蹇淑娟，涂立，鄒家森，朱仕群，覃遠(yuǎn)漢

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西南寧530021

腎間質(zhì)纖維化（RIF）被認(rèn)為是慢性腎臟疾病發(fā)展為腎衰竭的最常見途徑，是各類腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎病的必然結(jié)果，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。研究［1］提示，腎小管上皮細(xì)胞（RTEC）損傷可能是RIF 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素和中心環(huán)節(jié)，其中缺氧為RTEC 損傷的重要原因之一，可導(dǎo)致壞死性凋亡的發(fā)生。壞死性凋亡是一種不依賴caspase 機(jī)制、兼有壞死和凋亡雙重特征的程序性壞死，它的發(fā)生主要取決于絲氨酸-蘇氨酸激酶3（RIPK3）的激活［2］。研究［3］顯示，RIPK1 在核心信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)中也發(fā)揮了重要的作用。受體交互作用蛋白1（RIP1）和RIP3作為壞死性凋亡的上游分子信號(hào)，當(dāng)壞死性凋亡啟動(dòng)后，RIP1 發(fā)生泛素化、去泛素化、磷酸化等一系列反應(yīng)；而當(dāng)?shù)鞍准っ? 被抑制時(shí)，RIP1 與RIP3 發(fā)生相互磷酸化，形成壞死性凋亡小體，從而介導(dǎo)壞死性凋亡的發(fā)生［4］。因此，RIP1、RIP3不僅是壞死性凋亡發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵信號(hào)，也是壞死性凋亡的標(biāo)志性蛋白。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是一類核轉(zhuǎn)錄因子，屬Ⅱ型核激素受體超家族成員，根據(jù)編碼基因的不同可分為三種細(xì)胞亞型，分別為PPARα、PPARβ 和PPARγ，其中PPARγ 參與了正常腎臟的發(fā)育、脂質(zhì)代謝，具有調(diào)節(jié)水鹽重吸收和調(diào)控腎血流量并激活腎素血管緊張素系統(tǒng)等生理功能。研究［5］顯示，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）作為腎纖維化的靶點(diǎn)，它的激活使得腎小球的纖溶酶原激活物的活性顯著降低，導(dǎo)致腎小球系膜基質(zhì)沉積。研究［6］發(fā)現(xiàn)，TGF-β 與 PPARγ 之間也存在一定的聯(lián)系，當(dāng)RTEC 受到 TGF-β1攻擊時(shí)，PPARγ 的表達(dá)和活性顯著降低。我們前期研究［7］顯示，調(diào)控PPARγ 基因的表達(dá)可減輕RTEC 的損傷程度，調(diào)控方式包括添加PPARγ 激動(dòng)劑和抑制劑，以及通過轉(zhuǎn)染慢病毒載體進(jìn)行基因干擾［8］，從而改變PPARγ 的表達(dá)水平。然而，在缺氧誘導(dǎo)的RTEC損傷中，有關(guān)PPARγ基因表達(dá)與細(xì)胞壞死性凋亡的關(guān)系，目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。2019 年 10 月-2020 年 9 月，我們通過建立 RTEC壞死性凋亡模型，利用基因干擾技術(shù)沉默內(nèi)源性和轉(zhuǎn)染外源性 PPARγ 基因，觀察了 PPARγ 基因過表達(dá)/沉默對(duì)缺氧誘導(dǎo)的RTEC 壞死性凋亡標(biāo)志物表達(dá)的調(diào)控作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及培養(yǎng)方法 大鼠RTEC 細(xì)胞株（NRK-52E）購于上海細(xì)胞庫，用含10%超濾胎牛血清和1%雙抗的高糖DEME 培養(yǎng)基放置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞分組、轉(zhuǎn)染及模型構(gòu)建 將RTEC 細(xì)胞培養(yǎng)融合至80%左右時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞消化為單個(gè)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度傳入細(xì)胞培養(yǎng)瓶并隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、缺氧損傷組、過表達(dá)組和沉默組。其中，過表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)PPAYγ 基因的外源性LV-PPARg 病毒，沉默組細(xì)胞轉(zhuǎn)染沉默PPAYγ 基因的內(nèi)源性LV-PPARg-RNAi 病毒。過表達(dá)組和沉默組的慢病毒載體均由上海吉?jiǎng)P基因公司構(gòu)建，轉(zhuǎn)染后經(jīng)熒光顯微鏡和PCR 驗(yàn)證效果，轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%以上。待細(xì)胞再次生長(zhǎng)融合至70%左右時(shí)，正常對(duì)照組不做任何處理，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；缺氧損傷組、過表達(dá)組以及沉默組放置于含95%N2和5%CO2混合氣體缺氧小室中，密封缺氧培養(yǎng)48 h。

