張亞楠，陳新慧，張 杰

（農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/植物生產(chǎn)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心/北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206）

0 引言

蘋果炭疽病是蘋果生產(chǎn)中的主要病害之一，其主要致病菌為蘋果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)，以危害蘋果葉片和果實(shí)為主，目前針對該病的防控措施主要為施用化學(xué)藥劑，生產(chǎn)上多以波爾多液和多菌靈交替使用進(jìn)行病害防治，具有一定預(yù)防效果，但需要噴施3～4次，不僅加重果園管理的工作量，也增加了生產(chǎn)成本，且頻繁施用藥劑不僅使種植環(huán)境惡化，更給食品安全帶來極大的隱患[1]。蘋果炭疽病因發(fā)病迅速、潛育期短的特征使蘋果生產(chǎn)者頭痛不已，病原菌一旦侵入寄主組織，幾乎沒有用藥防治的時間，常帶來減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)的危害。目前，利用植物誘導(dǎo)抗病機(jī)制控制病害，能減輕生態(tài)環(huán)境污染，具有持效期長、抗病譜廣等優(yōu)點(diǎn)，是一種植物病害防治的新策略。

miRNA是一類內(nèi)源的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的小RNA，長度19～25個核苷酸(nt)，對靶基因mRNA的作用主要取決于它與靶基因轉(zhuǎn)錄體序列互補(bǔ)的程度，主要有3種方式，第一種是通過堿基互補(bǔ)切割靶基因，第二種抑制靶基因的翻譯但不完全互補(bǔ)結(jié)合，而是阻遏翻譯但不影響mRNA穩(wěn)定性，第三種為結(jié)合抑制，miRNA通過這些方式在真核基因表達(dá)調(diào)控中廣泛存在并具有多樣性[2]。miRNA能否正常表達(dá)，決定了植物是否正常生長發(fā)育，已有研究表明，miRNA廣泛參與調(diào)節(jié)植物生長、器官建成和形態(tài)發(fā)育，轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況是其主要調(diào)控途徑[3]。植物并非總是在正常適宜的環(huán)境中，在其整個生命周期中，會面臨各種各樣的變化，地理因素、氣候條件，尤其是人類活動和工農(nóng)業(yè)發(fā)展也造成了諸多環(huán)境問題和污染，而這些因素的變化超出了植物維持正常生命所能自動調(diào)節(jié)的范圍，使其生長受限、病變甚至死亡。植物所遭受的脅迫通常為生物逆境（病毒、蟲害、雜草等）和理化因素逆境（極端天氣氣候、離子輻射、化學(xué)性鹽堿土危害、大氣、水體、土壤污染、高溫?zé)岷?、低溫冷害和凍害、淹澇?zāi)害和干旱等）。逆境脅迫會誘使植物內(nèi)的基因表達(dá)發(fā)生改變，從而引起形態(tài)結(jié)構(gòu)變化和某些代謝變化，如水分代謝、光合作用、呼吸作用和物質(zhì)代謝。而植物的生理適應(yīng)是多方向的，主要包括滲透調(diào)節(jié)、植物激素和蛋白質(zhì)的適應(yīng)性變化。在脅迫條件下miRNA同樣可以調(diào)控植物的生長發(fā)育，從而增強(qiáng)植物自身對逆境脅迫的適應(yīng)能力，分為避逆性和抗逆性[4]。miRNA可以在相對較短的時間內(nèi)對植物所遭受的外界脅迫做出快速響應(yīng)，通常24 h內(nèi)即有較明顯變化，相應(yīng)地調(diào)整植物相關(guān)形態(tài)等來應(yīng)對，此前已報道很多miRNA參與調(diào)節(jié)植物抗病的分子機(jī)制研究[5]，如受到引起番茄細(xì)菌性葉斑病(Pseudomonas syringaepv.tomato)的病原菌DC3000侵染時，抑制生長素信號，部分由miR393介導(dǎo)的，可能特別促進(jìn)對強(qiáng)致病菌DC3000的抗性，但與小種特異性抗性無關(guān)[6]。在擬南芥中，miR398受到蔗糖的正調(diào)控，導(dǎo)致CSD1和CSD2的mRNA和蛋白質(zhì)的積累減少，由于CSD酶調(diào)節(jié)ROS，miR398的一個作用可能是影響ROS信號的傳導(dǎo)或衰減，在植株遭受氧化脅迫中起著至關(guān)重要的作用[7]。已有研究表明，Pst DC3000（avrRpml或avrRpt2）病原菌侵染模式植物擬南芥時，miRNA398通過改變CSD表達(dá)水平來提高植物應(yīng)對生物脅迫威脅時的抗性[8]。植物miRNAs的一個子集（miR482/2118超家族）可以針對NB-LRR基因調(diào)節(jié)植物免疫，在番茄中miR482/2118通過NBS-LRR來抵抗番茄晚疫病菌的侵染[9-12]。而在馬鈴薯中，miR160通過靶向StARF10，影響防御和生長路徑的平衡，這可能是馬鈴薯植物在疫霉病菌感染過程中調(diào)節(jié)局部和SAR防御反應(yīng)的途徑之一[13]。在水稻中Osa-miR398b通過多種超氧化物歧化酶促進(jìn)H2O2的產(chǎn)生，從而提高水稻對稻瘟病菌的抗性[14]。同樣，水稻中OsamiR1873通過LOC_Os05g01790微調(diào)水稻免疫生長平衡，阻斷Osa-miR1873可以提高稻瘟病抗性，并且產(chǎn)量不受其顯著影響[15]。

