丁 戈，黃 楊，陳倫林，李書(shū)宇，宋來(lái)強(qiáng)，熊 潔

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所，國(guó)家油料改良中心南昌分中心，江西省油料作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江中下游作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330200)

酸性土壤(pH 值<5.5)的溶解鋁(Al3+)通過(guò)抑制根系生長(zhǎng)，影響水分和養(yǎng)分吸收，限制了作物的生長(zhǎng)與產(chǎn)量[1-3]。植物根系是鋁毒害的主要作用部位，根系通過(guò)誘導(dǎo)或增強(qiáng)相關(guān)鋁抗性基因表達(dá)，如轉(zhuǎn)錄、RNA剪接、蛋白質(zhì)翻譯或翻譯后修飾等調(diào)控，合成功能性基因產(chǎn)物來(lái)應(yīng)對(duì)鋁毒害[4-9]。實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量PCR(Real-time fluorescence relative quantitative PCR)是研究基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量的常用技術(shù)，具有高通量、特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性高等特點(diǎn)。其對(duì)目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量分析需要選擇高度保守且穩(wěn)定表達(dá)的基因作為內(nèi)參基因。常用內(nèi)參基因通常是在所有細(xì)胞中表達(dá)的持家基因(Housekeeping gene)，但持家基因的表達(dá)穩(wěn)定性是相對(duì)的，已經(jīng)不能滿(mǎn)足多樣化的試驗(yàn)體系中相對(duì)定量分析對(duì)內(nèi)參基因的要求[10]。內(nèi)參基因需要根據(jù)物種、組織器官、生長(zhǎng)發(fā)育階段和試驗(yàn)條件等因素進(jìn)行篩選、評(píng)估和驗(yàn)證[11]。根據(jù)具體的樣品類(lèi)型選擇合適的內(nèi)參基因作為參照物校正樣品間的試驗(yàn)誤差，通過(guò)對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理，確保實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量PCR分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[12]。隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)[13-15]的發(fā)展，基于高通量大數(shù)據(jù)的新內(nèi)參基因發(fā)掘可以不再局限于常見(jiàn)的持家基因。本研究采用有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)篩選候選內(nèi)參基因，隨后采用實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量PCR分析、基因表達(dá)穩(wěn)定性分析及相對(duì)表達(dá)量分析等技術(shù)，評(píng)估、驗(yàn)證候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，進(jìn)行鋁脅迫下甘藍(lán)型油菜苗期根組織新內(nèi)參基因的發(fā)掘以及實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量PCR引物的開(kāi)發(fā)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料培養(yǎng)于人工氣候溫室(晝夜時(shí)間14 h/10 h，晝夜溫度25 ℃/20 ℃)。供試材料為前期研究篩選獲得1對(duì)苗期耐鋁性差異顯著的油菜品種：耐鋁品種贛油雜7號(hào)(Ganyouza 7)和鋁敏感品種蓉油18(Rongyou 18)。將2個(gè)品種分別播種在裝有純凈水的培養(yǎng)箱中，7 d后每品種選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的40株幼苗，移栽于裝有改良型Hoagland(pH值 5.8～6.0)營(yíng)養(yǎng)液[16]的培養(yǎng)箱中，依次1/4、1/2、完全營(yíng)養(yǎng)液各培養(yǎng)7 d。在苗齡28 d時(shí)，分為6個(gè)試驗(yàn)組，設(shè)置3次重復(fù)，對(duì)照組為未施加AlCl3時(shí)的0 h取樣，處理組為施加100 μmol/L AlCl3(pH值 4.5)后分別在3，24 h取樣。每個(gè)試驗(yàn)組各取樣3個(gè)生物重復(fù)樣品，共18個(gè)樣品。每個(gè)樣品根部取樣大于4 g，液氮速凍后保存于-70 ℃冰柜。后續(xù)的文庫(kù)制備及有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，總RNA提取，cDNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量PCR由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 文庫(kù)制備及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析 使用TRIzolTMReagent(Invitrogen，美國(guó))提取樣品的總RNA，質(zhì)檢合格后，真核生物轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建使用NEB#7530試劑盒(New England Biolabs，美國(guó))，文庫(kù)質(zhì)檢(DNA 1000 assay Kit，Agilent，美國(guó))合格后，每個(gè)樣品構(gòu)建一個(gè)300～500 bp片段長(zhǎng)度的雙端(Paired-end，PE)測(cè)序文庫(kù)，在Illumina HiSeq2500測(cè)序儀(Illumina，美國(guó))上進(jìn)行PE150測(cè)序。經(jīng)測(cè)序原始數(shù)據(jù)質(zhì)控，基于基因組注釋的定量質(zhì)控、基因分析、表達(dá)量統(tǒng)計(jì)等步驟，獲得基因表達(dá)的FPKM值與組間差異倍數(shù)|log2FC|值。本研究中使用的甘藍(lán)型油菜基因序列均參考甘藍(lán)型油菜Darmor-bzh參考基因組[17-18](Darmor-bzhv4.1，下載自http：//www.genoscope.cns.fr/brassicanapus)。

