羅 輝，林立文，趙紫微，陳秋燕，梁雨秋，鄧先清

2-(4-(1,2,4-三唑)-苯氧基乙酰腙衍生物的合成與生物活性初探

羅 輝，林立文，趙紫微，陳秋燕，梁雨秋，*鄧先清

（井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江西，吉安 343009）

以對氨基酚為起始原料合成了一系列2-(4-(1,2,4-三唑)-苯氧基乙酰腙衍生物（5a-5o）。通過核磁共振氫譜和碳譜確證了目標化合物的結(jié)構(gòu)，采用最大電驚厥實驗（MES）和皮下注射戊四唑?qū)嶒灒≒TZ）篩選其抗癲癇活性，采用旋轉(zhuǎn)棒法評價其神經(jīng)毒性，采用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)TNF-α釋放模型評價了化合物的體外抗炎活性。研究結(jié)果顯示部分化合物顯示出中等偏弱的抗MES活性和抗PTZ活性，所有化合物在300 mg/kg劑量下均未表現(xiàn)出神經(jīng)毒性。此外，化合物5a-5h和5k-5m均表現(xiàn)出明顯的抗炎活性，20 μg/mL劑量下可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α濃度的升高。本研究報道的2-(4-(1,2,4-三唑)-苯氧基乙酰腙衍生物的抗癲癇活性雖然未達到預(yù)期強度，但也為后續(xù)三唑類抗癲癇藥物的設(shè)計提供了一定指導(dǎo)，該系列化合物在細胞炎癥模型中的突出表現(xiàn)豐富了三氮唑類化合物在抗炎研究中的應(yīng)用，為后續(xù)抗炎藥物的研究開發(fā)提供了實驗依據(jù)。

三氮唑；酰腙；抗癲癇；抗炎；TNF-α

癲癇是多種原因引起腦部神經(jīng)元群陣發(fā)性異常放電所致的發(fā)作性運動、感覺、意識、精神、植物神經(jīng)功能異常的一種疾病，也是一種反復(fù)性突然發(fā)作的腦功能短暫異常疾病。臨床表現(xiàn)有大發(fā)作、小發(fā)作、失神發(fā)作、局限性和混合性發(fā)作等類型。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，現(xiàn)今全球大概有5000萬的癲癇患者，而我國有近1000萬的癲癇患者，每年新增癲癇患者約50萬人[1]?，F(xiàn)有藥物可以控制70%左右患者的癲癇發(fā)作，但僅僅是抑制發(fā)作，并不能完全治愈，需要長期服藥（半年以上甚至終身），因而帶來了嚴重的耐藥性和毒副作用的問題[2], 癲癇患者的生存質(zhì)量明顯下降，同時也給家庭和社會增加了大量的心理和經(jīng)濟負擔(dān)[3]。因此，開發(fā)新的具有廣譜、強效、毒副作用小的新型抗癲癇藥物（AEDs）仍然是癲癇治療的重要方向。

三氮唑是一種富氮芳香雜環(huán)，三氮唑衍生物顯示出廣泛的生物活性，在農(nóng)藥和醫(yī)藥領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。三氮唑類藥物是臨床的常用藥物，在抗結(jié)核、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛、抗癲癇等方面優(yōu)勢明顯，顯示出低毒性、高活性和藥物靶向性強等特點[4-8]。近年來，通過對三氮唑類衍生物進行結(jié)構(gòu)修飾，如1位氮原子上基團的空間位阻、4位氮原子的裸露、三氮唑與其他芳環(huán)的稠合或者鏈接等的改造，并對所合成的三氮唑化合物進行抗癲癇活性的篩選，豐富了三氮唑類化合物抗癲癇活性的構(gòu)效關(guān)系，得到一些藥理性質(zhì)優(yōu)于臨床藥物的備選化合物，這一過程為開發(fā)出新抗癲癇藥物奠定了基礎(chǔ)[9]。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)1，2，4-三氮唑與苯環(huán)直接以單鍵連接獲得三唑-苯基片段是一個良好的抗癲癇活性片段[10-11]。為了繼續(xù)探究三唑-苯基片段在抗癲癇藥物發(fā)現(xiàn)中的價值，獲得更多抗癲癇活性骨架和活性候選物，我們基于三唑-苯基片段，將酰腙結(jié)構(gòu)與其連接，設(shè)計合成了一系列新的三氮唑衍生物。采用最大電休克發(fā)作實驗和皮下戊四唑?qū)嶒炦M行抗癲癇活性評價。酰腙是一類酰肼與羰基化合物縮合而成的結(jié)構(gòu)片段，其結(jié)構(gòu)中含有酰胺和席夫堿，后兩者在抗癲癇藥物設(shè)計中也被廣泛應(yīng)用[12-13]，因此期望該設(shè)計可以獲得更好的抗癲癇活性。此外，基于三氮唑和酰腙結(jié)構(gòu)在抗炎藥物中的廣泛報道[14-15]，我們還對目標化合物的抗炎活性進行了篩選。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

