劉天奇，高紅秀，謝 威，張雪晴，陳娜娜，梅雪鋒，邢佳妮，徐振華，張忠臣

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，五常水稻研究所，黑龍江 哈爾濱 150229)

水稻是世界上重要的糧食作物，20世紀(jì)60年代的“綠色革命”提高了全球稻米的產(chǎn)量，開辟了水稻研究的新領(lǐng)域[1-4]。但是，為了實(shí)現(xiàn)綠色革命的最大生產(chǎn)潛力，需要大量的氮肥[5]。然而大量的氮肥施用會(huì)造成氮素的流失[6]，同時(shí)引起湖泊和水庫的富營養(yǎng)化[7]、地下水污染[8]和大氣污染[9]等環(huán)境問題，而不同品種間水稻氮肥利用率差異可達(dá)到79.6%[10]。因此，篩選氮素應(yīng)答基因來提高氮素利用率將成為今后科研的重點(diǎn)。

氮素作為一種水稻生長發(fā)育必需的營養(yǎng)元素，會(huì)顯著影響水稻分蘗數(shù)目[11]、淀粉品質(zhì)[12]、糖類[13-14]和氨基酸含量[15-16]等生理特性。長期以來，氮素管理作為栽培調(diào)控的重要手段，對(duì)于水稻的生長發(fā)育產(chǎn)生的影響一直是研究的重點(diǎn)。盡管目前一些關(guān)于水稻的氮素應(yīng)答基因NRT1.1B[17]、OsNRT1.1A/OsNPF6.3[18]、OsNRT2.1[19]、OsNRT2.3[20]、OsPTR9[21]等已被發(fā)現(xiàn)，但氮素應(yīng)答機(jī)制并沒有完全解釋清楚，在栽培上的應(yīng)用也不夠充分。

轉(zhuǎn)錄組分析是通過測序技術(shù)闡述同一細(xì)胞在不同生長時(shí)期及生長環(huán)境下基因差異表達(dá)的情況應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)[22]。鑒于目前關(guān)于水稻分蘗期氮素應(yīng)答的研究還不夠完善，在本研究中，筆者開展了氮處理下水稻分蘗期基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)分析，目的是確定調(diào)控分蘗期水稻葉片的氮素響應(yīng)基因，為利用氮素應(yīng)答模式精準(zhǔn)調(diào)控氮素影響水稻栽培管理提供新思路。

1 材料和方法

1.1 植物生長條件

本試驗(yàn)在哈爾濱東北農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行。首先將水稻品種五優(yōu)稻4號(hào)(WYD4)種子用30%次氯酸鈉滅菌30 min后放入錐形瓶中，然后用0.6%的硝酸在室溫下處理打破休眠狀態(tài)，移入30 ℃培養(yǎng)箱催芽，在溫室中播種。三葉一心期移栽至0.24 m2的白盆中，插秧規(guī)格為3株苗/穴，插秧方式為10 cm×10 cm。

1.2 氮素處理

盆栽土壤的基礎(chǔ)肥力為全氮1.51 g/kg、速效氮158.76 mg/kg、速效磷50.65 mg/kg、速效鉀177.68 mg/kg、pH值7.52、有機(jī)質(zhì)3.11%。處理組(Nitrogen treatment，Nt)基肥和分蘗肥分別為純氮72，54 kg/hm2，對(duì)照組(Control，CK)不施氮，其他養(yǎng)分含量相同，水分管理為常規(guī)管理。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3次生物重復(fù)，以確保試驗(yàn)的可靠性。

1.3 樣品制備

在氮素處理7，14，21 d后拍照，分別收集葉片在液氮保存30 min后放入試管中，并相應(yīng)地命名為CK7d、CK14d、CK21d、Nt7d、Nt14d、Nt21d，然后干冰保存下快遞至安諾公司進(jìn)行RNA提取和轉(zhuǎn)錄組分析，使用NanoPhotometer?分光光度計(jì)(Implen，CA，USA)和Qubit RNA分析試劑盒，在Qubit 3.0熒光儀(Life Technologies，CA，USA)中測定RNA的純度和濃度。使用Agilent 2100 RNA Nano 6000檢測試劑盒(Agilent Technologies，CA，USA)檢測RNA樣品的完整性和濃度。庫成簇(Clustering)與測序使用 HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS(Illumia)試劑在cBot上生成簇。隨后在 HiSeq 測序平臺(tái)上運(yùn)行雙端測序程序(PE)，得到 150 bp 的雙端測序 reads。GffCompare可用于比較裝配有RNA-seq數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄組和參考轉(zhuǎn)錄組。通過HTSeqv 0.6.0對(duì)每個(gè)樣本中每個(gè)基因的Reads計(jì)數(shù)(http：//www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/overview)。然后計(jì)算FPKM(每千堿基每米的片段映射讀數(shù))來估計(jì)每個(gè)樣本中基因的表達(dá)水平。