1.2.2 總RNA提取與質(zhì)量檢測(cè) 用于cDNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量PCR分析的總RNA提取參照賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司InvitrogenTMTRIzolTMReagent產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。提取完成后存于-70 ℃?zhèn)溆?。微量分光光度?jì)(型號(hào)NanoDrop 2000，Thermo Scientific，美國(guó))檢測(cè)RNA的質(zhì)量與濃度。RNA完整性檢測(cè)采用1%(0.5 μg/mL EB)非變性瓊脂糖凝膠(1×TAE緩沖液，pH值 8.5，40 mmol/L Tris-乙酸，2 mmol/L EDTA)，RNA原液上樣1 μL。電泳儀參數(shù)設(shè)置為恒壓5 V/cm，電泳時(shí)間20～30 min或溴酚藍(lán)染料遷移至膠下游3/4處時(shí)停止電泳。EB染色的凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)Gel DocTMXR+，BIO-RAD，美國(guó))觀(guān)察并照相。

1.2.3 cDNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系 用于實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量PCR分析的cDNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的配制參照南京諾唯贊生物科技股份有限公司HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。使用1 μg總RNA按兩步驟依次建立16 μL基因組DNA去除反應(yīng)體系及20 μL cDNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。反應(yīng)完成后存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量PCR引物設(shè)計(jì)與合成、反應(yīng)體系及程序設(shè)置 遵循實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物設(shè)計(jì)原則，采用Primer Premier 5設(shè)計(jì)，上海捷瑞生物工程有限公司合成及PAGE方式純化引物。Actin7上游引物序列為5′-GTTACGCTCTTCCT CACGCT-3′，下游引物序列為5′-CAGGGGCTTCCAT TCCG-3′，擴(kuò)增子堿基對(duì)數(shù)為315 bp；ARFA1E上游引物序列為5′-TCGTCACAACCATTCCCACC-3′，下游引物序列為5′-AGATAAGCCCCTGCGTGTTC-3′，擴(kuò)增子堿基對(duì)數(shù)為144 bp；SAP5上游引物序列為5′-CGCAGAGAACGGAGAAGGAA-3′，下游引物序列為5′-ACGACTTTGGCTGGTGATGG-3′，擴(kuò)增子堿基對(duì)數(shù)為238 bp；UXS3上游引物序列為5′-GACCC TCTCATCCACCCTCA-3′，下游引物序列為5′-CACC ATCTTTATCTCTATGCTCGG-3′，擴(kuò)增子堿基對(duì)數(shù)為432 bp；UBC9上游引物序列為5′-GCCCTTACTCTG GTGGTGTT-3′，下游引物序列為5′-CGAACAGAT AGATAGCAGCACC-3′，擴(kuò)增子堿基對(duì)數(shù)為197 bp。反應(yīng)體系的配制參照南京諾唯贊生物科技股份有限公司ChamQTMSYBRTMqPCR Master Mix(High ROX Premixed)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，使用4 μL cDNA稀釋液(原液稀釋10×)為模板配制20 μL反應(yīng)體系。SYBRTMGreen Ⅰ嵌合熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)在StepOne PlusTMReal-Time PCR System(Applied Biosystems，美國(guó))上運(yùn)行，步驟依次為，步驟1預(yù)變性：95 ℃預(yù)變性90 s；步驟2循環(huán)反應(yīng)(三步法)：進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，95 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s；步驟3熔解曲線(xiàn)采集：升溫(速率100%)至95 ℃變性15 s，降溫(速率100%)至65 ℃退火60 s，緩慢升溫(0.3 ℃/s)至95 ℃變性15 s。分別在循環(huán)反應(yīng)延伸階段、熔解曲線(xiàn)緩慢升溫及后續(xù)變性階段采集實(shí)時(shí)熒光信號(hào)。