核磁共振分析采用BURKER AV-300 型核磁共振儀(Bruker, Switzerland)，四甲基硅(TMS)為內(nèi)標，溶劑使用CDCl3或DMSO-d；熔點采用毛細管法測定(溫度計未經(jīng)校正)。實驗所用試劑包括對氨基苯酚(98%，麥克林試劑公司)、甲酰肼(99%，麥克林試劑公司)、-二甲基甲酰胺二甲基縮醛 (97%，麥克林試劑公司)，氯乙酸乙酯 (98%，麥克林試劑公司)、苯乙酮(98%，阿拉丁試劑公司)、苯甲醛 (98%，阿拉丁試劑公司)、水合肼(80%，上?；瘜W(xué)試劑廠)，其他常規(guī)溶劑（分析純，麥克林試劑有限公司和上海化學(xué)試劑廠）。

1.2 化合物合成

1.2.1 4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯酚（2）的合成

在含有30 mL乙腈的圓底燒瓶中依次加入甲酰肼(0.58 g，10 mmol），DMF-DMA（1.19 g，10 mmol)，60 ℃攪拌30 min后加入對氨基酚（1.09 g，10 mmol）和6 mL乙酸，升溫至120 ℃反應(yīng)約10 h（TLC跟蹤，展開劑:V二氯甲烷/甲醇=15:1）。濃縮至一半溶劑，冷卻，抽濾，少量乙腈洗滌，干燥得到化合物2。

1.2.2 2-(4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯酚)乙酸乙酯（3）的合成

在含有30 mL乙腈的圓底燒瓶中依次加入化合物2 (0.64 g，4 mmol)，氯乙酸乙酯（0.98 g，8 mmol)，粉末狀KOH（0.67 g，12 mmol)。 90 oC下攪拌回流8 h（TLC跟蹤，展開劑：V二氯甲烷/甲醇=15：1）。減壓蒸干溶劑，加入20 mL水，抽濾，干燥，得到化合物3。

1.2.3 2-(4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯氧基)乙酰肼（4）的合成

將化合物3（4.00 g，16 mmol)和15 mL水合肼 (80%) 混合后，在120 oC下攪拌反應(yīng)約3 h（TLC跟蹤，展開劑：V二氯甲烷/甲醇=15:1）。冷卻，抽濾，乙醇重結(jié)晶得化合物4。

1.2.4 2-(4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯氧基)-N'-苯亞甲/乙基乙酰肼（5a-5o）的合成

以化合物5a為例：在50 mL圓底燒瓶中依次加入化合物4 (0.50 g，2 mmol)，苯甲醛（0.23 g，2 mmol)，6滴醋酸和20 mL乙醇。加畢于室溫攪拌5 h（TLC跟蹤，展開劑:V二氯甲烷/甲醇=15:1）。濃縮部分溶劑，冷卻，抽濾，乙醇重結(jié)晶得化合物5a。相同條件下，用其他取代苯甲醛制備得到化合物5b-5j，用其他取代基苯乙酮制備得到化合物5l-5o?；衔锏睦砘再|(zhì)和波譜數(shù)據(jù)如下：

2-(4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯氧基)--苯亞甲基乙酰肼 (5a)：

熔點205~207℃, 產(chǎn)率48 %。1H-NMR (DMSO-6, 400MHz):5.24 (s, 2H, OCH2), 7.12 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.43-7.45 (m,3H, Ph-H), 7.59 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.70-7.74 (m,2H, Ph-H), 8.03 (s, 1H, N=CH),9.01 (s, 2H, Triazole-H), 11.68 (s, 1H, CONH).13C-NMR (DMSO-6,100MHz):169.26, 158.33, 144.39, 142.11, 134.42, 130.46, 129.27, 127.61, 127.43, 123.39, 116.11, 65.50。

2-(4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯氧基)--(2-氟苯亞甲基)乙酰肼 (5b)：

熔點 150~152℃, 產(chǎn)率 51 %。1H-NMR (DMSO-6, 400MHz):5.25 (s, 2H, OCH2), 7.13 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.27-7.50 (m, 4H, Ph-H), 7.59 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 8.24 (s, 1H, N=CH), 9.01 (s, 2H, Triazole-H), 11.76 (s, 1H, CONH).13C-NMR (DMSO-6,100MHz):169.39, 161.14(d,1c-f= 248.3 Hz), 158.29, 142.12, 137.23, 132.40 (d,3c-f= 8.4 Hz), 127.79, 125.38, 125.35, 123.39, 122.02, 121.92, 116.22 (d,2c-f= 21.7 Hz), 65.47。