1.4 差異基因表達(dá)分析

DESeq2 針對(duì)2組之間有生物學(xué)重復(fù)樣本的差異表達(dá)分析，比較處理組與參考組，并選取|log2Ratio|≥1和q<0.05的基因作為差異顯著表達(dá)基因，得到上下調(diào)基因個(gè)數(shù)。DESeq2 理論基礎(chǔ)為Count值服從負(fù)二項(xiàng)分布假設(shè)，主要考慮相同表達(dá)水平的基因可能具有相似的離差以及每個(gè)基因的表達(dá)特性。利用線性回歸估計(jì)基因在各樣品中的表達(dá)強(qiáng)度，并用Wald test 計(jì)算每個(gè)基因在2組樣品中不差異表達(dá)的概率值P-value，并通過BH方法對(duì)P-value進(jìn)行校正得到q-value。

1.5 功能富集分析

對(duì)于差異基因的GO(Gene Ontology，http：//geneontology.org/)富集分析根據(jù)計(jì)算每個(gè)GO Term的基因數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO Term。計(jì)算得到的P-value通過校正之后，以q≤0.05為閾值，滿足此條件的GO term定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO term。通過GO功能顯著性富集分析能確定差異表達(dá)基因行使的主要生物學(xué)功能。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http：//www.kegg.jp/)是基因組破譯方面的數(shù)據(jù)庫。在給出染色體中一套完整基因的情況下，它可以對(duì)蛋白質(zhì)交互(互動(dòng))網(wǎng)絡(luò)在各種細(xì)胞活動(dòng)起的作用做出預(yù)測。對(duì)KEGG 中每個(gè)Pathway應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行富集分析，找出差異表達(dá)基因中顯著性富集的Pathway。

1.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

應(yīng)用 STRING 蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫(http：//string-db.org/)中的互作關(guān)系，針對(duì)數(shù)據(jù)庫中包含的物種，直接將目標(biāo)基因集(比如差異基因list)映射到物種的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)文件可以直接導(dǎo)入Cytoscape軟件，并根據(jù)目標(biāo)基因集中的基因?qū)傩詫?duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化編輯。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

圖表和圖像的數(shù)據(jù)分析利用WPS Office(11.1.0.9339)和Adobe Photoshop(13.0.20120315)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮處理引起分蘗期WYD4植株表型變化

氮素處理后7，14，21 d表型可以看出，施氮后WYD4植株顏色明顯比未施氮植株深(圖1-A-F)，說明葉片顏色群體長勢(shì)差異與氮素處理后不同時(shí)間點(diǎn)不同代謝途徑對(duì)氮素應(yīng)答有關(guān)。采集分蘗期WYD4葉片進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，期望發(fā)現(xiàn)水稻對(duì)氮素的應(yīng)答模式來進(jìn)行氮素管理，為水稻栽培提供參考。

2.2 氮處理引起分蘗期水稻基因表達(dá)變化

對(duì)照組和處理組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(7，14，21 d)分別提取WYD4嫩綠葉片RNA，得到純化的mRNA并生成cDNA用于轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，施氮的WYD4葉片有3 870個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs，Differential expression genes)(圖1-G)。

結(jié)果表明，在氮處理的早期(7 d)，存在大量的DEGs(2 278，圖1-G)，但隨著處理時(shí)間的延長，DEGs的數(shù)目反而在不斷減少，在這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，上調(diào)基因的數(shù)目比下調(diào)基因的數(shù)目少，說明氮素早期應(yīng)答的基因較多，而且氮素處理抑制了氮素應(yīng)答的基因表達(dá)。

