吳家樂

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙，410000）

左旋多巴（L-dopa）是對癥治療帕金森?。≒arkinsons’disease）的最有效藥物，但是，隨著用藥時(shí)間的延長，患者會出現(xiàn)許多運(yùn)動并發(fā)癥，比如異動癥、癥狀波動等，對于PD患者而言，是一種療效方面的嚴(yán)重打擊，更是患者心理防線的重?fù)?，生活質(zhì)量也因此直線下降[1]。幾項(xiàng)動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，左旋多巴在長時(shí)間使用后，PD大鼠會出現(xiàn)異常不自主運(yùn)動（abnormal involuntarymovemen，AIM），而PD大鼠的藥效期也明顯縮短[2-4]。在本次研究中，采用經(jīng)典PD動物模型，探討了不同劑量左旋多巴和不同持續(xù)用藥時(shí)間下大鼠的異常不自主運(yùn)動情況，包括前肢、口面部、軸性和旋轉(zhuǎn)AIM4個(gè)維度，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

健康SD雌性大鼠60只，體重區(qū)間為180-200g，清潔級，維持12h光照/12h黑暗的標(biāo)準(zhǔn)光照周期，自由攝取食物和水。6-羥基多巴、阿撲嗎啡、左旋多巴甲酯、芐絲肼、維生素C、大鼠腦立體定位儀。

1.2 大鼠模型制備

制作PD大鼠的模型，首先，對大鼠腹腔內(nèi)注射氯胺酮進(jìn)行麻醉，劑量為1.25ml/kg，按照平顱頭位把大鼠固定在腦立體定向儀的特定位置。將頭部毛發(fā)剔除干凈，取碘伏給予皮膚表面消毒，隨后，找準(zhǔn)正中線的位置，下刀切開頭皮，利用15%雙氧水灼燒骨膜，暴露顱骨縫、前囟，準(zhǔn)確定位前囟坐標(biāo)，以《大鼠腦立體定位圖譜》為標(biāo)準(zhǔn)，將右側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束的坐標(biāo)明確下來：（1）前囟后3.7mm，矢狀縫右側(cè)1.7mm，顱骨下8.0mm，門齒線-2.4mm。（2）前囟后4.4mm，矢狀縫右側(cè)1.2mm，顱骨下8.0mm。門齒線-2.4mm。

根據(jù)上述的坐標(biāo)下鉆獲得鉆孔，用微量注射器（10uL）取6-羥基多巴6uL（溶于0.2%維生素C生理鹽水，濃度為4ug/uL）進(jìn)行注射，每點(diǎn)3uL，注射速度控制在1uL/min，藥物推注后留針5min再行退針，注意緩慢退出，針頭退出4mm后仍然要有5min的留針，保證針頭逐步完全退出，藥液外溢的問題得到解決。注射完畢后，將切口縫合，將大鼠放回籠內(nèi)，正常喂養(yǎng)。

3w后，大鼠需接受阿撲嗎啡0.5mg/kg腹腔內(nèi)注射誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)，觀察30min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，頻率達(dá)到7次/min以上為模型制作成功。

1.3 分組

準(zhǔn)備不同劑量左旋多巴對大鼠模型進(jìn)行腹腔注射，在連續(xù)3d接受阿撲嗎啡誘導(dǎo)后，對PD大鼠進(jìn)行分組，按照劑量差異作為劃分標(biāo)準(zhǔn)，分別為小、中、大劑量組，每組納入15只，分別給予左旋多巴20mg/kg/d、50mg/kg/d、100mg/kg/d，通過加入25mg/kg/d的芐絲肼，現(xiàn)配現(xiàn)用。分別于上午9點(diǎn)和下午5點(diǎn)給予腹腔注射，持續(xù)注射4周。另有15只納入對照組，給予左旋多巴以外的液體注射。

1.4 觀察指標(biāo)

治療期間，對大鼠AIM行為和旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行觀察，分別在治療第1d、1w、2w、3w、4w對數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄和評分。AIM評分可涉及前肢AIM、口面部AIM、軸性AIM和旋轉(zhuǎn)AIM，不同的維度下，根據(jù)嚴(yán)重程度差異分為5個(gè)等級，分別用0-4表示，0代表無，1代表持續(xù)時(shí)間低于30s，2代表持續(xù)時(shí)間超過30s但是不高于60s，3代表持續(xù)時(shí)間超過60s，但是外界刺激可讓其停止，4則表示持續(xù)時(shí)間在60s以上，而且，在外界的刺激下其也不能停止。每次記錄時(shí)間是在用藥后的20min，觀察時(shí)間持續(xù)1min。