2-(4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯氧基)--(3-氟苯亞甲基)乙酰肼 (5c)：

熔點216~219℃, 產(chǎn)率36 %。1H-NMR (DMSO-6, 400MHz):5.26 (s, 2H, OCH2), 7.13 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.26-7.62 (m,6H, Ph-H), 8.03 (s, 1H, N=CH),9.02 (s, 2H, Triazole-H), 11.75 (s, 1H, CONH).13C-NMR (DMSO-6,100MHz):168.43, 161.83 (d,1c-f= 242.0 Hz), 157.25, 141.90, 141.04, 127.17, 126.71, 122.95, 122.32 (d,3c-f= 5.8 Hz), 116.11 (d,2c-f= 21.3 Hz), 115.23, 115.07, 112.23 (d,2c-f= 22.4 Hz), 64.46。

2-(4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯氧基)--(4-氟苯亞甲基)乙酰肼 (5d)：

熔點202~204℃, 產(chǎn)率65 %。1H-NMR (DMSO-6, 400MHz):5.24 (s, 2H, OCH2), 7.12 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.27-7.32 (m,2H, Ph-H), 7.59 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.75-7.82 (m,2H, Ph-H), 8.02 (s, 1H, N=CH),9.02 (s, 2H, Triazole-H), 11.66 (s, 1H, CONH).13C-NMR (DMSO-6,100MHz):169.28, 163.38 (d,1c-f= 219.1 Hz), 158.31, 147.34, 143.22, 142.12, 142.06, 129.63 (d,3c-f= 8.5 Hz), 127.76, 123.40 (d,4c-f= 4.3 Hz), 116.19 (d,2c-f= 18.8 Hz), 65.48。

2-(4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯氧基)--(2-氯苯亞甲基)乙酰肼 (5e)：

熔點106~109 ℃, 產(chǎn)率66 %。1H-NMR (DMSO-6, 400MHz):5.27 (s, 2H, OCH2), 7.13 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.43-7.55 (m,4H, Ph-H), 7.59 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 8.42 (s, 1H, N=CH),9.02 (s, 2H, Triazole-H), 11.83 (s, 1H, CONH).13C-NMR (DMSO-6,100MHz):169.46, 158.28, 144.36, 142.12, 140.38, 133.44, 131.88, 131.68, 130.35, 128.05, 127.55, 123.37, 116.12, 65.51。

2-(4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯氧基)--(3-氯苯亞甲基)乙酰肼 (5f)：

熔點 225~226℃, 產(chǎn)率 71.4 %。1H-NMR (DMSO-6, 400MHz):5.26 (s, 2H, OCH2), 7.13 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.47-7.49 (m, 2H, Ph-H), 7.59 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.66-7.81 (m, 2H, Ph-H), 8.01 (s, 1H, N=CH), 9.01 (s, 2H, Triazole-H), 11.73 (s, 1H, CONH).13C-NMR (DMSO-6,100MHz):168.44, 157.23, 141.67, 141.03, 135.59, 133.06, 130.06, 129.02, 126.69, 125.53, 125.27, 122.26, 115.05, 64.46。

2-(4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯氧基)--(4-氯苯亞甲基)乙酰肼 (5g)：

熔點 233~235℃, 產(chǎn)率 70.1%。1H-NMR (DMSO-6, 400MHz):5.24 (s, 2H, OCH2), 7.12 (d, 2H,= 9.0 Hz, Ph-H), 7.51 (d, 2H,= 8.5 Hz, Ph-H), 7.59 (d, 2H,= 9.0 Hz, Ph-H), 7.76 (d, 2H,= 8.5 Hz, Ph-H), 8.02 (s, 1H, N=CH), 9.02 (s, 2H, Triazole-H), 11.72 (s, 1H, CONH).13C-NMR (DMSO-6,100MHz):169.35, 158.30, 143.08, 142.12, 134.88, 133.38, 129.35, 129.10, 127.77, 123.37, 116.11, 65.47。

2-(4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯氧基)--(4-溴苯亞甲基)乙酰肼 (5h)：

熔點 243~245℃, 產(chǎn)率 70 %。1H-NMR (DMSO-6, 400MHz):5.24 (s, 2H, OCH2), 7.12 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.59 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.65 (d, 2H,= 8.4 Hz, Ph-H), 7.69 (d, 2H,= 8.4 Hz, Ph-H), 8.00 (s, 1H, N=CH), 9.02 (s, 2H, Triazole-H), 11.71 (s, 1H, CONH).13C-NMR (DMSO-6,100MHz):169.36, 158.29, 147.21, 143.19, 142.12, 133.72, 132.25, 129.33, 127.77, 123.37, 116.11, 65.47。

