尹文露，劉 麗，趙譚軍，韓森榮，宋 堅(jiān)，李瑩瑩，常亞青，湛垚垚

（大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023）

0 引言

MicroRNAs(MiRNAs)是一類由真核生物內(nèi)源基因編碼產(chǎn)生的長(zhǎng)度約為20 nt的調(diào)控型非編碼RNAs(non-coding RNAs，ncRNAs)，主要通過mRNA剪切和抑制蛋白質(zhì)翻譯等方式調(diào)控靶基因的表達(dá)。自1993年在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中首次發(fā)現(xiàn)miRNA——lin-4以來(lái)[1]，關(guān)于真核生物體內(nèi)miRNAs的鑒定及其生物學(xué)功能的研究便廣泛開展了起來(lái)?，F(xiàn)已證實(shí)，miRNAs可通過調(diào)控生物體內(nèi)約50%以上的蛋白質(zhì)編碼基因，參與生長(zhǎng)發(fā)育[2]、免疫防御[3]和生理代謝[4]等多種生命過程。此外，研究發(fā)現(xiàn)miRNAs對(duì)其靶基因的調(diào)控還具有多向性和復(fù)雜性的特點(diǎn)，即miRNAs既可以對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行負(fù)向調(diào)控又可以進(jìn)行正向調(diào)控[5-6]，同一個(gè)miRNA可調(diào)控多個(gè)甚至上千個(gè)靶基因的表達(dá)，而同一個(gè)靶基因的表達(dá)也可以受到多個(gè)miRNAs的調(diào)控[6-7]。

海膽(sea urchins)和海參(sea cucumbers)屬棘皮類動(dòng)物(echinoderms)，是高等海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的重要代表物種，其中某些種類還是重要的世界性漁業(yè)資源，具有較高的商業(yè)價(jià)值。比如，海膽綱中的中間球海膽(Strongylocentrotus intermedius)，被認(rèn)為是海膽中性腺品質(zhì)最好的種類，是中國(guó)重要的海膽?zhàn)B殖品種和出口海產(chǎn)品種類，市場(chǎng)需求量逐年增加。海參綱中的刺參(Apostichopus japonicas)在亞洲被譽(yù)為“海產(chǎn)八珍”之首，其產(chǎn)業(yè)規(guī)模從1980年開始迅速擴(kuò)張，目前西太平洋地區(qū)刺參的平均年養(yǎng)殖產(chǎn)量已經(jīng)從2008年的9.3×104t[8]增加到2018年的1.74×105t[9]。近年來(lái)，探明各類miRNAs在海膽和海參生長(zhǎng)發(fā)育以及生理代謝過程中的調(diào)控功能及調(diào)控機(jī)制已逐漸成為海膽和海參研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，因此，本研究中綜述了近年來(lái)海膽和海參中miRNAs的研究相關(guān)成果及進(jìn)展，以期進(jìn)一步豐富和完善海膽和海參中miRNAs的基礎(chǔ)資料，為系統(tǒng)了解和掌握海膽和海參中miRNAs的序列特點(diǎn)、生物學(xué)功能及其參與調(diào)控重要生理過程的分子機(jī)制提供參考資料。