藥效期計(jì)算方法為：計(jì)數(shù)用藥后每5min的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，把旋轉(zhuǎn)圈數(shù)增至劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的20%的第一個(gè)5min到降至該值的第一個(gè)5min之間的時(shí)間，即旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時(shí)間，記錄旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時(shí)間的長短。腦組織石蠟塊切片，厚度為5um，按照Seaton方法進(jìn)行黑質(zhì)凋亡細(xì)胞檢測。Bcl-2mRNA采用原位分子雜交法進(jìn)行測定，標(biāo)記探針為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。

2 結(jié)果

2.1 左旋多巴對運(yùn)動并發(fā)癥大鼠模型AIM各項(xiàng)評分的影響

從圖1中可得，隨著治療時(shí)間的延長，大鼠模型中小劑量組、中劑量組口面AIM評分有上升趨勢，大劑量組口面AIM評分有向下趨勢。小劑量組前肢AIM評分有向上趨勢，中劑量組和大劑量組前肢AIM評分有下降趨勢。小劑量組、中劑量組軸向AIM評分有上升趨勢，大劑量組軸向AIM評分有下降趨勢。小劑量組、中劑量組、大劑量組旋轉(zhuǎn)AIM變化趨勢不明顯。

圖1 左旋多巴對運(yùn)動并發(fā)癥大鼠模型AIM各項(xiàng)評分的影響（左上為口面AIM結(jié)果，左下為軸向AIM結(jié)果，右上為前肢AIM結(jié)果，右下為旋轉(zhuǎn)AIM結(jié)果）

在用藥1d、1w、2w，三組大鼠前肢、口面、軸向AIM相比，差異不明顯，在用藥后，分析旋轉(zhuǎn)AIM可得，小劑量組的評分顯著低于另外兩組，F(xiàn)=4.2142，3.4189，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是中劑量組和大劑量組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

在用藥3w、4w后，組間比較顯示，前肢AIM、口面部AIM評分差別不明顯，而在軸向AIM評分方面，小劑量組高于大劑量組，F(xiàn)=4.8821，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小劑量組和中劑量組以及中劑量組和大劑量組兩兩相比，差異不明顯。旋轉(zhuǎn)AIM分析顯示，大、中劑量組評分在任一時(shí)間點(diǎn)的觀察結(jié)果顯示均顯著高于小劑量組，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 左旋多巴對運(yùn)動并發(fā)癥大鼠模型總AIM評分的影響

由圖2可得，隨著治療時(shí)間的延長，大鼠模型中小劑量組、中劑量組AIM總評分有上升趨勢，大劑量組AIM總評分有略微下降趨勢。在用藥1d和1w時(shí)，大劑量組AIM評分均高于小劑量組，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中劑量組和小劑量組組間未見明顯差異。用藥第2w、3w和4w時(shí)，3組大鼠總AIM評分均無明顯差異。

圖2 左旋多巴對運(yùn)動并發(fā)癥大鼠模型總AIM評分的影響

2.3 左旋多巴對運(yùn)動并發(fā)癥大鼠模型藥效期的影響

在第1d、1w、2w、3w、4w時(shí)的旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時(shí)間對比中顯示，小劑量組和大劑量組在第1w、2w、3w、4w的旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時(shí)間明顯減少，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在中劑量組中，第2w、3w、4w的旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時(shí)間均明顯少于1d時(shí)的旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時(shí)間，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是，在比較用藥開始到結(jié)束時(shí)的旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時(shí)間發(fā)現(xiàn)，在減小幅度方面，小劑量組和中劑量組顯著小于大劑量組，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見下表1。

表1 左旋多巴對運(yùn)動并發(fā)癥大鼠模型藥效期的影響

2.4 左旋多巴誘導(dǎo)運(yùn)動并發(fā)癥大鼠模型黑質(zhì)細(xì)胞凋亡的結(jié)果

詳見下表2，所有分組的大鼠黑質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)量均隨著時(shí)間的推移而下降，組間比較顯示，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)大劑量組細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著高于中劑量組、小劑量組和對照組，經(jīng)檢驗(yàn)，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在bcl-2mRNA表達(dá)方面（見下表3），對照組與小劑量組無明顯差異，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異不明顯，中劑量組比對照組、小劑量組顯著升高，大劑量組比中劑量組、小劑量組、對照組顯著升高，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 PD大鼠黑質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)量

表3 PD大鼠黑質(zhì)細(xì)胞bcl-2mRNA陽性表達(dá)（%）

3 討論

PD是一種以震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動減少、運(yùn)動姿勢異常為特征的慢性疾病，屬于神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的一種。隨著人口老齡化問題的凸顯，PD的發(fā)生率明顯升高，嚴(yán)重威脅廣大患者的心身健康和生活質(zhì)量。在臨床實(shí)踐中，左旋多巴是治療PD的金標(biāo)準(zhǔn)藥物，但是，隨著其應(yīng)用時(shí)間的延長，患者會在2-5年出現(xiàn)一定的毒副反應(yīng)，比如運(yùn)動障礙等，這一毒副反應(yīng)比疾病本身給患者帶來的傷害更加嚴(yán)重[5-7]。