2-(4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯氧基)--(4-甲基苯亞甲基)乙酰肼 (5i )：

熔點220~223℃, 產(chǎn)率47 %。1H-NMR (DMSO-6, 400MHz):2.34 (s, 3H, Ph-CH3), 5.23 (s, 2H, OCH2), 7.12 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.26 (d, 2H,= 8.0 Hz, Ph-H), 7.58-7.66 (m, 4H, Ph-H), 7.99 (s, 1H, N=CH), 9.02 (s, 2H, Triazole-H), 11.59 (s, 1H, CONH).13C-NMR (DMSO-6,100MHz):169.15, 158.33, 144.48, 142.12, 140.26, 131.71, 129.87, 127.60, 127.41, 123.38, 116.10, 65.47, 21.51。

2-(4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯氧基)--(4-甲氧基苯亞甲基)乙酰肼 (5j)：

熔點 188~191℃, 產(chǎn)率 63 %。1H-NMR (DMSO-6, 400MHz):3.80 (s, 3H, Ph-OCH3), 5.21 (s, 2H, OCH2), 7.00 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.11 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.59 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.67 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.97 (s, 1H, N=CH), 9.01 (s, 2H, Triazole-H), 11.52 (s, 1H, CONH).13C-NMR (DMSO-6,100MHz):169.01, 161.20, 158.35, 144.26, 142.12, 129.03, 127.74, 127.01, 123.38, 116.08, 114.75, 65.47, 55.77。

2-(4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯氧基)--(1-苯亞乙基)乙酰肼 (5k)：

熔點 214~216℃, 產(chǎn)率 48.8 %。1H-NMR (DMSO-6, 400MHz):2.28 (s, 3H, CH3), 5.27 (s, 2H, OCH2), 7.11 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.41-7.44 (m, 3H, Ph-H), 7.59 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.82-7.84 (m, 2H, Ph-H), 9.01 (s, 2H, Triazole-H), 10.91 (s, 1H, CONH).13C-NMR (DMSO-6,100MHz):170.12, 158.37, 148.91, 142.12, 138.42, 129.66, 128.85, 127.70, 126.69, 123.37, 116.07, 65.89, 14.04。

2-(4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯氧基)--(1-(4-氟苯亞乙基)乙酰肼 (5l)：

熔點 205~207℃, 產(chǎn)率 64 %。1H-NMR (DMSO-6, 400MHz):2.28 (s, 3H, CH3), 5.27 (s, 2H, OCH2), 7.11 (d, 2H,= 8.9 Hz, Ph-H), 7.23-7.27 (m, 2H, Ph-H), 7.59 (d, 2H,= 8.9 Hz, Ph-H), 7.87-7.90 (m, 2H, Ph-H), 9.00 (s, 2H, Triazole-H), 10.90 (s, 1H, CONH).13C-NMR (DMSO-6,100MHz):170.11, 163.24 (d,1c-f= 245.0 Hz), 158.38, 147.98, 142.10, 134.93, 128.94 (d,3c-f= 8.2 Hz), 127.72, 123.37, 116.10, 115.70 (d,2c-f= 21.5 Hz), 65.91, 14.07。

2-(4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯氧基)--(1-(4-氯苯亞乙基)乙酰肼 (5m)：

熔點210~212℃, 產(chǎn)率53 %。1H-NMR (DMSO-6, 400MHz):2.27 (s, 3H, CH3), 5.27 (s, 2H, OCH2), 7.11 (d, 2H, J = 8.8 Hz, Ph-H), 7.48 (d, 2H,= 8.4 Hz, Ph-H), 7.58 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.85 (d, 2H,= 8.4 Hz, Ph-H),9.00 (s, 2H, Triazole-H), 10.94 (s, 1H, CONH).13C-NMR (DMSO-6,100MHz):169.11, 157.27, 146.66, 141.04, 136.18, 133.28, 127.77, 127.41, 126.63, 122.28, 115.00, 64.80, 12.85。

2-(4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯氧基)--(1-(4-甲基苯亞乙基)乙酰肼 (5n)：