1.3 各組細(xì)胞中PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。取各組細(xì)胞，TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求的標(biāo)準(zhǔn)條件反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，以GAPDH 為內(nèi)參，應(yīng)用熒光定量試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。引物序列如下：GAPDH 上游引物為5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′，下 游 引 物 為 5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′；PPARγ 上游引物為5′-GGAGCCTAAGTTTGAGTTTGCTGTG-3′，下游引物為 5′-TGCAGCAGGTTGTCTTGGATG-3′；RIP1上游引物為5′-CTTCTGCTCTCCTGGCTCATTGTG-3′，下游引物為5′-CGGTTGCTGATCTGGACGGTTG-3′；RIP3 上游引物為 5′-GGTGGTAGACAAGACCTCACTAATTCG-3′，下游引物為5′-ATGCGTCATTAACTCCTTCAGTCCTTC-3′；TGF-β 上游引物為 5′-ATGGTGGACCGCAACAACGC-3′，下游引物為 5′-CTGGCACTGCTTCCCGAATGTC-3′。建立 20.0 μL反應(yīng)體系：2.5×Real MasterMix/SYBR solu-tion 9.0 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.8 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.8 μL，cDNA 2 μL，超純水7.4 μL。RT-qPCR 反應(yīng)條件：50 ℃預(yù)熱2 min，95 ℃激活10 min，95 ℃循環(huán)40次，每次15 s，60 ℃退火30 s。以2-ΔΔCt表示細(xì)胞中目的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 各組細(xì)胞中 PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β 蛋白檢測(cè) 采用Western blotting 法。取出缺氧小室中的各組細(xì)胞，放入常規(guī)培養(yǎng)箱中復(fù)氧1 h，然后按照免疫沉淀測(cè)定（RIPA）蛋白裂解液說明書分別提取各組的總蛋白，以二喹琳甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將提取的各組蛋白，在4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min 后分別吸取上清，按照 4：1 比例加入蛋白上樣緩沖液輕柔吹打混勻，100 ℃水浴5 min變性。以GAPDH 為內(nèi)參，每孔樣本上樣量為18 μg，行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠泳（SDS-PAGE），電泳結(jié)束后按照不同蛋白分子量確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），5%脫脂牛奶室溫下封閉1.5 h 后，分別置于特異性一抗溶液中，4 ℃孵育16～18 h，后予以TBST溶液洗膜3次，每次10 min；再置于二抗溶液中室溫下孵育1.5 h，TBST 溶液洗膜3次，每次10 min。以發(fā)光液覆蓋PVDF 膜，掃描PVDF 顯影，應(yīng)用Alpha View 軟件測(cè)定各蛋白的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值來反映各組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 各組細(xì)胞中PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較見表1。

表1 各組細(xì)胞中PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（）

表1 各組細(xì)胞中PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：與正常對(duì)照組相比，*P＜0.05；與缺氧損傷組相比，#P＜0.05。

組別RIP1 mRNA RIP3 mRNA TGF-βmRNA對(duì)照組缺氧損傷組過表達(dá)組沉默組1.00±0.00 1.53±0.08*1.31±0.1*#1.79±0.13*#PPARγ mRNA 1.00±0.00 0.40±0.09*0.73±0.11*#0.14±0.06*#1.00±0.00 1.47±0.11*1.23±0.08*#1.78±0.09*#1.00±0.00 1.42±0.09*1.24±0.08*#1.62±0.08*#

2.2 各組細(xì)胞中 PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 各組細(xì)胞中PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見表2。

表2 各組細(xì)胞中PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

表2 各組細(xì)胞中PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：與正常對(duì)照組相比，*P＜0.05；與缺氧損傷組相比，#P＜0.05。

組別對(duì)照組缺氧損傷組過表達(dá)組沉默組TGF-β蛋白0.46±0.11 0.97±0.14*0.69±0.08*#1.26±0.15*#PPARγ蛋白1.03±0.02 0.49±0.02*0.74±0.03*#0.26±0.01*#RIP1蛋白0.47±0.05 0.97±0.04*0.67±0.03*#1.22±0.03*#RIP3蛋白0.35±0.07 1.01±0.09*0.64±0.11*#1.24±0.08*#