1.2.5 基因表達(dá)穩(wěn)定性分析的算法 geNorm[19](下載地址https：//genorm.cmgg.be)采用成對(duì)比較法(Pairwise comparison approach)，計(jì)算出基因表達(dá)穩(wěn)定性M值(Average pairwise variationV，平均配對(duì)變異V值)。當(dāng)M值低于1.5時(shí)，M值越低，穩(wěn)定性越高。當(dāng)配對(duì)變異值Vn/Vn+1<0.15時(shí)，內(nèi)參基因組合的最適基因是高穩(wěn)定性排名的前n個(gè)。geNorm算法的數(shù)據(jù)輸入格式為，每個(gè)樣品(含生物學(xué)重復(fù))相對(duì)定量EΔCt值，其中樣本i中基因j的Ct(i，j)值為其技術(shù)重復(fù)Ct值的算數(shù)平均數(shù)(Arithmetic mean)，ΔCt(i，j)=minCt(m，j)-Ct(i，j)。minCt(m，j)為該基因j在所有樣本m中最小Ct值,E為擴(kuò)增效率(效率為100%時(shí)，E=2)。NormFinder[20](下載地址https：//www.moma.dk/normfinder-software)采用基于模型的方法(The Model-Based Approach)，計(jì)算出基因組內(nèi)方差(Intra-group variances)與組間方差(Inter-group variances)，再計(jì)算出基因表達(dá)穩(wěn)定性ρ值，組間方差越接近0，同時(shí)平均組內(nèi)方差越小，ρ值越低，穩(wěn)定性越高。NormFinder算法的數(shù)據(jù)輸入格式為，每個(gè)樣品(含生物學(xué)重復(fù))的技術(shù)重復(fù)Ct值的中位數(shù)(Median)，并勾選"log transform data"選項(xiàng)進(jìn)行自然對(duì)數(shù)log(x)轉(zhuǎn)換，或數(shù)據(jù)輸入相對(duì)定量EΔCt值。BestKeeper[21](下載地址https：//www.gene-quantification.de/bestkeeper.html)采用重復(fù)配對(duì)相關(guān)分析(Repeated pair-wise correlation analysis)、相關(guān)分析(Correlation analysis)和回歸分析(Regression analysis)，計(jì)算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(Standard deviation，s)、變異系數(shù)(Coefficient of variation，CV)和配對(duì)相關(guān)系數(shù)(Coefficient of correlation，r)。當(dāng)s<1時(shí)，r值越大，CV值和s值越低，穩(wěn)定性越高。BestKeeper算法的數(shù)據(jù)輸入格式為，每個(gè)樣品(含生物學(xué)重復(fù))的技術(shù)重復(fù)Ct值的算數(shù)平均數(shù)以及基因的擴(kuò)增效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的表達(dá)量分析