熔點 193-194℃, 產(chǎn)率 64 %。1H-NMR (DMSO-6, 400MHz):2.25 (s, 3H, N=CCH3), 2.33 (s, 3H, Ph-CH3), 5.25 (s, 2H, OCH2), 7.10 (d, 2H,= 8.5 Hz, Ph-H), 7.22 (d, 2H,= 8.0 Hz, Ph-H), 7.58 (d, 2H,= 8.5 Hz, Ph-H), 7.72 (d, 2H,= 8.0 Hz, Ph-H), 9.00 (s, 2H, Triazole-H), 10.83 (s, 1H, CONH).13C-NMR (DMSO-6,100MHz):170.01, 158.41, 149.00, 142.10, 139.25, 135.69, 129.42, 127.72, 126.61, 123.39, 116.09, 65.93, 21.29, 13.97。

2-(4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯氧基)--(1-(4-甲氧基苯亞乙基)乙酰肼 (5o)：

熔點 225~228 ℃，產(chǎn)率 76.3 %。1H-NMR (DMSO-6, 400MHz):2.24 (s, 3H, N=CCH3), 3.79 (s, 3H, OCH3), 5.25 (s, 2H, OCH2), 6.97 (d, 2H,= 8.9 Hz, Ph-H), 7.10 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.58 (d, 2H,= 8.8 Hz, Ph-H), 7.78 (d, 2H,= 8.9 Hz, Ph-H), 9.00 (s, 2H, Triazole-H), 10.78 (s, 1H, CONH).13C-NMR (DMSO-6,100MHz):169.90, 160.65, 158.41, 148.79, 142.11, 130.94, 130.89, 128.15, 123.38, 116.08, 114.19, 65.91, 55.71, 13.91。

1.3 化合物抗驚厥活性及神經(jīng)毒性評價

按照美國NIH的抗癲癇藥物開發(fā)方案，采用最大電驚厥模型和皮下戊四唑模型評價目標化合物的抗癲癇活性，旋轉(zhuǎn)棒法評價目標化合物的神經(jīng)毒性[16-17]。實驗動物采用昆明種小鼠（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2016-0003），體重（18~22） g，雌雄均可。實驗前3 d飼養(yǎng)于23~27 ℃、相對濕度45%~65% 的實驗室中，實驗時間以外可以自由采食和飲水。測試化合物均用DMSO溶解，以0.05 mL/20 g容積腹腔注射，評價化合物在300、100、30 mg/kg三個劑下的抗癲癇活性和神經(jīng)毒性?；钚杂^測時間為給藥后0.5 h。

最大電休克發(fā)作實驗(MES)：使用110 V，60 Hz的交流電，小鼠耳電極通電0.3 s，出現(xiàn)后肢強直的視為驚厥。正式實驗前一天預(yù)篩小鼠，出現(xiàn)驚厥的小鼠用于正式實驗。腹腔給藥后0.5 h對小鼠進行電刺激，觀察藥物的抗電誘導(dǎo)驚厥活性而不出現(xiàn)后肢強直，視為化合物在該劑量下有效。

皮下戊四唑?qū)嶒?-PTZ)：小鼠給藥后0.5 h皮下給予85 mg/kg的戊四唑（該劑量可以使97%以上的小鼠產(chǎn)生連續(xù)5 s的陣攣性驚厥），小鼠單獨放置在鼠籠中觀察30 min，以沒有出現(xiàn)連續(xù)5 s以上的陣攣性驚厥為有效，認為該化合物可以對抗由戊四唑誘導(dǎo)的驚厥。

神經(jīng)毒性實驗：神經(jīng)毒性實驗采用旋轉(zhuǎn)棒法，于給藥0.5 h后將小鼠置于直徑1英寸、轉(zhuǎn)速為6 r/min的木棒上，在連續(xù)3次的測試中小鼠均不能在木棒保持1 min而掉下視為有神經(jīng)毒性，反之則無神經(jīng)毒性。

1.4 細胞培養(yǎng)與ELISA實驗（TNF-α濃度測定）

小鼠RAW264.7 巨噬細胞（北京協(xié)和細胞庫，北京）用添加了10% FBS（BI生物有限公司，批號：1552680）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素混合液（索萊寶科技有限公司，批號：20160909）的RPMI 1640 完全高糖培養(yǎng)基 (杭州四季青生物工程有限公司，批號：170504)于37oC 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24 h更換培養(yǎng)基，細胞生長至 90%傳代。待細胞傳至3代，狀態(tài)穩(wěn)定后，用于實驗。將細胞接種到24孔板中，培養(yǎng)24 h后，藥物組加入20 μg/mL的化合物或陽性藥地塞米松（DXMS）預(yù)處理4 h，然后加入LPS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) (1 μg/mL)培養(yǎng)24 h。收集培養(yǎng)液，1000 rpm離心10 min后取上清液，使用小鼠TNF-α ELISA試劑盒(San diego, CA, USA)檢測TNF-α濃度水平。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成部分