3 討論

RIF 是各類腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎病的必然途徑和顯著病理表現(xiàn)，其發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，目前認(rèn)為RTEC 損傷與RIF 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究［4］發(fā)現(xiàn)，在缺氧誘導(dǎo)的 RTEC 損傷中，激動(dòng)劑羅格列酮可上調(diào)PPARγ 的蛋白表達(dá)而減輕RTEC 的損傷。在大鼠膿毒癥模型中，激活PPARγ 可預(yù)防敗血癥大鼠的壞死和凋亡，保護(hù)心肌免受膿毒癥所致?lián)p傷［9］。黃酮類非瑟酮通過調(diào)節(jié) PPARγ 以減輕炎癥和細(xì)胞凋亡，抑制基于MAPK 的分子機(jī)制從而保護(hù)心臟［10］。以上研究結(jié)果提示，PPARγ 的表達(dá)改變與壞死性凋亡關(guān)系密切。不僅如此，PPARγ 在調(diào)節(jié)腎臟生理功能中起重要作用［11］，如PPARγ 基因突變可導(dǎo)致不正常的脂質(zhì)和糖代謝、胰島素抵抗，從而發(fā)展成肥胖引起的 2 型糖尿病［12～13］；敲除 PPARγ 基因的小鼠出現(xiàn)腎功能不全，肌酐清除率降低，伴有纖維化和腎小管擴(kuò)張［14］；羅格列酮作為配體激活PPARγ，減輕了膿毒癥時(shí)的炎癥反應(yīng)，減少腎臟細(xì)胞凋亡，改善了腎臟功能，對(duì)大鼠膿毒癥急性腎損傷具有保護(hù)作用［15］。

凋亡和壞死是細(xì)胞死亡的兩種病理類型。凋亡是程序控制的細(xì)胞死亡，在發(fā)育過程中和生理細(xì)胞更新過程中受到嚴(yán)格控制；壞死發(fā)生在創(chuàng)傷中，主要以不受控制的方式發(fā)生［16］。而壞死性凋亡是一種具有壞死特征的新型細(xì)胞死亡模式，在形態(tài)學(xué)上以細(xì)胞器腫脹和細(xì)胞膜破裂為特征，同時(shí)又是一種可調(diào)控的不依賴caspase 的非免疫細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡，其中，RIP1、RIP3 是該途徑的關(guān)鍵參與者［17～18］。RIPK3 的激活，對(duì)caspase-8 分子的抑制將外源性凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞死亡的壞死模式；RIPK1 則抑制細(xì)胞凋亡和壞死的通過激酶獨(dú)立的功能，對(duì)預(yù)防炎癥有重要作用［19～20］。壞死性凋亡作為一種重要的細(xì)胞死亡模式，它的發(fā)生發(fā)展及阻斷機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過程，于腎臟而言，抑制腎臟細(xì)胞的壞死性凋亡可以減輕藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性以及炎癥反應(yīng)的表達(dá)，對(duì)腎臟起到了一定的保護(hù)作用［21］。

上述研究提示，PPARγ 的表達(dá)水平和RTEC 壞死性凋亡均有可能參與了腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。PPARγ 作為參與調(diào)節(jié)腎臟許多重要生理功能的核轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)腎臟受損時(shí)可能也會(huì)引起其表達(dá)水平的變化。而RIP1、RIP3作為壞死性凋亡的特異性蛋白，TGF-β 作為腎纖維化介導(dǎo)因子，它們與PPARγ之間是否存在聯(lián)系？PPARγ 表達(dá)水平的改變是否會(huì)影響RTEC 壞死性凋亡？為了探討這個(gè)問題，本研究通過建立缺氧誘導(dǎo)RTEC 壞死性凋亡模型，利用慢病毒沉默內(nèi)源性和轉(zhuǎn)染外源性PPARγ 基因，調(diào)控其在RTEC 中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與缺氧損傷組比較，過表達(dá)組細(xì)胞中PPARγ 的mRNA 及其蛋白表達(dá)量均顯著增高，沉默組細(xì)胞中PPARγ 的mRNA及其蛋白表達(dá)量均顯著降低；過表達(dá)組細(xì)胞中RIP1、RIP3、TGF-β的mRNA及其蛋白表達(dá)量均顯著降低，而沉默組細(xì)胞中RIP1、RIP3、TGF-β 的mRNA及其蛋白表達(dá)量均顯著增高，提示上調(diào)PPARγ 的基因表達(dá)可以減輕缺氧所致的RTEC 壞死性凋亡，而下調(diào)PPARγ的基因表達(dá)則加重RTEC壞死性凋亡。

綜上所述，在缺氧誘導(dǎo)的RTEC 壞死性凋亡中，PPARγ基因表達(dá)降低；過表達(dá)PPARγ基因?qū)θ毖跽T導(dǎo)的RTEC 壞死性凋亡有抑制作用，而沉默PPARγ基因則有促進(jìn)作用。