有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基因表達(dá)量計(jì)算使用FPKM法(Fragments per kilobase of transcript per million mapped fragments，每百萬(wàn)片段中來(lái)自于某基因每千堿基長(zhǎng)度的片段)[22]，F(xiàn)PKM法適用于雙端測(cè)序文庫(kù)，其公式能夠抵消基因編碼區(qū)堿基數(shù)和樣品測(cè)序片段數(shù)差異對(duì)基因表達(dá)量運(yùn)算的影響，計(jì)算得到的FPKM值可直接用于比較不同組間的基因表達(dá)差異，其比值即為2組間基因表達(dá)差異倍數(shù)(Fold Change，F(xiàn)C)，對(duì)FC取以2為底的對(duì)數(shù)之后即為log2FC，在|log2FC|>1時(shí)，表達(dá)差異2倍以上。持家基因具有2個(gè)特征，即在試驗(yàn)組織中穩(wěn)定表達(dá)，且表達(dá)水平高于背景值，因此，以FPKM值(大于10，表達(dá)水平高于背景值)和log2FC絕對(duì)值(小于0.1，表達(dá)變化較小)作為雙層過(guò)濾篩選條件，從6個(gè)試驗(yàn)組的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中篩選出符合持家基因2個(gè)特征的5個(gè)候選內(nèi)參基因(Actin7、ARFA1E、SAP5、UXS3、UBC9)。此外，由于它們屬于不同的功能分類(lèi)，在理論上降低了這些基因會(huì)受到共調(diào)控的可能性，因此，它們可作為不同類(lèi)別的候選內(nèi)參基因(圖1-A、表1)。傳統(tǒng)持家基因β-肌動(dòng)蛋白基因(β-actin)的異型體ACT2[23]、磷酸化的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH的細(xì)胞質(zhì)同工型GAPC1(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase C subunit 1)[24]、α-微管蛋白基因(α-tubulin)的亞型TUA4(Tubulin alpha-4 chain)[25]在2個(gè)品種的鋁脅迫時(shí)間梯度(3，24 h)處理組中表達(dá)量發(fā)生變化，不適宜作為鋁脅迫分析的內(nèi)參基因(圖1-B、表1)?；谵D(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性尚不確定，需要后續(xù)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量PCR分析、基因表達(dá)穩(wěn)定性分析及相對(duì)表達(dá)量分析等方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表1 油菜候選內(nèi)參基因與擬南芥同源基因的蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析Tab.1 Alignment analysis of the protein sequences of rape candidate reference genes and Arabidopsis thaliana homologous genes

2.2 總RNA質(zhì)量檢測(cè)

提取的總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度檢測(cè)，6個(gè)試驗(yàn)組共18個(gè)樣品的大片段28S rRNA和18S rRNA條帶明亮清晰，泳道無(wú)彌散區(qū)，加樣孔無(wú)基因組及蛋白質(zhì)雜質(zhì)殘留(圖2)，樣品濃度在183.9～462.7 ng/μL，OD260/280均值在1.92～2.06，OD260/230均值在1.89～1.96，提取的樣品RNA完整性好，質(zhì)量較好，可用于后續(xù)分析。

2.3 擴(kuò)增曲線(xiàn)及熔解曲線(xiàn)分析

SYBR?Green I嵌合熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析表明，各候選內(nèi)參基因擴(kuò)增子(Amplicon)的擴(kuò)增曲線(xiàn)清晰可辨認(rèn)(圖3)，其所有PCR復(fù)孔(包括每個(gè)樣品的3個(gè)技術(shù)性重復(fù)，n=54)擴(kuò)增曲線(xiàn)重復(fù)性高，未出現(xiàn)平臺(tái)期明顯降低的引物二聚體擴(kuò)增曲線(xiàn)。在三步法循環(huán)反應(yīng)完成后，進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析。熔解曲線(xiàn)分析是一種簡(jiǎn)單、直接地檢查反應(yīng)中引物二聚體和擴(kuò)增子的方法。其原理是核酸的熔解溫度(Tm)受堿基對(duì)數(shù)目、GC堿基含量以及堿基錯(cuò)配等因素影響，因此，可根據(jù)熔解特性區(qū)分?jǐn)U增產(chǎn)物。熔解曲線(xiàn)分析能夠確保反應(yīng)的特異性，可以替代擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳檢測(cè)步驟。熔解曲線(xiàn)(圖3、表2)分析表明，各候選內(nèi)參基因所有PCR復(fù)孔(n=54)的擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線(xiàn)均為顯著的尖銳單一熔解峰，峰的Tm值大于80 ℃，且起峰到落峰溫度跨度不高于7 ℃，表明引物特異性高，擴(kuò)增產(chǎn)物中未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增子及引物二聚體，實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量PCR的結(jié)果可用于后續(xù)分析。