1 動(dòng)物體內(nèi)miRNAs的成熟及其調(diào)控機(jī)制

在動(dòng)物體內(nèi)，miRNA的成熟可分為4個(gè)階段（圖1）：（1）細(xì)胞核中初級(jí) miRNA(primary miRNA，primiRNA)的生成——miRNA基因絕大部分由RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄[10]，極小部分由RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymeraseⅢ)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄[11]，形成長(zhǎng)度為300～1000 nt的pri-miRNA；（2）pri-miRNA加工轉(zhuǎn)化為miRNA前體(precursormiRNA，premiRNA)——pri-miRNA會(huì)在細(xì)胞核中被核糖核酸酶ⅢDrosha(ribonucleaseⅢ Drosha)和RNA結(jié)合蛋白(digeorge syndrome chromosomal region 8，DGCR8)復(fù)合體切割成長(zhǎng)約70 nt的發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)pre-miRNA[12]；（3）pre-miRNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)——premiRNA會(huì)被輸出蛋白5(exportin-5)以及GTP結(jié)合蛋白(GTP binding protein)由細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中[13]；（4）miRNA的成熟——pre-miRNA在細(xì)胞質(zhì)中被核糖核酸酶ⅢDicer(ribonucleaseⅢDicer)切割形成約為20 nt左右的成熟miRNA雙鏈復(fù)合體，并與RNA干擾效應(yīng)分子Argonaute蛋白(Ago)一起被整合到效應(yīng)分子中，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)復(fù)合體，通過解旋酶生成2條成熟的miRNA[14]。成熟后的miRNA主要是通過與其靶基因3'非編碼區(qū)域(3'-untranslated region，3'-UTR)中特異性的“種子序列”(seed sequences)的結(jié)合進(jìn)而對(duì)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[15]。此外，miRNA還可以通過與靶基因的編碼區(qū)域(coding sequence)、5'非編碼區(qū)域(5'-untranslated region，5'-UTR)及啟動(dòng)子區(qū)(promoter)進(jìn)行結(jié)合后進(jìn)一步行使其生物學(xué)功能[16-17]。

圖1 動(dòng)物體內(nèi)miRNA的成熟過程示意圖

2 海膽和海參中miRNAs的生物功能

2.1 參與調(diào)控生長(zhǎng)與發(fā)育

生長(zhǎng)發(fā)育是從受精卵至成熟個(gè)體的重要生命現(xiàn)象，也是一個(gè)極其復(fù)雜的動(dòng)態(tài)變化過程。由于海膽作為胚胎發(fā)育生物學(xué)的模式生物已經(jīng)有100多年的歷史，因此，目前關(guān)于海膽和海參中參與調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的miRNAs的研究多集中于miRNAs對(duì)海膽胚胎發(fā)育的調(diào)控作用。

21世紀(jì)初，人們就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNAs對(duì)海膽胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)有著至關(guān)重要的作用。Song等[18]的研究顯示，miRNAs是紫球海膽(Strongylocentrotus purpuratus)胚胎發(fā)育基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，通過抑制dicer和drosha基因的功能來(lái)抑制miRNAs的正常成熟會(huì)導(dǎo)致紫球海膽的胚胎無(wú)法正常發(fā)育，形成原腸胚而導(dǎo)致胚胎死亡。

