向小華，李 媛，張興偉，劉國祥，楊 菁，趙文濤，聞 剛，邵 雨，范靜苑，呂洪坤

（1中國煙草總公司海南省公司?？谘┣蜒芯克?，?？?71100；2中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，山東青島266101；3上海新型煙草制品研究院有限公司，上海201315；4海南省煙草公司儋州公司，海南儋州571700；5四川中煙工業(yè)有限責任公司長城雪茄煙廠，四川什邡618400）

0 引言

種質資源遺傳多樣性研究有利于對作物進行可持續(xù)的開發(fā)利用，廣泛考察收集是豐富種質資源遺傳多樣性最有效的方法之一[1]。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部啟動《第三次全國農(nóng)作物種質資源普查與收集行動》以來，煙草種質資源考察收集工作在各地區(qū)有序開展[2-4]。截至2019年底，國家煙草種質資源中期庫保存的資源數(shù)量達6057份，位居世界之首。

為在育種中更準確地利用收集到的煙草新種質，應將種質資源多樣性和遺傳背景分析作為基礎性研究，其主要方法有農(nóng)藝性狀調(diào)查、化學成分分析、評吸鑒定和分子標記。其中，表型性狀鑒定是種質資源遺傳多樣性研究最基本的方法。方敦煌等[5]采用多元統(tǒng)計分析方法對231份烤煙種質的13個主要化學成分和農(nóng)藝性狀進行了遺傳多樣性分析。屈旭等[2]對湖南收集到的23份特色種質的22個農(nóng)藝性狀進行了鑒定和遺傳多樣性分析。鞠馥竹等[6]對5個產(chǎn)區(qū)98份晾曬煙資源進行了農(nóng)藝性狀調(diào)查、化學成分測定以及遺傳多樣性分析，并從中篩選出綜合評價優(yōu)異的8份資源。但表型性狀易受環(huán)境等外在因素的影響，因此應結合分子標記技術更加準確地研究物種的遺傳規(guī)律。SSR標記憑借其操作簡便、穩(wěn)定性高、特異性好等優(yōu)點在煙草以及其他作物的遺傳多樣性研究中被廣泛應用[7-11]。軒貝貝等[12]篩選出8對SSR引物，將9個烤煙品種進行有效區(qū)分；陳芳等[13]利用48個SSR標記對80份煙草材料進行遺傳多樣性分析，從中篩選出4對核心引物構建了數(shù)字指紋圖譜。在曬煙研究方面，李輝等[14]利用25對SSR引物對67份地方曬煙品種進行了遺傳多樣性分析；劉國祥等[3]利用25對SSR標記對33份曬煙材料進行了分析，并從中選取6個標記構建了計算機化的指紋圖譜。

本研究對在海南收集到的23份煙草種質資源進行田間表型鑒定，并利用12對SSR標記對其進行遺傳多樣性分析，繪制SSR指紋圖譜，以期為海南曬煙資源的高效利用、重要基因挖掘、品種選育和新品種審定等工作提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

根據(jù)《第三次全國農(nóng)作物種質資源普查與收集行動》的要求，中國煙草總公司海南省公司海口雪茄研究所按照《種質資源普查與收集行動》技術規(guī)范中的系統(tǒng)調(diào)查流程在海南省內(nèi)進行了多輪考察收集，共收集到23份煙草新種質，多為典型地方曬煙資源。種質資源的編號、來源及種質名稱見表1。

表1 供試的煙草種質資源

1.2 試驗方法

1.2.1 田間性狀調(diào)查 供試材料于2018—2019年連續(xù)2年種植在海南省儋州市試驗基地，田間管理按當?shù)亟y(tǒng)一模式進行，田間性狀記載按照《煙草種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[15]，每份材料選取5株進行性狀調(diào)查，其中數(shù)量性狀以2年的平均數(shù)作為最終結果。

1.2.2 基因組DNA的提取 將采集到的煙草幼嫩葉片用SLS法提取基因組DNA。將DNA濃度統(tǒng)一稀釋到50 ng/μL，在-20℃低溫下長期保存。

1.2.3 SSR引物與PCR擴增 PCR擴增總體10μL，其中包括2×Taq PCR Mastermix 5μL、模板DNA 1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、雙蒸水2μL。PCR反應程序為：94℃預變性5 min后，94℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃延伸8 min停止反應，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用Excel計算農(nóng)藝性狀的平均值、標準差及變異系數(shù)。采用張倩男等[16]的方法計算Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H')。聚類分析過程中將質量性狀按照《煙草種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[15]進行賦值，種質間遺傳距離為歐氏距離，聚類方法采用UPGMA。選擇帶型清晰的PCR擴增條帶進行人工讀帶，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，建立“0/1”矩陣，使用Data Formater軟件進行矩陣的轉換。用Popgene 32軟件計算觀察等位基因數(shù)Na(observed number of alleles)、有效等位基因Ne(effective number of alleles)、Nei’s基因多樣性指數(shù)H(Nei's gene diversity)、Shannon’s多態(tài)信息指數(shù)I(Shannon’s information index)以及品種間成對 Nei’s遺傳距離(Nei’s genetic distance)。使用統(tǒng)計軟件NTSYS-PCver 2.1分析23個供試煙草品種間遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA進行聚類分析，繪制聚類分析樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 種質資源形態(tài)特征

