劉天奇，高紅秀，謝 威，張雪晴，陳娜娜，梅雪鋒，邢佳妮，徐振華，張忠臣

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，五常水稻研究所，黑龍江 哈爾濱 150229)

水稻是世界上重要的糧食作物，20世紀60年代的“綠色革命”提高了全球稻米的產(chǎn)量，開辟了水稻研究的新領(lǐng)域[1-4]。但是，為了實現(xiàn)綠色革命的最大生產(chǎn)潛力，需要大量的氮肥[5]。然而大量的氮肥施用會造成氮素的流失[6]，同時引起湖泊和水庫的富營養(yǎng)化[7]、地下水污染[8]和大氣污染[9]等環(huán)境問題，而不同品種間水稻氮肥利用率差異可達到79.6%[10]。因此，篩選氮素應(yīng)答基因來提高氮素利用率將成為今后科研的重點。

氮素作為一種水稻生長發(fā)育必需的營養(yǎng)元素，會顯著影響水稻分蘗數(shù)目[11]、淀粉品質(zhì)[12]、糖類[13-14]和氨基酸含量[15-16]等生理特性。長期以來，氮素管理作為栽培調(diào)控的重要手段，對于水稻的生長發(fā)育產(chǎn)生的影響一直是研究的重點。盡管目前一些關(guān)于水稻的氮素應(yīng)答基因NRT1.1B[17]、OsNRT1.1A/OsNPF6.3[18]、OsNRT2.1[19]、OsNRT2.3[20]、OsPTR9[21]等已被發(fā)現(xiàn)，但氮素應(yīng)答機制并沒有完全解釋清楚，在栽培上的應(yīng)用也不夠充分。

轉(zhuǎn)錄組分析是通過測序技術(shù)闡述同一細胞在不同生長時期及生長環(huán)境下基因差異表達的情況應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)[22]。鑒于目前關(guān)于水稻分蘗期氮素應(yīng)答的研究還不夠完善，在本研究中，筆者開展了氮處理下水稻分蘗期基因表達的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)分析，目的是確定調(diào)控分蘗期水稻葉片的氮素響應(yīng)基因，為利用氮素應(yīng)答模式精準調(diào)控氮素影響水稻栽培管理提供新思路。

1 材料和方法

1.1 植物生長條件

本試驗在哈爾濱東北農(nóng)業(yè)大學(xué)進行。首先將水稻品種五優(yōu)稻4號(WYD4)種子用30%次氯酸鈉滅菌30 min后放入錐形瓶中，然后用0.6%的硝酸在室溫下處理打破休眠狀態(tài)，移入30 ℃培養(yǎng)箱催芽，在溫室中播種。三葉一心期移栽至0.24 m2的白盆中，插秧規(guī)格為3株苗/穴，插秧方式為10 cm×10 cm。

1.2 氮素處理

盆栽土壤的基礎(chǔ)肥力為全氮1.51 g/kg、速效氮158.76 mg/kg、速效磷50.65 mg/kg、速效鉀177.68 mg/kg、pH值7.52、有機質(zhì)3.11%。處理組(Nitrogen treatment，Nt)基肥和分蘗肥分別為純氮72，54 kg/hm2，對照組(Control，CK)不施氮，其他養(yǎng)分含量相同，水分管理為常規(guī)管理。每個時間點設(shè)置3次生物重復(fù)，以確保試驗的可靠性。

1.3 樣品制備

在氮素處理7，14，21 d后拍照，分別收集葉片在液氮保存30 min后放入試管中，并相應(yīng)地命名為CK7d、CK14d、CK21d、Nt7d、Nt14d、Nt21d，然后干冰保存下快遞至安諾公司進行RNA提取和轉(zhuǎn)錄組分析，使用NanoPhotometer?分光光度計(Implen，CA，USA)和Qubit RNA分析試劑盒，在Qubit 3.0熒光儀(Life Technologies，CA，USA)中測定RNA的純度和濃度。使用Agilent 2100 RNA Nano 6000檢測試劑盒(Agilent Technologies，CA，USA)檢測RNA樣品的完整性和濃度。庫成簇(Clustering)與測序使用 HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS(Illumia)試劑在cBot上生成簇。隨后在 HiSeq 測序平臺上運行雙端測序程序(PE)，得到 150 bp 的雙端測序 reads。GffCompare可用于比較裝配有RNA-seq數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄組和參考轉(zhuǎn)錄組。通過HTSeqv 0.6.0對每個樣本中每個基因的Reads計數(shù)(http：//www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/overview)。然后計算FPKM(每千堿基每米的片段映射讀數(shù))來估計每個樣本中基因的表達水平。