通過層次聚類分析并繪制了Venn 圖和Volcano圖(圖2)，展示了不同時(shí)間氮處理下DEGs表達(dá)模式的異同。這些圖表顯示7，14，21 d的DEGs有相似的表達(dá)模式但也有所不同(圖2-A)。7 d時(shí)，部分DEGs上調(diào)，部分DEGs下調(diào)，且差異基因數(shù)目最大?？赡芘c氮處理的短期反應(yīng)有關(guān)。此外，25個(gè)DEGs在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)都出現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄變化，表明這些基因可能在整個(gè)氮處理期間都發(fā)揮作用(圖2-A)，14 d是基因表達(dá)差異最大的時(shí)間點(diǎn)，這可能與氮素發(fā)揮作用的時(shí)間有關(guān)(圖2-B)。

2.3 氮素應(yīng)答DEGs的GO和KEGG富集分析

GO分析發(fā)現(xiàn)氮應(yīng)答的DEGs主要富集在代謝過程、細(xì)胞過程、細(xì)胞組分、催化活性和結(jié)合等方面(圖3)，這些結(jié)果對(duì)于氮素在水稻分蘗期介導(dǎo)氧化還原、物質(zhì)代謝和酶活性調(diào)節(jié)等方面具有重要的指導(dǎo)意義。進(jìn)一步通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)DEGs(q_value均小于0.05)顯著富集在半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等代謝途徑(圖4)，共有22個(gè)DEGs與這些途徑顯著相關(guān)(圖5，6)。

2.4 氮素對(duì)氨基酸途徑的影響

氨基酸是一種重要的生物分子，是蛋白質(zhì)合成的基本單元。發(fā)現(xiàn)氮素處理會(huì)顯著影響很多與氨基酸途徑有關(guān)的基因表達(dá)，這些差異表達(dá)的基因顯著影響丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝，因?yàn)榈貙?duì)氨基酸尤為重要，所以進(jìn)一步分析了分蘗期WYD4葉片的相關(guān)基因表達(dá)(圖5)。

研究發(fā)現(xiàn)，AsnB、ASL、NadB、GOT2、GLT1和GLnA的顯著差異表達(dá)主要表現(xiàn)在氮素處理后期21 d，說明水稻可能是通過上述6個(gè)基因氮素處理后期的應(yīng)答來調(diào)控丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝途徑。

2.5 氮素對(duì)糖類代謝的影響

碳氮循環(huán)一直是光合植物研究的重點(diǎn)，氮素如何具體調(diào)控糖類代謝還需完善。研究結(jié)果表明，氮素在初期對(duì)半乳糖代謝有顯著影響，而在中期對(duì)氨基糖和核苷酸糖的代謝有顯著影響(圖4)，對(duì)以上2種代謝途徑的差異表達(dá)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。

研究發(fā)現(xiàn)，galA、HK、galE(LOC_Os05g51670)、malZ的差異表達(dá)主要表現(xiàn)在氮處理前期7 d，HEXA_B、GNPNAT1、GlmS、UAP1、RGP、XYL4、AXS、UXS1、UGDH、RHM、galE(LOC_Os09g15420)和GAUT的差異表達(dá)主要表現(xiàn)在氮處理中期14 d，而且氮處理前期(7 d)和氮處理中期(14 d)差異表達(dá)上調(diào)的基因數(shù)遠(yuǎn)多于差異表達(dá)下調(diào)的基因數(shù)(圖6)，說明水稻可能是通過上述16個(gè)基因氮素處理前中期的應(yīng)答來調(diào)控半乳糖、氨基糖和核苷酸糖的代謝途徑的。

2.6 氮素應(yīng)答的互作蛋白

STRING是收錄多個(gè)物種預(yù)測的和試驗(yàn)驗(yàn)證的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作的數(shù)據(jù)庫，通過數(shù)據(jù)庫對(duì)氮處理下分蘗期水稻葉片進(jìn)行互作蛋白預(yù)測，發(fā)現(xiàn)了35種相互作用的蛋白質(zhì)，其中11種與氨基酸糖和核苷酸糖途徑相互作用，24種與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑相互作用(表1-2)。

發(fā)現(xiàn)與UXS1、AsnB和ASL相互作用的蛋白數(shù)量最多，這可能是碳氮循環(huán)的關(guān)鍵基因。這些結(jié)果有助于研究氮對(duì)水稻生長發(fā)育的影響，為水稻的栽培和調(diào)控提供參考。

3 討論與結(jié)論

氮素作為植物生長發(fā)育的必需元素，與植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸、磷脂和激素等含氮物質(zhì)密切相關(guān)。但是，土壤中的氮肥只有約35%能被植物吸收，氮素的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、同化和再分配等過程受到多個(gè)基因和環(huán)境因子的共同控制[23]。在本研究中，氮處理引起了分蘗期水稻葉片中大量涉及代謝過程、細(xì)胞過程、細(xì)胞組分、催化活性和結(jié)合等方面的基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄變化。