在臨床試驗(yàn)中，PD大鼠通過長時(shí)間注射左旋多巴形成的運(yùn)動并發(fā)癥模型研究帕金森病運(yùn)動并發(fā)癥的最普遍動物模型，也是最經(jīng)濟(jì)可靠的模型。在試驗(yàn)過程中，對于大鼠模型行為學(xué)的評價(jià)，最常用的觀察指標(biāo)就是AIM評分和對側(cè)旋轉(zhuǎn)反應(yīng)。有研究[8-12]中顯示，在制備大鼠模型的過程中，關(guān)于注射劑量進(jìn)行了研究，區(qū)間分布在6mg/kg/d-100mg/kg/d，研究[13]顯示，與小劑量左旋多巴相比，大劑量左旋多巴的應(yīng)用，可使PD大鼠的AIM評分明顯增加。但是，也有研究[14]發(fā)現(xiàn)，大劑量左旋多巴的應(yīng)用可能引發(fā)PD大鼠劇烈的旋轉(zhuǎn)AIM，從而影響了AIM的評分結(jié)果。因此，在本次研究中，所選擇小、中、大三種劑量，對模型大鼠進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，AIM評分結(jié)果中，大劑量組和中劑量組顯著高于小劑量組和對照組，3組大鼠在軸向AIM評分方面在用藥初期（第1d、1w、2w）的差異不明顯，在隨后的觀察中，大劑量組的軸向評分明顯低于小劑量組（P＜0.05），可能的因素在于左旋多巴的大量應(yīng)用，旋轉(zhuǎn)運(yùn)動劇烈，對軸向AIM造成了干擾。而隨著左旋多巴應(yīng)用劑量的上升，口面AIM和前肢AIM的評分并沒有增加，軸向AIM的評分反而被削弱，推測也與劇烈旋轉(zhuǎn)AIM干擾有關(guān)。

對旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時(shí)間的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在劑量不同的組別內(nèi)，PD大鼠的旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時(shí)間也存在明顯不同，但是，在旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時(shí)間縮短程度的比較中，大劑量組的大鼠要更加顯著區(qū)別于中劑量組和小劑量組，而且，而且，通過大劑量的注射后，給PD大鼠造成的持續(xù)時(shí)間得到延長，旋轉(zhuǎn)反應(yīng)表現(xiàn)也更加穩(wěn)定。有學(xué)者在實(shí)驗(yàn)后指出，由于谷氨酸受體拮抗劑的作用，導(dǎo)致了下丘腦核損傷，以及兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的使用，PD大鼠的旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時(shí)間得到明顯縮短，效果顯著，可見，其對PD患者的療效減退這一問題具有良好的預(yù)防作用。這也充分佐證了PD大鼠在注左旋多巴后所體現(xiàn)出來的旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時(shí)間縮短具有著同樣的藥理作用，與PD患者的療效減退別無二致，由此可得，其可以作為重要的療效評價(jià)指標(biāo)[15-16]。本課題的研究結(jié)果指出，出于不同劑量的對比，大劑量的注射左旋多巴表現(xiàn)出的旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時(shí)間縮短更為穩(wěn)定。這一指標(biāo)也顯示出了大鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的受損程度。隨著用藥劑量的增加，大鼠體內(nèi)存留的藥物量也就越大，所帶來的神經(jīng)毒性也更加嚴(yán)重，從而對黑質(zhì)細(xì)胞造成了更加嚴(yán)重的損傷，在小劑量組內(nèi)，細(xì)胞凋亡幅度最小，這充分證明小劑量左旋多巴可以達(dá)到治療PD的效果，從而也保證了神經(jīng)毒性的最小化。進(jìn)一步開展左旋多巴神經(jīng)毒性作用的分子生物學(xué)機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑量左旋多巴對細(xì)胞凋亡抑制基因bcl-2mRNA的表達(dá)產(chǎn)生了重要影響，隨著治療時(shí)間、用藥劑量的增加，bcl-2mRNA陽性表達(dá)率增加，表達(dá)部位在黑質(zhì)細(xì)胞漿。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，bcl-2mRNA能夠?qū)Υ笫蠛谫|(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，避免其產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。而bcl-2mRNA的過度表達(dá)，能夠組織細(xì)胞凋亡，特別是由自由基損傷造成的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

因此，在臨床實(shí)踐中，應(yīng)用左旋多巴對PD患者治療時(shí)，應(yīng)該從最小劑量開始，并逐步尋找最佳的劑量范圍，減少患者的神經(jīng)毒性作用。bcl-2mRNA為左旋多巴誘發(fā)黑質(zhì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控基因，當(dāng)產(chǎn)生神經(jīng)毒性后，可以嘗試延長服藥間隔時(shí)間或者停藥一段時(shí)間。