表2 擴(kuò)增子的熔解溫度與擴(kuò)增效率Tab.2 Tm and amplification efficiency of amplicons

2.4 擴(kuò)增效率分析

在完成高質(zhì)量的實(shí)時(shí)熒光PCR后，需要運(yùn)用合適的程序[26-28]對(duì)原始熒光值(Raw fluorescence)或閾值循環(huán)(Threshold cycle，Ct)數(shù)據(jù)進(jìn)行正確分析。程序LinRegPCR[29-30](Version 2020.0.0.3，下載地址https：//www.genetargetsolutions.com.au/qpcr/linregpcr-and-factor-qpcr)，將每個(gè)PCR反應(yīng)孔(包括技術(shù)性重復(fù)的復(fù)孔)在第1～40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增的熒光信號(hào)實(shí)時(shí)檢測(cè)絕對(duì)值(Non-baseline corrected data)經(jīng)對(duì)數(shù)log10(x)轉(zhuǎn)換，通過(guò)線(xiàn)性回歸分析計(jì)算線(xiàn)性區(qū)段(擴(kuò)增曲線(xiàn)指數(shù)期)的斜率，能夠準(zhǔn)確獲得每個(gè)反應(yīng)孔的具體擴(kuò)增效率(E)。LinRegPCR分析表明，各候選內(nèi)參基因的所有PCR復(fù)孔(n=54)的擴(kuò)增線(xiàn)性區(qū)段的相關(guān)系數(shù)r值為0.997 42～0.999 67，表明該區(qū)段的循環(huán)數(shù)與對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的熒光信號(hào)值之間的線(xiàn)性相關(guān)程度高。各候選內(nèi)參基因擴(kuò)增子的擴(kuò)增效率為87.3%～92.1%(表2)。

2.5 基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

采用常用的比較基因表達(dá)變化及穩(wěn)定性的geNorm、NormFinder和BestKeeper等3種Microsoft Excel 2003 宏或加載項(xiàng)對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性分析。因算法差異，各候選內(nèi)參基因在3個(gè)軟件中的排序略有差異，對(duì)各候選內(nèi)參基因的3種排序值進(jìn)行幾何平均值(Geometric mean)運(yùn)算后進(jìn)行綜合排名，優(yōu)先選擇綜合排名靠前的候選內(nèi)參基因，其中表達(dá)穩(wěn)定性綜合排名前兩位的候選內(nèi)參基因分別是SAP5和UXS3(表3)。

2.6 基因相對(duì)表達(dá)量分析

表3 候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析Tab.3 Expression stability analysis of candidate reference genes

表4 樣品組候選內(nèi)參基因相對(duì)表達(dá)量Tab.4 Relative expression of candidate reference genes in sample group

3 結(jié)論與討論

實(shí)時(shí)熒光PCR的相對(duì)定量數(shù)據(jù)分析方法主要有2-ΔΔCt法[34]、雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法[35]、線(xiàn)性回歸分析法等。相對(duì)定量2-ΔΔCt法不需要計(jì)算擴(kuò)增效率，但需要對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行嚴(yán)格優(yōu)化，使目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率接近100%且偏差在5%以?xún)?nèi)。由于實(shí)際擴(kuò)增效率會(huì)不同于理想擴(kuò)增效率(100%)，為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要檢測(cè)引物對(duì)的擴(kuò)增效率。線(xiàn)性回歸分析法采用的數(shù)據(jù)全部來(lái)自指數(shù)期，計(jì)算得到的理論擴(kuò)增效率會(huì)低于真實(shí)值，可能會(huì)引入一定的誤差[36]，但是相對(duì)定量數(shù)據(jù)分析的最終數(shù)據(jù)處理是目的基因和內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量比率，可以抵消一部分試驗(yàn)誤差。本研究采用LinRegPCR線(xiàn)性回歸分析法作為實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增效率分析的方法。與雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法相比，LinRegPCR法可以進(jìn)行自動(dòng)化分析，不需要用穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建多條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，分析效率高。