1.4 差異基因表達分析

DESeq2 針對2組之間有生物學(xué)重復(fù)樣本的差異表達分析，比較處理組與參考組，并選取|log2Ratio|≥1和q<0.05的基因作為差異顯著表達基因，得到上下調(diào)基因個數(shù)。DESeq2 理論基礎(chǔ)為Count值服從負二項分布假設(shè)，主要考慮相同表達水平的基因可能具有相似的離差以及每個基因的表達特性。利用線性回歸估計基因在各樣品中的表達強度，并用Wald test 計算每個基因在2組樣品中不差異表達的概率值P-value，并通過BH方法對P-value進行校正得到q-value。

1.5 功能富集分析

對于差異基因的GO(Gene Ontology，http：//geneontology.org/)富集分析根據(jù)計算每個GO Term的基因數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在差異表達基因中顯著富集的GO Term。計算得到的P-value通過校正之后，以q≤0.05為閾值，滿足此條件的GO term定義為在差異表達基因中顯著富集的GO term。通過GO功能顯著性富集分析能確定差異表達基因行使的主要生物學(xué)功能。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http：//www.kegg.jp/)是基因組破譯方面的數(shù)據(jù)庫。在給出染色體中一套完整基因的情況下，它可以對蛋白質(zhì)交互(互動)網(wǎng)絡(luò)在各種細胞活動起的作用做出預(yù)測。對KEGG 中每個Pathway應(yīng)用超幾何檢驗進行富集分析，找出差異表達基因中顯著性富集的Pathway。

1.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

應(yīng)用 STRING 蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫(http：//string-db.org/)中的互作關(guān)系，針對數(shù)據(jù)庫中包含的物種，直接將目標基因集(比如差異基因list)映射到物種的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)文件可以直接導(dǎo)入Cytoscape軟件，并根據(jù)目標基因集中的基因?qū)傩詫W(wǎng)絡(luò)進行可視化編輯。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

圖表和圖像的數(shù)據(jù)分析利用WPS Office(11.1.0.9339)和Adobe Photoshop(13.0.20120315)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮處理引起分蘗期WYD4植株表型變化

氮素處理后7，14，21 d表型可以看出，施氮后WYD4植株顏色明顯比未施氮植株深(圖1-A-F)，說明葉片顏色群體長勢差異與氮素處理后不同時間點不同代謝途徑對氮素應(yīng)答有關(guān)。采集分蘗期WYD4葉片進行了轉(zhuǎn)錄組分析，期望發(fā)現(xiàn)水稻對氮素的應(yīng)答模式來進行氮素管理，為水稻栽培提供參考。

2.2 氮處理引起分蘗期水稻基因表達變化

對照組和處理組在3個時間點(7，14，21 d)分別提取WYD4嫩綠葉片RNA，得到純化的mRNA并生成cDNA用于轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照相比，施氮的WYD4葉片有3 870個差異表達基因(DEGs，Differential expression genes)(圖1-G)。

結(jié)果表明，在氮處理的早期(7 d)，存在大量的DEGs(2 278，圖1-G)，但隨著處理時間的延長，DEGs的數(shù)目反而在不斷減少，在這3個時間點上，上調(diào)基因的數(shù)目比下調(diào)基因的數(shù)目少，說明氮素早期應(yīng)答的基因較多，而且氮素處理抑制了氮素應(yīng)答的基因表達。