本實驗以以對氨基酚為起始原料，與甲酰肼和DMF-DMA發(fā)生環(huán)合反應(yīng)，得到4-(4-1,2,4-三唑-4-基)苯酚（2），然后與氯乙酸乙酯在氫氧化鉀催化下進行取代反應(yīng)得到取代乙酸乙酯（3），化合物3在水合肼中進行氨解反應(yīng)得到酰肼（4），最后與芳香醛（酮）縮合得到目標化合物5a-5o。并目標化合物結(jié)構(gòu)通過核磁共振氫譜和碳譜來進行確證。結(jié)構(gòu)解析以化合物5a為例：在1H-NMR 中，5.24處的單峰為乙?；螩H2的吸收峰，7.12和7.59處的雙重峰為對位取代苯環(huán)上的質(zhì)子吸收峰，7.43-7.45范圍和7.70-7.74 范圍的兩處多重峰則是末端苯環(huán)上的5個質(zhì)子的吸收峰，8.03處的單峰為席夫堿上的質(zhì)子信號，9.01和13.68位置的兩個單峰則分別為三氮唑和酰胺上的質(zhì)子吸收峰。13C NMR譜也準確的給出了該化合物結(jié)構(gòu)的各種信息，恰好是12種不同化學(xué)環(huán)境的碳。結(jié)合氫譜和碳譜可以確證其分子結(jié)構(gòu)。

目標化合物5a-5o的合成路線

2.2 藥理實驗部分

2.2.1 抗癲癇活性

本實驗采用MES和-PTZ 模型來評價目標化合物5a-5o的抗癲癇活性。雖然兩個模型在對難治性癲癇的藥物篩選方面有所欠缺，但目前依然是抗癲癇藥物篩選的首要選擇，被美國NIH列舉為主要的抗癲癇藥物篩選模型[18]。其中MES 模型用于篩選能對抗全身強直陣攣性發(fā)作的候選藥[19]，而Sc-PTZ 模型則用來篩選失神發(fā)作的候選藥物[20]。本實驗對目標化合物進行了30、100、300 mg/kg 三個劑量的活性和神經(jīng)毒性初步評價，其結(jié)果見表1?；衔?b在100 mg/kg劑量下表現(xiàn)出對抗電刺激所致驚厥活性，化合物5c-5d, 5i和5k-5o在300 mg/kg劑量下表現(xiàn)出對抗電刺激所致驚厥活性。其他化合物在最大劑量300 mg/kg 下未見抗電驚厥活性。

在scPTZ實驗中，化合物的抗驚厥活性與在MES模型中的表現(xiàn)基本相同，除了化合物5l和5m在300 mg/kg劑量下未見抗戊四唑所致驚厥活性。旋轉(zhuǎn)棒實驗?zāi)Ｐ椭?，所有化合物在最大劑?00 mg/kg下均未表現(xiàn)出神經(jīng)毒性，說明此系列化合物安全性良好?？偟膩碚f，該系列化合物的抗癲癇活性沒有達到預(yù)期，比之前報道的苯基三唑化合物明顯偏低，這可能是酰腙引入的位置占據(jù)了苯基三唑類分子與相關(guān)受體疏水性結(jié)合部位，并且較大的極性導(dǎo)致了分子高親水性，從而影響其透過血腦屏障來發(fā)揮體內(nèi)抗癲癇活性。

表1 化合物5a-5o的抗癲癇活性及神經(jīng)毒性（小鼠腹腔給藥）

Table 1 Anticonvulsant activity and neurotoxicity of compounds 5a-5o in mice

CompoundsR1R2Intraperitioneal injection in micea MESb Sc-PTZc NTd 5aHH- - - 5bHo-F100 100 - 5cHm-F300 300 - 5dHp-F300 300 - 5eHo-Cl- - - 5fHm-Cl- - - 5gHp-Cl- - - 5hHp-Br- - - 5iHp-CH3300 300 - 5jHp-OCH3- - - 5kCH3H300 - - 5lCH3p-F300 - - 5mCH3p-Cl300 - - 5nCH3p-CH3300 300 - 5oCH3p-OCH3300 300 -

a每組動物數(shù)3只，給藥劑量為30、100、300 mg/kg。表中數(shù)據(jù)表示該劑量下超過一半小鼠被保護，檢測時間為給藥后半小時后，-表示在300 mg/kg下未見活性或者神經(jīng)毒性；b最大電休克發(fā)作實驗；c皮下戊四唑?qū)嶒?；d神經(jīng)毒性評價(轉(zhuǎn)棒實驗)。