新內(nèi)參基因的發(fā)掘需要綜合衡量基因表達(dá)穩(wěn)定性及相對(duì)表達(dá)量分析的結(jié)果。持家基因細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白Actin基因家族成員屬于傳統(tǒng)的內(nèi)參基因，在多個(gè)物種及重金屬脅迫條件下能夠穩(wěn)定表達(dá)[37-38]。本研究通過(guò)基因表達(dá)穩(wěn)定性及相對(duì)表達(dá)量分析，同樣證實(shí)Actin基因家族成員Actin7在甘藍(lán)型油菜受到鋁脅迫時(shí)能夠穩(wěn)定表達(dá)，可以作為內(nèi)參基因。在基因表達(dá)穩(wěn)定性分析中，UBC9的綜合排名高于A(yíng)ctin7，但是基因相對(duì)表達(dá)量分析表明樣品組UBC9的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)極顯著，不適宜選作內(nèi)參基因。此外，Actin7和新發(fā)掘的內(nèi)參基因ARFA1E、SAP5、UXS3分別屬于4類(lèi)不同的生物學(xué)功能范疇，受到共調(diào)控的可能性低，針對(duì)它們開(kāi)發(fā)的4對(duì)新內(nèi)參基因引物可以提高鋁脅迫試驗(yàn)體系實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，為甘藍(lán)型油菜遺傳學(xué)研究和分子育種研究提供更多種類(lèi)的內(nèi)參基因資源。

基因表達(dá)的穩(wěn)定性是相對(duì)的，例如組織器官、發(fā)育階段等因素可能會(huì)引起基因的特異性表達(dá)，但特定試驗(yàn)系統(tǒng)都存在著相對(duì)穩(wěn)定表達(dá)的特定基因[10]，因此，需要根據(jù)具體的樣品類(lèi)型，通過(guò)系統(tǒng)的試驗(yàn)及分析，確定候選的功能基因作為內(nèi)參基因的適用性。Actin7、ARFA1E、SAP5、UXS3在耐鋁性差異顯著的2個(gè)甘藍(lán)型油菜品種的對(duì)照組和處理組中均穩(wěn)定表達(dá)，暗示這些基因沒(méi)有參與鋁毒害的根部響應(yīng)過(guò)程，這些試驗(yàn)結(jié)果為這些基因在該試驗(yàn)體系的內(nèi)參基因適用性提供了科學(xué)依據(jù)，表明這些基因可以作為不同甘藍(lán)型油菜品種根組織鋁脅迫條件下的內(nèi)參基因。這些基因在根部和地上部(莖、葉、花、角果)的時(shí)空表達(dá)調(diào)控特性以及作為地上部?jī)?nèi)參基因的適用性，需要后續(xù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析和驗(yàn)證。

綜上所述，本研究根據(jù)候選內(nèi)參基因序列開(kāi)發(fā)的4對(duì)新內(nèi)參基因引物特異性高，在鋁脅迫試驗(yàn)體系的實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)中有效實(shí)用。新發(fā)掘的4個(gè)內(nèi)參基因在2個(gè)鋁脅迫耐受差異性品種苗期根組織的未處理組(0 h)和鋁脅迫(100 μmol/L AlCl3，pH值 4.5)的2個(gè)時(shí)間梯度(3，24 h)處理組中均穩(wěn)定表達(dá)，按表達(dá)穩(wěn)定性綜合排名由高至低排序依次為UXS3、SAP5、ARFA1E、Actin7，其中最優(yōu)組合為SAP5和UXS3。