也隨之增大。且有研究表明，硫酸酯化多糖的抗腫瘤活性受硫含量與DS 值大小的直接影響，一般認(rèn)為DS 介于0.8～1.7 之間均具有良好的抗腫瘤活性[10]，取代度位0.88～1.60 之間的PLPs，按理應(yīng)該具有良好的抗腫瘤活性。

表1 葛根多糖硫含量及取代度

3.2 PLP 抗氧化實(shí)驗(yàn)

3.2.1 PLPs 對(duì)超氧陰離子自由基清除活性的影響

不同濃度的PLPs 對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2 可知，PLP 及硫酸化衍生物 PLP s1、PLP s2、PLP s3對(duì)O2-自由基清除活性呈一定的量效關(guān)系。PLP-3 清除O2-活性稍高于PLP、PLP s1及PLP s2，但都弱于Vc。

圖1 PLP 紅外光譜

表2 PLPs 對(duì)H22 荷瘤小鼠腫瘤抑制率、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)的影響

圖2 葛根多糖及其硫酸化組分清除O2-活性

3.2.2 PLPs 對(duì)羥基自由基清除活性的影響

不同濃度的PLP 對(duì)羥基自由基的清除作用結(jié)果見(jiàn)圖3。PLP 及PLPs 對(duì)·OH 自由基具有明顯的清除活性。其中，PLPs3清除·OH 自由基活性效果最強(qiáng)，當(dāng)其濃度達(dá)到3.0 mg/mL 時(shí)，其清除率為65.6%。

圖3 葛根多糖及其硫酸化組分清除·OH 活性

3.2.3 PLPs 對(duì)DPPH·基自由基清除活性的影響

不同濃度的PLP 對(duì)DPPH·自由基的清除作用結(jié)果見(jiàn)圖4，圖4 表明PLP 及PLPs 對(duì)DPPH·自由基清除活性不一，但均具有清除活性。PLPs1對(duì)DPPH·自由基的清除作用效果為最弱，PLPs3清除活性最強(qiáng)。

圖4 葛根多糖及其硫酸化組分清除DPPH·活性

3.3 PLPs 體內(nèi)抗H22 腫瘤細(xì)胞增殖活性

表2 結(jié)果表明，PLP 及PLPs 均能抑制H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞增殖，但其活性均沒(méi)有環(huán)磷酰胺(Cy)好；未經(jīng)修飾的PLP 活性均不如3 個(gè)硫酸酯化衍生物PLPs，且其活性與取代度具有一定相關(guān)性。環(huán)磷酰胺雖然抗腫瘤活性較好，卻會(huì)顯著抑制免疫器官的作用，因而往往致使用者免疫力低下[11]。而PLP 及PLPs 均能較好提高免疫器官指數(shù)，從而可使使用者免疫能力得到改善。

3.4 PLPs 對(duì)H22 荷瘤小鼠血清TNF-α 及IL-2 含量的影響

如表2 所示，與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、PLP 高劑量組及PLPs 各劑量組對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)TNF-α及IL-2 含量均均有顯著性提高作用，其作用趨勢(shì)與H22腫瘤抑制率成一定關(guān)聯(lián)性。

4 小結(jié)與討論

本研究表明天然葛根多糖雖具有一定抗腫瘤活性，但其活性不佳；經(jīng)硫酸酯化修飾后可顯著提高其抗腫瘤活性，且PLPs因硫酸基取代度的不同，其活性亦有一定差別。通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)中3 個(gè)不同取代度的PLPs 抗腫瘤活性的比較可知，PLPs 活性的高取代度優(yōu)于PLPs 活性的低取代度，但取代度之間的關(guān)聯(lián)性和相關(guān)范圍還需進(jìn)一步研究得到證實(shí)。

機(jī)體重要免疫器官-胸腺及脾臟指數(shù)受PLP 及PLPs 影響均能得到改善，胸腺發(fā)揮免疫作用是通過(guò)產(chǎn)生T 淋巴細(xì)胞以及胸腺素；脾臟與體液免疫關(guān)系密切[12]；另外，H22荷瘤小鼠血清中IL-2及TNF-α的含量受PLP 及PLPs 影響而增加，IL-2 通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗癌活性[13]，因此，增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能從而發(fā)揮抗腫瘤作用可能為PLPs 抗腫瘤作用機(jī)制之一。荷瘤小鼠血清中具有強(qiáng)烈殺傷腫瘤細(xì)胞的TNF-α含量受PLPs 影響作用而增加，說(shuō)明PLPs 亦通過(guò)促進(jìn)TNF-α的釋放而發(fā)揮抗腫瘤作用。