Wnt信號(hào)通路(Wnt signaling pathway)是影響動(dòng)物胚胎發(fā)育的重要蛋白信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，可介導(dǎo)動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞增殖分化、體軸發(fā)生和形態(tài)形成等多種細(xì)胞反應(yīng)[19]。海膽中的miR-2007和miRDeep2-35240是2個(gè)最早被發(fā)現(xiàn)參與Wnt信號(hào)通路調(diào)控的miRNAs。在紫球海膽中，miR-2007的長(zhǎng)度為25 nt，其種子序列為“-TAAAGTC-”，與Wnt信號(hào)通路中的βcatenin基因的3'非編碼區(qū)有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖2A），miRDeep2-35240的長(zhǎng)度為25 nt，其種子序列為“-TAACGTG-”，與紫海膽Wnt信號(hào)通路中的β-catenin基因的3'非編碼區(qū)有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖2A）。有研究顯示，阻斷miR-2007和miRDeep2-35240與β-catenin基因的結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致紫球海膽個(gè)體的腸和食道肌肉組織的發(fā)育缺陷[20]。值得注意的是，紫球海膽miRDeep2-35240和人類的miR-25有著相同的“種子序列”，且兩者都可以影響Wnt信號(hào)通路中β-catenin基因的表達(dá)[20-21]，提示海膽中的miRDeep2-35240與人類的miR-25可能具有相似的調(diào)節(jié)功能，但兩者的系統(tǒng)進(jìn)化軌跡仍需進(jìn)一步的研究和探索。miR153-3p、miR-2002、miR-200和miRDeep2-30364是最新被證實(shí)參與調(diào)控海膽早期發(fā)育過程中Wnt信號(hào)通路的miRNAs，它們可分別調(diào)控海膽Wnt信號(hào)通路中的編碼不同Dvl蛋白亞型的基因的表達(dá)。Dvl蛋白是Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，起著將細(xì)胞信息傳遞到各種發(fā)育途徑中的重要作用，在海膽中，Dvl蛋白有4個(gè)亞型，分別由dvl5a、dvl1、dvl4a和dvl4b基因編碼[22]。在紫球海膽中，miR-153-3p的長(zhǎng)度為25 nt，其種子序列為“-TAAAAA-”，與紫球海膽Wnt信號(hào)通路中的dvl5a基因的3'非編碼區(qū)有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖2B）；miR-2002的長(zhǎng)度為25 nt，其種子序列為“-CTTATGT-”，與紫球海膽Wnt信號(hào)通路中的dvl4a和dvl1基因的3'非編碼區(qū)均有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖2C）。紫球海膽的miR-200的長(zhǎng)度也為25 nt，其種子序列為“-GTATGAT-”，與紫球海膽Wnt信號(hào)通路中的dvl4b基因的3'非編碼區(qū)有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖2D）。miRDeep2-30364的種子序列為“-TAACGTG-”，其在紫球海膽Wnt通路中dvl5a和dvl1基因的3'非編碼區(qū)均有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖2B、E）。進(jìn)一步的研究指出，阻斷miR153-3p、miR-2002、miR-200和miRDeep2-30364與其靶基因dvl5a、dvl4a、dvl1和dvl4b的結(jié)合，可能會(huì)干擾紫球海膽Wnt信號(hào)的正常轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)紫球海膽浮游幼體的骨針長(zhǎng)度、初級(jí)間充質(zhì)細(xì)胞(primary mesenchyme cell，PMC)的形態(tài)、腸道形態(tài)和纖毛均產(chǎn)生不同程度的影響[22]。此外，miR-2007也可以抑制紫球海膽Wnt信號(hào)通路中Dvl蛋白亞型編碼基因dvl5a、dvl4a和dvl4b的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致紫球海膽Wnt信號(hào)通路紊亂[22]（圖2C、E）。

圖2 miRNAs與Dvl蛋白亞型基因的結(jié)合位點(diǎn)

miRNAs除了通過調(diào)控Wnt信號(hào)通路影響海膽胚胎的發(fā)育外，還可通過其他途徑對(duì)海膽的胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響。比如，miR-31是一種高度保守的miRNA，其成熟序列的長(zhǎng)度在21～24 nt之間并有長(zhǎng)度為16 nt的保守堿基，在脊椎動(dòng)物的成骨細(xì)胞分化中發(fā)揮著重要的作用[23]。在海膽中，miR-31不僅在海膽的早期胚胎發(fā)育中具有較高的相對(duì)表達(dá)水平，在海膽生活周期的其他階段也保持著較為廣泛的表達(dá)。在紫球海膽中，miR-31可以通過種子序列“-TCTTGCC-”與pmar1、alx1、snail和vegfr7基因的3'非編碼區(qū)域完全結(jié)合來(lái)直接抑制這4個(gè)基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)紫球海膽初級(jí)間充質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)形成和骨骼形成的調(diào)控，進(jìn)而影響紫球海膽的胚胎發(fā)育過程[24]。有趣的是，在海膽骨骼形成中發(fā)揮重要作用的除vegfr7基因外，還有與其同屬于同一家族的vegf3基因[25]。雖然vegf3基因的非編碼區(qū)并不存在與miR-31的結(jié)合位點(diǎn)，但是，當(dāng)敲除miR-31基因后，紫球海膽胚胎中的vegf3基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物又會(huì)顯著增加[24]，因此推測(cè)miR-31可能是通過間接方式調(diào)控外胚層中vegf3基因的表達(dá)，但其具體的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