通過層次聚類分析并繪制了Venn 圖和Volcano圖(圖2)，展示了不同時間氮處理下DEGs表達模式的異同。這些圖表顯示7，14，21 d的DEGs有相似的表達模式但也有所不同(圖2-A)。7 d時，部分DEGs上調(diào)，部分DEGs下調(diào)，且差異基因數(shù)目最大?？赡芘c氮處理的短期反應(yīng)有關(guān)。此外，25個DEGs在3個時間點都出現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄變化，表明這些基因可能在整個氮處理期間都發(fā)揮作用(圖2-A)，14 d是基因表達差異最大的時間點，這可能與氮素發(fā)揮作用的時間有關(guān)(圖2-B)。

2.3 氮素應(yīng)答DEGs的GO和KEGG富集分析

GO分析發(fā)現(xiàn)氮應(yīng)答的DEGs主要富集在代謝過程、細胞過程、細胞組分、催化活性和結(jié)合等方面(圖3)，這些結(jié)果對于氮素在水稻分蘗期介導(dǎo)氧化還原、物質(zhì)代謝和酶活性調(diào)節(jié)等方面具有重要的指導(dǎo)意義。進一步通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)DEGs(q_value均小于0.05)顯著富集在半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等代謝途徑(圖4)，共有22個DEGs與這些途徑顯著相關(guān)(圖5，6)。

2.4 氮素對氨基酸途徑的影響

氨基酸是一種重要的生物分子，是蛋白質(zhì)合成的基本單元。發(fā)現(xiàn)氮素處理會顯著影響很多與氨基酸途徑有關(guān)的基因表達，這些差異表達的基因顯著影響丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝，因為氮元素對氨基酸尤為重要，所以進一步分析了分蘗期WYD4葉片的相關(guān)基因表達(圖5)。

研究發(fā)現(xiàn)，AsnB、ASL、NadB、GOT2、GLT1和GLnA的顯著差異表達主要表現(xiàn)在氮素處理后期21 d，說明水稻可能是通過上述6個基因氮素處理后期的應(yīng)答來調(diào)控丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝途徑。

2.5 氮素對糖類代謝的影響

碳氮循環(huán)一直是光合植物研究的重點，氮素如何具體調(diào)控糖類代謝還需完善。研究結(jié)果表明，氮素在初期對半乳糖代謝有顯著影響，而在中期對氨基糖和核苷酸糖的代謝有顯著影響(圖4)，對以上2種代謝途徑的差異表達進行了進一步的研究。

研究發(fā)現(xiàn)，galA、HK、galE(LOC_Os05g51670)、malZ的差異表達主要表現(xiàn)在氮處理前期7 d，HEXA_B、GNPNAT1、GlmS、UAP1、RGP、XYL4、AXS、UXS1、UGDH、RHM、galE(LOC_Os09g15420)和GAUT的差異表達主要表現(xiàn)在氮處理中期14 d，而且氮處理前期(7 d)和氮處理中期(14 d)差異表達上調(diào)的基因數(shù)遠多于差異表達下調(diào)的基因數(shù)(圖6)，說明水稻可能是通過上述16個基因氮素處理前中期的應(yīng)答來調(diào)控半乳糖、氨基糖和核苷酸糖的代謝途徑的。

2.6 氮素應(yīng)答的互作蛋白

STRING是收錄多個物種預(yù)測的和試驗驗證的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作的數(shù)據(jù)庫，通過數(shù)據(jù)庫對氮處理下分蘗期水稻葉片進行互作蛋白預(yù)測，發(fā)現(xiàn)了35種相互作用的蛋白質(zhì)，其中11種與氨基酸糖和核苷酸糖途徑相互作用，24種與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑相互作用(表1-2)。

發(fā)現(xiàn)與UXS1、AsnB和ASL相互作用的蛋白數(shù)量最多，這可能是碳氮循環(huán)的關(guān)鍵基因。這些結(jié)果有助于研究氮對水稻生長發(fā)育的影響，為水稻的栽培和調(diào)控提供參考。

3 討論與結(jié)論

氮素作為植物生長發(fā)育的必需元素，與植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸、磷脂和激素等含氮物質(zhì)密切相關(guān)。但是，土壤中的氮肥只有約35%能被植物吸收，氮素的吸收、轉(zhuǎn)運、同化和再分配等過程受到多個基因和環(huán)境因子的共同控制[23]。在本研究中，氮處理引起了分蘗期水稻葉片中大量涉及代謝過程、細胞過程、細胞組分、催化活性和結(jié)合等方面的基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄變化。