2.2.2 抗炎活性

脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁外壁的組成成分，被認為是通過刺激炎性細胞因子（如腫瘤壞死因子（TNF-α）的釋放而啟動炎癥過程的主要危險因素[21]。LPS誘導(dǎo)TNF-α 釋放模型被認為是一種有效的用于篩選抗炎活性的體外模型[22]。在本研究中，通過建立LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細胞炎癥模型來篩選化合物5a-5o的體外抗炎活性。如圖1所示，被LPS刺激的RAW 264.7細胞TNF-α濃度顯著升高，陽性藥地塞米松可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α濃度的升高。篩選化合物中，5a-5h和5k-5m均表現(xiàn)出明顯的抗炎活性，可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α濃度的升高。化合物5i, 5j, 5n和5o在測試劑量下對LPS誘導(dǎo)TNF-α釋放也有抑制作用，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異，而這4個化合物恰好都是甲基和甲氧基取代的化合物，這可能是給電子取代基影響了分子與受體的結(jié)合，從而降低了化合物的抗炎活性。

（棒形條代表三孔測定值的平均值 ± 標準誤，**P < 0.01，***P< 0.001，****P < 0.0001，統(tǒng)計分析采用ANOVA followed by Dunnett’s test)

3 小結(jié)

本實驗研究合成了一系列2-(4-(4H-1,2,4-三唑-4-基)苯氧基)-N'-(1-苯亞乙基)乙酰肼類化合物，其結(jié)構(gòu)均經(jīng)過核磁共振譜確證。該系列化合物雖然表現(xiàn)出一定的抗癲癇活性，但沒有達到預(yù)期強度，這可能是酰腙的引入影響了分子與受體的疏水性結(jié)合，并降低了分子的親脂性，從而影響其透過血腦屏障來發(fā)揮體內(nèi)抗癲癇活性。該結(jié)果提示在后續(xù)設(shè)計中可以嘗試調(diào)整酰腙的位置，并保留足夠的分子親脂性片段。此外，該系列化合物在LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細胞炎癥模型中可以顯著抑制TNF-α的釋放，說明其具有良好的抗炎作用，該結(jié)果豐富了三氮唑類化合物在抗炎作用中的應(yīng)用，為后續(xù)抗炎藥物的研究開發(fā)提供了實驗依據(jù)。

[1] 梁樹立. 重視老年癲癇的外科治療[J]. 中華老年心腦血管病雜志, 2018, 20(8): 7-9.

[2] 林玉冰,許梅花．抗癲癇藥物的研究進展[J]. 養(yǎng)生保健指南, 2019(24): 237.

[3] 孔令軍,肖瑞林,朱秋根. 成人癲癇患者生活質(zhì)量的研究[J]. 井岡山學(xué)院學(xué)報, 2007, 28(3): 108-110.

[4] Ganguly S, Jacob S K. Therapeutic Outlook of Pyrazole Analogs: A Mini Review[J]. Mini Rev Med Chem., 2017, 17(11):959-983.

[5] Liu J J, Zhao M Y, Zhang X, et al. Pyrazole derivatives as antitumor, anti-inflammatory and antibacterial agents[J]. Mini Rev Med Chem., 2013, 13(13): 1957-66.

[6] Ali R, Khan M A, Siddiqui N. Past, present and future of antiepileptic drug therapy-finding a place for heterocyclics[J]. Mini Rev Med Chem, 2015, 15(12): 1024-50.

[7] 陳士龍,郭東福,喻圣旺,等. 1-(3-苯氧基丙基)-1H-1,2,4-三氮唑衍生物的合成及其抗驚厥活性[J]. 井岡山大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2019, 40(1):88-93.

[8] 趙克誼,任娜. 三唑類藥物研究新進展[J]. 臨床醫(yī)藥文獻電子雜志, 2015, 2(11): 2041,2043.

[9] 鄧先清. 三唑雜環(huán)衍生物的合成及其抗癲癇活性研究[D]. 延邊：延邊大學(xué), 2013.

[10] Deng X Q, Song M X, Zheng Y, et al. Design, synthesis and evaluation of the antidepressant and anticonvulsant activities of triazole-containing quinolinones[J]. Eur. J. Med. Chem., 2014, 73: 217-224.

[11] Chen J, Sun X Y, Chai K Y, et al. Synthesis and. anticonvulsant evaluation of 4-(4-alkoxylphenyl)-3-ethyl- 4H-1,2,4-triazoles as open- chain analogues of 7-alkoxyl- 4,5-dihydro[1,2,4] triazolo [4,3-a]quinolines[J]. Bioorg. Med. Chem., 2007, 15(21): 6775-81.

[12] Krivoshein A V. Antiepileptic drugs based on the α-substituted amide group pharmacophore: from chemical crystallography to molecular pharmaceutics[J]. Curr Pharm Des., 2016, 22(32):5029-5040.