目前，關(guān)于miRNAs調(diào)控海參生長(zhǎng)發(fā)育方面的研究較少?，F(xiàn)有報(bào)道顯示，刺參中的miR-10a-5p、miR-10a和miR-200-3p可能會(huì)通過調(diào)控其潛在的靶基因acadl和hhadh的相對(duì)表達(dá)，影響刺參體內(nèi)線粒體中的脂肪酸β-氧化的速度，進(jìn)而對(duì)刺參的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生相應(yīng)的影響[26-27]。

2.2 參與調(diào)控病原體免疫反應(yīng)

海膽與海參都是推演先天免疫系統(tǒng)起源和進(jìn)化的重要模式生物，但是，由于海參種類在養(yǎng)殖規(guī)模和經(jīng)濟(jì)價(jià)值上要高于海膽類，目前關(guān)于海膽和海參中參與病原體免疫防御反應(yīng)的miRNAs多集中于海參類，尤其是重要的養(yǎng)殖種類——刺參。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNAs對(duì)海參先天免疫防御的調(diào)控主要是通過調(diào)控海參體內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)(complement system)和Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)信號(hào)通路中的相關(guān)因子而實(shí)現(xiàn)的。其中，補(bǔ)體系統(tǒng)是海參先天免疫的重要組成部分，在消除病原菌和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用，而刺參的C3補(bǔ)體(complement component 3，C3)則是刺參補(bǔ)體系統(tǒng)的中心樞紐[28]；而刺參體內(nèi)的TLR信號(hào)通路則是通過特異性銜接子募集來(lái)激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)、干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon-regulatory factors，IRFs)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factors，TNFs)等先天性免疫相關(guān)因子，參與和調(diào)控刺參的免疫應(yīng)答反應(yīng)[29]。

miR-133和miR-137是最早被證實(shí)參與調(diào)控刺參補(bǔ)體系統(tǒng)中心分子——C3補(bǔ)體的重要miRNAs。在刺參中，miR-133的長(zhǎng)度為23 nt，其種子序列為“-UUG GUCC-”，與刺參補(bǔ)體系統(tǒng)中c3基因的3'非編碼區(qū)有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖3）。利用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)對(duì)刺參進(jìn)行免疫刺激后發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激的第6～12 h中，刺參體內(nèi)的miR-133的相對(duì)表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)且在第9 h時(shí)達(dá)到峰值，但在LPS刺激的第9～12 h中，刺參體內(nèi)的c3的相對(duì)表達(dá)卻呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)[30]，即，在LPS刺激后的第9～12 h中，刺參體內(nèi)的miR-133和c3的相對(duì)表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，據(jù)此推斷，miR-133可能通過靶向抑制刺參體內(nèi)c3的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)體系統(tǒng)的免疫應(yīng)答。miR-137是一種通過控制細(xì)胞周期和細(xì)胞分化過程來(lái)影響動(dòng)物疾病發(fā)展的miRNA[31]。在刺參中，miR-137的長(zhǎng)度為22 nt，其種子序列為“-AUUGCUU-”，與刺參的c3基因的3'非編碼區(qū)有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖3）。研究顯示，在LPS刺激9 h后，刺參體內(nèi)的miR-137的相對(duì)表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，miR-137可以抑制刺參體腔細(xì)胞中c3基因的mRNA的翻譯，推測(cè)miR-137可通過靶向調(diào)節(jié)C3蛋白的表達(dá)來(lái)參與刺參的免疫應(yīng)答反應(yīng)[32]。此外，最新的研究還證實(shí)，刺參中的miR-2004和miR-2006也可以通過靶向調(diào)節(jié)c3基因來(lái)參與免疫反應(yīng)[32]。上述研究結(jié)果，不僅在一定程度上揭示了miRNAs對(duì)基因調(diào)節(jié)的多向性和刺參（乃至棘皮動(dòng)物）先天免疫的復(fù)雜性，同時(shí)也為不同miRNAs可以執(zhí)行相同功能來(lái)使基因組功能最大化提供了有力證據(jù)。