氮的同化過程是指氮素在根和葉片中經(jīng)系列酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變成谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸等有機氮的過程。在植物體中，大部分的氨通過GLT1(LOC_Os01g48960.1，谷氨酸合成酶基因)和谷氨酰胺-2-氧戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶的共同作用被同化為有機形態(tài)，通過ASN合成酶作用Gln與Asp反應(yīng)生成Asn和Glu，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抑制GLT1會降低氨基酸含量[24]，而ASN合成酶在調(diào)節(jié)氮向有機氮池的流動方面起著重要的作用，ASN合成酶催化反應(yīng)的所有底物和產(chǎn)物都是植物在韌皮部運輸?shù)拇x過程中主要的氮載體[25]。同時Asn易受不同生理和環(huán)境條件導(dǎo)致劇烈變化[26-29]。在擬南芥中過表達ASN合成酶會導(dǎo)致植株內(nèi)ASN含量升高同時在限氮培養(yǎng)基上幼苗的耐受性提高[30]，但在水稻中的報道還很少。在本研究中，發(fā)現(xiàn)分蘗期水稻葉片在氮處理后期AsnB(ASN合成酶基因)顯著升高，GLT1也顯著升高，這可能導(dǎo)致ASN含量的升高。同時筆者還發(fā)現(xiàn)在氮處理下ASL(精氨琥珀酸裂解酶基因)和GOT2(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因)顯著升高，而NadB(天冬氨酸氧化酶基因)和GLnA(谷氨酰氨合成酶基因)顯著下降，說明氮素通過這些基因在后期的差異表達來影響丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝，因為這些酶對氮素的響應(yīng)相對遲緩，所以可以考慮通過長期緩釋的氮素處理來調(diào)控氮代謝途徑酶活性。

表1 預(yù)測的氨基糖和核苷酸糖代謝互作蛋白Tab.1 Candidate protein interacting with proteins in amino sugar and nucleotide sugar pathway

碳氮循環(huán)也一直是研究的重點，糖類是碳氮循環(huán)的關(guān)鍵，Kim等[31]在水稻細胞懸浮液中提取得到galA(E3.2.1.22)，galA可催化寡糖和多聚半乳甘露聚糖水解1，6-連接的a-半乳糖殘基[32-33]。本研究發(fā)現(xiàn)，在氮處理前期分蘗期水稻葉片中g(shù)alA的表達顯著上調(diào)，同時調(diào)控半乳糖代謝的HK、malZ、galE(LOC_Os05g51670)的表達也顯著上調(diào)，在施氮中期調(diào)控氨基糖和核苷酸糖的13個基因也差異表達，但是目前尚未有報道氮素調(diào)控這些基因的研究進展，這些基因可能是碳氮代謝的橋梁分子，為農(nóng)業(yè)上施用氮肥精準調(diào)控水稻品質(zhì)提供參考，但對于碳氮代謝的具體作用機制還有待研究。

氮素應(yīng)答的差異表達基因有3 870個，主要與代謝過程、細胞過程、細胞組分、催化活性和結(jié)合等方面有關(guān)。在氮素處理后，前期應(yīng)答的差異表達基因galA、HK、galE(LOC_Os05g51670)、malZ主要參與半乳糖代謝途徑；中期應(yīng)答的差異表達基因HEXA_B、GNPNAT1、GlmS、UAP1、RGP、XYL4、AXS、UXS1、UGDH、RHM、galE(LOC_Os09g15420)和GAUT主要參與氨基糖和核苷酸糖代謝途徑；后期應(yīng)答的差異表達基因AsnB、ASL、NadB、GOT2、GLT1和GlnA主要參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝途徑；并且有35個蛋白與上述差異基因編碼蛋白互作，說明氮素處理后不同時間點應(yīng)答的代謝途徑是有差異的，這些結(jié)果為水稻栽培過程中氮素調(diào)控提供了轉(zhuǎn)錄水平的參考依據(jù)。