因?yàn)閺?fù)雜的致病性，對果樹抗病機(jī)制仍缺乏深入了解，miRNA調(diào)控果樹抗病的相關(guān)分子機(jī)制尚不清楚，對抗病基因資源也缺乏全面的掌握和了解。本研究擬以威脅蘋果屬植物生長發(fā)育的重要病原菌膠胞炭疽為研究對象，測定病原菌侵染后蘋果屬植物中抗性相關(guān)miRNA的表達(dá)量變化，研究miRNA在抗炭疽病中所起到的作用，旨在揭示蘋果屬植物炭疽病抗性的分子調(diào)控機(jī)制提供新的思路，為蘋果屬植物的抗炭疽病尋找新的突破口。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料‘八棱脆’海棠和‘嘎啦’蘋果組培苗由實(shí)驗(yàn)室繼代培養(yǎng)保存。

1.1.2 炭疽病菌株 2019年10月10日在北京市順義區(qū)木林鎮(zhèn)資源圃采集發(fā)病植株，取樣并進(jìn)行病原菌分離與鑒定。膠胞炭疽病菌在PDA培養(yǎng)基（土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，煮軟后8層紗布過濾定容至1000 mL，高壓滅菌鍋115℃20 min）上培養(yǎng)。制備膠胞炭疽病菌孢子懸浮液侵染‘八棱脆’海棠和‘嘎啦’蘋果組培苗，4天后發(fā)病取樣，在液氮中速凍，-80℃保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 膠胞炭疽孢子懸浮液制備 將純化鑒定過的膠胞炭疽菌株接種于PDA平板上，在28℃恒溫箱中培養(yǎng)7天，PDA平板上加入適量無菌水用無菌的玻璃涂布刮取表面菌絲，無菌3層紗布過濾制備分生孢子懸浮液。膠胞炭疽菌孢子懸浮液濃度為1×106個孢子/mL，無菌水為空白對照。

1.2.2 接種處理與取樣 試驗(yàn)設(shè)‘八棱脆’（抗性品種）空白對照、‘八棱脆’接種處理、‘嘎啦’（感病品種）空白對照、‘嘎啦’接種4個處理，每個處理3瓶組培苗，試驗(yàn)設(shè)3組重復(fù)。用噴壺將106個孢子/mL膠胞炭疽孢子懸浮液均勻噴灑到整個幼苗上，直至滴水狀態(tài)，噴施等量無菌水的組培苗作為空白對照。接種4天后發(fā)病，發(fā)病葉片取樣后立即在液氮中冷凍并保存于-80℃冰箱。計算病情指數(shù)[式(1)]，0級，無病斑；1級，病斑面積≤5%；3級，5%＜病斑面積≤10%；5級，10%＜病斑面積≤25%；7級，25%＜病斑面積≤50%；9級，病斑面積＞50%。

1.2.3 植物總RNA提取及反轉(zhuǎn)miRNA采用復(fù)雜植物多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒提取植物葉片總RNA，用全式金試劑反轉(zhuǎn)miRNA。

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR按照SYBR染料法試劑說明書進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測，miRNA以U6作為參照基因，兩步法程序運(yùn)行，所有樣品取樣均為3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)，所用熒光引物見表1。

表1 試驗(yàn)中所用引物

1.2.5 相關(guān)miRNA靶基因預(yù)測 通過靶基因預(yù)測網(wǎng)站psRNATarget對相關(guān)miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測，通過NCBI比對，找到該基因的詳細(xì)描述。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種后蘋果屬植物發(fā)病情況調(diào)查

接種膠胞炭疽（圖1）孢子懸浮液4天，調(diào)查其發(fā)病情況，抗性品種‘八棱脆’葉片只有少數(shù)病斑病害，病情指數(shù)15.4，病葉率27.6%；而感病品種‘嘎啦’則出現(xiàn)大量病斑且植株萎蔫，病情指數(shù)39.3，病葉率71.3%（圖2）。