圖3 miR-133、miR-137與c3基因的結(jié)合位點(diǎn)

在TLR信號(hào)通路調(diào)控方面，miR-200和miR-2008被證實(shí)可分別靶向調(diào)控2種TLR信號(hào)通路相關(guān)分子——tollip[33]和tlr3[34]參與刺參的先天免疫過程（圖4）。在刺參中，miR-200是一種長(zhǎng)為23 nt的小分子RNA，其種子序列為“-AAUACUG-”位于5'端的2～8位，與TLR信號(hào)通路中tollip基因3'非編碼區(qū)有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖5）。研究表明，miR-200可以靶向TLR通路的成員來(lái)參與TLR信號(hào)的級(jí)聯(lián)調(diào)控[35]。例如，在被燦爛弧菌(Vibrio splendidus)感染的刺參個(gè)體和被LPS刺激的刺參初級(jí)體腔細(xì)胞(primary coelomocytes)中，miR-200和Toll相互作用蛋白(toll-interacting protein，Tollip)在所有檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)均呈正表達(dá)相關(guān)，這一結(jié)果說(shuō)明，刺參中的miR-200具有增強(qiáng)體腔細(xì)胞的抗菌活性和抑制LPS啟動(dòng)的雙重功能[33]。刺參中的miR-2008的長(zhǎng)度為21 nt，其種子序列為“-UCAGCCU-”，與刺參抗細(xì)菌感染關(guān)鍵基因——tlr3的3'非編碼區(qū)有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖5），是海參皮膚潰瘍綜合征(sea cucumber skin ulceration syndrome，SUS)爆發(fā)的重要調(diào)節(jié)因子[34]。研究發(fā)現(xiàn)，在燦爛弧菌感染后的第12 h，刺參中的miR-2008的相對(duì)表達(dá)呈顯著增加趨勢(shì)而tlr3的相對(duì)表達(dá)則呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)[34]，提示在受細(xì)菌感染的刺參中，miR-2008可能通過靶向調(diào)控與TLR途徑相關(guān)的基因來(lái)參與免疫應(yīng)答，但其具體的機(jī)制尚待深入研究。除了上述miRNAs外，miR-133、miR-31和miR-210也被證實(shí)可以通過靶向調(diào)控irapk-1、p105和toll的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)刺參中TLR信號(hào)的級(jí)聯(lián)激活（圖4）[34,36]。

圖4 miRNAs參與TLR信號(hào)通路相關(guān)基因調(diào)控模式圖

圖5 miR-200與tollip基因及miR-2008與tlr3基因的結(jié)合位點(diǎn)

現(xiàn)有研究顯示，miRNAs對(duì)海參的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜，除上述2種途徑外，miR-92a對(duì)14-3-3ζ的調(diào)節(jié)作用也說(shuō)明miRNAs可以通過參與活性氧(reactive oxygen species,ROS)的調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡途徑來(lái)影響海參的免疫反應(yīng)[37]。最近還有研究發(fā)現(xiàn)，一些miRNA可能對(duì)患海參皮膚潰瘍綜合征的刺參的病原菌附著和識(shí)別，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和病變修復(fù)起重要作用[38]。這對(duì)海參的先天免疫應(yīng)答及機(jī)制的研究具有重要的學(xué)術(shù)意義，同時(shí)也對(duì)海參產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展性有著重要的意義。