氮的同化過程是指氮素在根和葉片中經(jīng)系列酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變成谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸等有機(jī)氮的過程。在植物體中，大部分的氨通過GLT1(LOC_Os01g48960.1，谷氨酸合成酶基因)和谷氨酰胺-2-氧戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶的共同作用被同化為有機(jī)形態(tài)，通過ASN合成酶作用Gln與Asp反應(yīng)生成Asn和Glu，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抑制GLT1會(huì)降低氨基酸含量[24]，而ASN合成酶在調(diào)節(jié)氮向有機(jī)氮池的流動(dòng)方面起著重要的作用，ASN合成酶催化反應(yīng)的所有底物和產(chǎn)物都是植物在韌皮部運(yùn)輸?shù)拇x過程中主要的氮載體[25]。同時(shí)Asn易受不同生理和環(huán)境條件導(dǎo)致劇烈變化[26-29]。在擬南芥中過表達(dá)ASN合成酶會(huì)導(dǎo)致植株內(nèi)ASN含量升高同時(shí)在限氮培養(yǎng)基上幼苗的耐受性提高[30]，但在水稻中的報(bào)道還很少。在本研究中，發(fā)現(xiàn)分蘗期水稻葉片在氮處理后期AsnB(ASN合成酶基因)顯著升高，GLT1也顯著升高，這可能導(dǎo)致ASN含量的升高。同時(shí)筆者還發(fā)現(xiàn)在氮處理下ASL(精氨琥珀酸裂解酶基因)和GOT2(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因)顯著升高，而NadB(天冬氨酸氧化酶基因)和GLnA(谷氨酰氨合成酶基因)顯著下降，說明氮素通過這些基因在后期的差異表達(dá)來影響丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝，因?yàn)檫@些酶對(duì)氮素的響應(yīng)相對(duì)遲緩，所以可以考慮通過長期緩釋的氮素處理來調(diào)控氮代謝途徑酶活性。

表1 預(yù)測的氨基糖和核苷酸糖代謝互作蛋白Tab.1 Candidate protein interacting with proteins in amino sugar and nucleotide sugar pathway

碳氮循環(huán)也一直是研究的重點(diǎn)，糖類是碳氮循環(huán)的關(guān)鍵，Kim等[31]在水稻細(xì)胞懸浮液中提取得到galA(E3.2.1.22)，galA可催化寡糖和多聚半乳甘露聚糖水解1，6-連接的a-半乳糖殘基[32-33]。本研究發(fā)現(xiàn)，在氮處理前期分蘗期水稻葉片中g(shù)alA的表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)調(diào)控半乳糖代謝的HK、malZ、galE(LOC_Os05g51670)的表達(dá)也顯著上調(diào)，在施氮中期調(diào)控氨基糖和核苷酸糖的13個(gè)基因也差異表達(dá)，但是目前尚未有報(bào)道氮素調(diào)控這些基因的研究進(jìn)展，這些基因可能是碳氮代謝的橋梁分子，為農(nóng)業(yè)上施用氮肥精準(zhǔn)調(diào)控水稻品質(zhì)提供參考，但對(duì)于碳氮代謝的具體作用機(jī)制還有待研究。

氮素應(yīng)答的差異表達(dá)基因有3 870個(gè)，主要與代謝過程、細(xì)胞過程、細(xì)胞組分、催化活性和結(jié)合等方面有關(guān)。在氮素處理后，前期應(yīng)答的差異表達(dá)基因galA、HK、galE(LOC_Os05g51670)、malZ主要參與半乳糖代謝途徑；中期應(yīng)答的差異表達(dá)基因HEXA_B、GNPNAT1、GlmS、UAP1、RGP、XYL4、AXS、UXS1、UGDH、RHM、galE(LOC_Os09g15420)和GAUT主要參與氨基糖和核苷酸糖代謝途徑；后期應(yīng)答的差異表達(dá)基因AsnB、ASL、NadB、GOT2、GLT1和GlnA主要參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝途徑；并且有35個(gè)蛋白與上述差異基因編碼蛋白互作，說明氮素處理后不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)答的代謝途徑是有差異的，這些結(jié)果為水稻栽培過程中氮素調(diào)控提供了轉(zhuǎn)錄水平的參考依據(jù)。