圖1 菌株形態(tài)學(xué)培養(yǎng)特征

圖2 蘋果屬植物接種膠胞炭疽菌后發(fā)病情況

2.2 抗病相關(guān)的miRNA篩選結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期工作及相關(guān)文獻(xiàn)報道，選出18個抗性相關(guān)miRNA候選待測，測定其在膠胞炭疽孢子懸浮液侵染后相關(guān)表達(dá)量變化。結(jié)果（圖3）顯示，在抗性品種‘ 八 棱 脆 ’中 miR390a、miR393a、miR396b/c/f、miR156a/p/t和miR171i下調(diào)表達(dá)，僅有miR172d和un3729上調(diào)表達(dá)，其余無顯著變化。感病品種‘嘎啦’中miR390a、miR396b/c/f的表達(dá)量是上調(diào)的，miR160a、miR482b、miR156a/aa/ad/t和miR171i是下調(diào)的，其余無顯著變化。

圖3 蘋果屬植物接種膠胞炭疽菌后相關(guān)miRNA表達(dá)量

2.3 相關(guān)miRNA的靶基因預(yù)測

miRNA可導(dǎo)致靶mRNA的降解或者阻遏mRNA的翻譯，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，達(dá)到調(diào)控基因的目的，因此靶基因的預(yù)測研究是探究miRNA功能的重要方式。通過靶基因預(yù)測網(wǎng)站psRNATarger(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)對相關(guān)miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測，篩選并得到高度互補(bǔ)且假陽性低的靶基因（表2）。分析相關(guān)miRNA和其預(yù)測靶基因互補(bǔ)關(guān)系得到圖4。miR390a靶基因多為LRR受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，mi482b靶基因多為抗性蛋白，miR396b/c/f靶基因多為GRF家族和LRR受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，均與抗性相關(guān)。

圖4 相關(guān)miRNA及其靶基因互補(bǔ)性分析

表2 相關(guān)靶基因預(yù)測

3 討論

與動物相似，植物依靠細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的免疫受體來抵御病原體。植物先天免疫的第一道防線是通過細(xì)胞表面局部模式識別受體(PRRs)識別高度保守的微生物/病原體相關(guān)分子模式(MAMPs/PAMPs)，如細(xì)菌鞭毛蛋白或真菌幾丁質(zhì)，從而引發(fā)PAMP觸發(fā)的免疫(PTI)，限制病原體的生長[15-16]。高度進(jìn)化的病原體傳遞效應(yīng)蛋白干擾PTI反應(yīng)[17]。相應(yīng)的，植物已經(jīng)進(jìn)化出細(xì)胞內(nèi)核苷酸結(jié)合域富亮氨酸重復(fù)(NLR)類受體，識別病原體效應(yīng)物并激活效應(yīng)物觸發(fā)免疫(ETI)[18-20]。NBS-LRR蛋白是一類己知的最大的R蛋白家族。近年來，關(guān)于miRNA響應(yīng)非生物脅迫（如抗寒、干旱、重金屬、抗鹽等）的研究報道較多，而關(guān)于抵抗病原菌侵染及抗病相關(guān)研究相對較少。已有研究表明，miRNA參與了多種和抗病相關(guān)的基因表達(dá)，例如MdmiRLn11，尤其在病原菌感染條件下調(diào)控MdNBS基因的表達(dá)，并且MdmiRLn11靶向P-loop位點(diǎn)可能在木本植物中調(diào)控許多NBS LRR蛋白類基因[21]。同樣在蘋果中，MdmiRln20通過抑制MdTN1-GLS的表達(dá)負(fù)調(diào)控對GLS的抗性，并首次證明了miRNA在蘋果對GLS的響應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[22]。楊樹ptc-miR472a通過靶向NBS-LRR轉(zhuǎn)錄本，在植物對C.gloeosporioides和C.chrysosperma的免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。病毒誘導(dǎo)的miR390靶標(biāo)基因沉默(VIGS)增加了棉花植物生長素和茉莉酸(JA)的積累，從而增加了對白粉虱侵襲的耐受性[24]。番茄中miR396通過抑制水楊酸和茉莉酸信號的防御相關(guān)基因，負(fù)調(diào)控番茄對晚疫病菌和灰霉菌侵染的耐受性[25]。試驗(yàn)初步鑒定了3個響應(yīng)蘋果屬植物膠胞炭疽炭疽病菌侵染相關(guān)的miRNA，分別是miR390a、miR482b和miR396b/c/f，在抗性品種中miR390a和miR396b/c/f表達(dá)量下調(diào)，而在感病品種中表達(dá)量上調(diào)，且其靶基因均有LRR受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白，miR482b靶基因?yàn)榭剐缘鞍?，初步認(rèn)定可能在蘋果屬植物炭疽病的侵染中起著重要作用，然而更加明確的分子作用機(jī)理還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。在研究植物miRNA在響應(yīng)生物脅迫或非生物脅迫的功能過程中，靶基因是至關(guān)重要的。目前主要通過預(yù)測軟件進(jìn)行初步預(yù)測篩選，后續(xù)還應(yīng)進(jìn)行5’RACE實(shí)驗(yàn)，對切割位點(diǎn)進(jìn)行確認(rèn)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)miRNA和其真實(shí)靶基因的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系，深入研究其作用機(jī)制。