2.3 參與響應(yīng)環(huán)境應(yīng)激

環(huán)境應(yīng)激是由于外界環(huán)境條件改變而引起的生物個(gè)體生理代謝發(fā)生變化的一種反應(yīng)，也是生物對(duì)生存環(huán)境變化產(chǎn)生的適應(yīng)的前提和基礎(chǔ)。海洋是海膽和海參類動(dòng)物賴以生存的媒介，半開放式的循環(huán)系統(tǒng)決定了海膽和海參類動(dòng)物時(shí)刻與海水發(fā)生著液體交換，因此，海洋環(huán)境因子的而變化對(duì)海膽和海參類動(dòng)物的生存、生理代謝和種群規(guī)模等都具有重要影響。

海水鹽度(sea-water salinity，SS)指的是海水質(zhì)量與水中可溶固體質(zhì)量的比，是影響海膽和海參類生存的重要環(huán)境因子之一。有研究顯示，海膽和海參類動(dòng)物主要通過滲透壓調(diào)節(jié)來(lái)適應(yīng)海水鹽度的變化。研究證實(shí)，刺參中的miR-10具有1個(gè)長(zhǎng)度為7 bp的種子序列“-UGUCCCA-”可以通過與tbc1d5基因的3'UTR相結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)對(duì)tbc1d5基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行負(fù)調(diào)控[39]。TBC1D5不僅是細(xì)胞外環(huán)境中內(nèi)體運(yùn)輸與應(yīng)激性自噬之間的關(guān)鍵分子開關(guān)，還參與了反向轉(zhuǎn)運(yùn)(antiport)和葡萄糖攝取等生理反應(yīng)[40]，這一結(jié)果提示，miR-10在刺參滲透壓調(diào)控方面可能發(fā)揮重要作用。Xian等[41]的研究表明，鹽度脅迫會(huì)影響刺參體內(nèi)K+和Cl-的濃度，此外，向鹽度脅迫處理后的刺參體內(nèi)注射miR-10的模擬物和抑制劑都會(huì)對(duì)刺參體內(nèi)的K+和Cl-濃度產(chǎn)生影響[39]，提示，miR-10在刺參響應(yīng)鹽脅迫和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面具有重要意義。此外，有研究表明，與自然海水鹽度(SS=32)相比，低鹽度脅迫(SS=18)會(huì)誘導(dǎo)刺參體內(nèi)的miRNAs出現(xiàn)差異表達(dá)，其中，miR-124、miR-2010和miR-2013的相對(duì)表達(dá)量在低鹽脅迫組呈下調(diào)趨勢(shì)，而miR-2010、miR-278-3p和miR-2005的相對(duì)表達(dá)量則在低鹽脅迫組呈上調(diào)趨勢(shì)，對(duì)這些差異表達(dá)的miRNAs及其靶基因進(jìn)行研究推測(cè)，刺參可能利用碳水化合物和脂肪酸所代謝的能量通過改變氨基酸代謝、離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等方式來(lái)應(yīng)對(duì)低鹽度脅迫[42]。