[13] Angelova V, Karabeliov V, Andreeva-Gateva P A, et al. Recent developments of hydrazide/ hydrazone derivatives and their analogs as anticonvulsant agents in animal models[J]. Drug Dev Res., 2016, 77(7): 379-392.

[14] Kajal A, Bala S, Sharma N, et al. Therapeutic potential of hydrazones as anti-inflammatory agents[J]. Int J Med Chem., 2014, ID761030.

[15] Aggarwal R, Sumran G. An insight on medicinal attributes of 1,2,4-triazoles[J]. Eur J Med Chem., 2020, 205(11):112652.

[16] Krall R L, Penry J K, White B G, et al. Antiepileptic drug development: II. Anticonvulsant drug screening[J]. Epilepsia, 1978, 19(4): 409-28.

[17] Porter R J. Antiepileptic drug development program[J]. Prog Clin Biol Res, 1984, 51(2): 53-66.

[18] Wolfgang L. Animal models of seizures and epilepsy: past, present, and future role for the discovery of antiseizure drugs[J]. Neurochem Res., 2017, 42(7): 1873-1888.

[19] Smith M, Wilcox K S, White H S. Discovery of antiepileptic drugs[J], Neurotherapeutics, 2007, 4(1): 12-17.

[20] White H S. Clinical significance of animal seizure models and mechanism of action studies of potential antiepileptic drugs[J]. Epilepsia, 1997, 38(1): S9-17.

[21] Waseem T, Duxbury M, Ito H, et al. Exogenous ghrelin modulates release of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in LPS-stimulated macrophages through distinct signaling pathways[J]. Surgery, 2008, 143(3): 334-342.

[22] Guruvayoorappan C, Kuttan G. (+)-Catechin inhibits tumour angiogenesis and regulates the production of nitric oxide and TNF-α in LPS-stimulated macrophages[J]. Innate Immunity, 2008, 14(3): 160-174.

SYNTHESIS OF 2-(4-(4-1,2,4-TRIAZOL-4-YL)PHENOXY) ACETYLHYDRAZONES AND THEIR BIOLOGICAL ACTIVITIES

LUO Hui, LIN Li-wen, ZHAO Zi-wei, CHEN Qiu-yan, LIANG Yu-qiu,*DENG Xian-qing

(Health Science Center, Jinggangshan University, Ji′an, Jiangxi 343009, China)

A series of 2-(4-(4-1,2,4-triazol-4-yl) phenoxy-acetylhydrazones (5a-5o) were synthesized using paracetamol as the starting material. The structures of these compounds were confirmed by1H-NMR and13C-NMR spectrum. Their anticonvulsant activities were screened using maximal electroshock shock (MES) and subcutaneous pentylenetetrazole (scPTZ) seizure models in mice. Their neurotoxicity was evaluated with rotarod test.LPS-induced TNF-α model was used to evaluate their anti-inflammatory activity. Their moderate-to-weak anticonvulsant activities were confirmed in the MES and scPTZ models. And no neurotoxicity were found at the dose of 300 mg/kg. What’s more, compounds 5a-5h, and 5k-5m markedly inhibited the expression of TNF-α at the concentration of 20 μg/mL. These facts enrich the antiepileptic and anti-inflammatory structure-activity relationships of triazole derivatives, and provides a certain basis to the research and development of new antiepileptic or anti-inflammatory drugs.

triazole; acetylhydrazone; anticonvulsant; anti-inflammatory; TNF-α

R914.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2021.02.006

1674-8085(2021)02-0032-07

2021-01-07；

2021-02-02

江西省自然科學(xué)基金項目(20202BABL206154); 江西省教育廳科技計劃項目（GJJ190563）

羅 輝(1971-)，男，江西吉安人，副教授，碩士，主要從事化學(xué)與生物學(xué)、分子生物學(xué)研究(E-mail: luohui9898@163.com);

林立文(1999-)，男，青海西寧人，井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)專業(yè)2017級本科生(E-mail:linliwen6825@126.com);

趙紫薇(2000-)，女，云南紅河人，井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)專業(yè)2017級本科生(E-mail:zhaoziwei0205@126.com);

陳秋燕(1998-)，女，江西景德鎮(zhèn)人，井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)專業(yè)2017級本科生(E-mail:chenqiuyann@126.com );

梁雨秋(1998-)，女，江西贛州人，井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)專業(yè)2017級本科生(E-mail:liangyuqiuu@126.com;

*鄧先清(1984-)，男，湖南衡陽人，副教授，博士，主要從事合成藥物化學(xué)研究(E-mail:dengxianqing1211@126.com).