海膽和海參類動(dòng)物屬于海洋耗氧生物，因此海水的溶氧量(dissolved oxygen，DO)也是影響海膽和海參類動(dòng)物生存和生理代謝過程的重要海洋環(huán)境因子。Huo等[43]利用比較miRNA組方法研究了不同溶解氧水平下刺參呼吸樹中miRNAs的差異表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(DO=8 mL/L)相比，在嚴(yán)重缺氧條件下(DO=2 mL/L)，miR-31-5p和miR-184的相對(duì)表達(dá)量分別上調(diào)了3.2倍和3.7倍。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-31-5p可以在人類(Homo sapiens)大腸癌中表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用[44]，而egfr基因又與缺氧相關(guān)，提示，刺參體內(nèi)的miR-31-5p可能通過靶向調(diào)控EGFR途徑的關(guān)鍵信號(hào)分子的表達(dá)應(yīng)對(duì)嚴(yán)重缺氧條件。在哺乳動(dòng)物中，miR-184的過度表達(dá)不僅會(huì)在人類成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞(neuroblastoma cells)中會(huì)引起細(xì)胞凋亡[45]，還會(huì)在老年大鼠的腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cell)中加劇氧化損傷并抑制細(xì)胞內(nèi)的自噬(autophagy)反應(yīng)[46]，結(jié)合低氧條件下刺參呼吸樹中miRNAs的差異表達(dá)結(jié)果，推測(cè)刺參可通過miR-184的差異表達(dá)來(lái)靶向調(diào)控細(xì)胞增殖、氧化損傷和自噬相關(guān)等生理過程應(yīng)對(duì)和適應(yīng)低氧脅迫。

海水溫度(sea-water temperature，ST)是表示海水熱力狀況的一個(gè)物理量，是海洋生物生長(zhǎng)繁殖的關(guān)鍵環(huán)境限制因子之一，主要受太陽(yáng)輻射以及海洋與大氣熱交換的作用而發(fā)生改變[47]，大量研究已經(jīng)證實(shí)，環(huán)境溫度的改變不但能影響海膽和海參類動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、攝食行為、生理免疫，還會(huì)影響其新陳代謝和基因的表達(dá)[48-49]。Li等[49]發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(16℃)相比，高溫(26℃)處理6 h后，刺參的腸組織中的miR-493-3p和miR-2981的表達(dá)量均呈顯著上調(diào)趨勢(shì)，其中，miR-493-3p可通過靶向調(diào)控ythdf2基因的表達(dá)而激活細(xì)胞的增殖和遷移[50]；而miR-2981則可通過靶向調(diào)控scl13a5基因增加細(xì)胞中β-氧化的速率[49,51]。因此，上述結(jié)果提示，刺參可能通過改變其體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)提高自身能量代謝來(lái)應(yīng)對(duì)不同程度的高溫脅迫。

3 總結(jié)

綜上可以看出，目前關(guān)于海膽和海參乃至棘皮動(dòng)物中miRNAs的研究仍相對(duì)滯后。其中，對(duì)于海膽類miRNAs的研究多局限于探究其對(duì)胚胎發(fā)育過程的調(diào)控，而對(duì)海參類miRNAs的研究則多強(qiáng)調(diào)其在先天免疫防御和應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫方面的作用。此外，除紫球海膽和刺參外，其他種類海膽和海參中miRNAs的相關(guān)信息仍相對(duì)匱乏。因此，在今后的研究中，首先可以利用高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息分析方法，拓寬海膽和海參miRNAs檢測(cè)的物種范圍，大規(guī)模獲取其他海膽、海參種類中miRNAs的序列和結(jié)構(gòu)信息，進(jìn)一步豐富和擴(kuò)充海膽和海參miRNAs數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)資料，同時(shí)，分析海膽和海參中miRNAs之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，進(jìn)一步系統(tǒng)和深入地了解海膽和海參，乃至棘皮動(dòng)物中miRNAs的演化關(guān)系。此外，通過多組學(xué)聯(lián)動(dòng)分析技術(shù)，進(jìn)一步篩選和鑒定與海膽和海參中miRNAs具有潛在靶向關(guān)系的候選基因，建立miRNAs及其靶基因的互做調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，深入系統(tǒng)開展不同發(fā)育階段、不同地理區(qū)域以及不同病理生理狀態(tài)下海膽和海參中miRNAs及其靶基因的表達(dá)規(guī)律及靶向互做模式，為進(jìn)一步深入闡明海膽和海參中miRNAs的生物調(diào)控功能，全面挖掘海膽和海參中具有學(xué)術(shù)意義和產(chǎn)業(yè)價(jià)值的miRNAs奠定一定的基礎(chǔ)。