各種質資源株型有塔形和筒形2種；葉形有長卵圓、長橢圓、寬橢圓、橢圓、卵圓共5種；葉尖以漸尖為主；葉面形態(tài)特征以較平為主；葉緣以波浪和微波為主；葉耳有小、中、大和無葉耳4種；除HN7葉色為深綠外，其余葉色均為綠或黃綠色；葉片主脈除HN17為粗外，其余均為中或細；葉片厚度多為中等；花序密度多為密集，少數(shù)為松散；花序形狀多為菱形；花色以淡紅為主（表2）。遺傳多樣性分析結果表明，葉形的多樣性指數(shù)最高，為2.111；其次是葉耳和葉面，多樣性指數(shù)分別為1.914和1.721，花色的多樣性指數(shù)最低，僅為0.808。

表2 各煙草種質主要形態(tài)特性

續(xù)表2

2.2 農(nóng)藝性狀分析

在田間調(diào)查了株高、莖圍、節(jié)距、葉數(shù)和葉長寬等，并計算其變異系數(shù)（表3）。23份材料的平均株高為144.00 cm，最高的是HN22(231.00 cm)，HN5株高最矮(70.00 cm)；莖圍4.4～9.8 cm，平均莖圍6.8 cm；HN6和HN20節(jié)距最大，均大于10 cm；葉數(shù)大于25的有HN1、HN7和HN8；葉片最長的是HN2(69.40 cm)，葉寬最長的是HN7(32.60 cm)，HN3的葉片長和寬均最小，分別為27.00、15.60 cm；葉片主側脈夾角均為中度，莖葉角度大多為大度，少數(shù)為中度。所調(diào)查的農(nóng)藝性狀變異系數(shù)范圍為20.69%～29.41%，其中葉數(shù)的變異系數(shù)最大，莖圍的變異系數(shù)最小。

表3 主要農(nóng)藝性狀

2.3 基于田間表型性狀的聚類分析

使用SPSS 22.0軟件對新收集煙草種質資源的21個田間表型性狀進行聚類分析，以歐氏距離為遺傳距離，聚類方法采用類平均法(UPGMA)在，遺傳距離15處將這些種質分為3個類群（圖1）。

圖1 煙草種質基于田間表型性狀的聚類圖

第Ⅰ類群包括14份種質，株型以塔形為主，葉形豐富，葉面多為較平，葉緣微波和波浪為主，葉色為綠或黃綠，花序密度以松散為主；株高多在140.00 cm左右，平均葉數(shù)為16.67，葉片較大，大多無葉柄。第Ⅱ類群包括5份種質，株形以筒形為主，葉形以長卵圓為主，葉緣微波或皺折，葉片主脈粗細為中，花序密度以松散為主；株高較高，平均為186.24 cm，莖圍和節(jié)距均較大，葉數(shù)也最多，平均21.92片，葉片最大，平均葉長52.92 cm、葉寬26.08 cm。第Ⅲ類群包括3份種質，株型為筒形，葉形卵圓或寬橢圓，葉尖漸尖，葉緣較平，葉緣波浪，葉色綠，葉片主脈粗細為細，葉片厚薄中等，淡紅色花；株高矮小，平均73.66 cm，莖圍較小，節(jié)距較短，葉數(shù)較少，平均13.66片，葉片較小，平均葉長31.29 cm、葉寬17.13 cm。

2.4 SSR引物的篩選

利用6份煙草種質[‘Little Dutch’、‘H211’、‘Beinhart 1000-1’、‘Hicks’(Broad Leaf)、‘Havana 10’、‘H382’]篩選2000對Bindler公布的SSR標記，選取出多態(tài)性好、條帶穩(wěn)定清晰的12對引物，其序列見表4。

表4 SSR引物序列

續(xù)表4

2.5 SSR標記的遺傳多樣性分析

數(shù)據(jù)分析結果（表5）顯示，觀測等位基因數(shù)(Na)在2～7之間，平均值為3.8333，位點PT51398和PT53568等位基因數(shù)最多（7個）。有效等位基因數(shù)(Ne)1.1050～5.1882，平均值為2.3357，位點PT53568有效等位基因數(shù)最多，位點PT50668有效等位基因最少，有效等位基因所占比例為60.93%。觀測雜合度(Ho)變化范圍為0.1731～0.9026，平均值為 0.5301。期望雜合度(He)變化范圍為0.0974～0.8269，平均值為0.4700。平均Nei’s多樣性指數(shù)(H)為0.4593。Shannon信息指數(shù)(I)在0.1985～1.6164之間，平均值為0.8930。不同位點之間遺傳參數(shù)存在差別，He平均值小于0.5，說明供試材料遺傳多樣性不高。

表5 12對SSR標記在23份材料中的多態(tài)性信息

2.6 基于SSR標記遺傳多樣性的聚類分析

利用12對SSR引物對23個供試煙草資源擴增出46個等位基因，平均每對引物擴增出3.83個。對擴增結果進行統(tǒng)計分析，繪制0/1二維矩陣，使用NTSYS計算23個供試曬煙資源之間的遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離指數(shù)。結果表明，各曬煙資源間的遺傳相似性系數(shù)為0.143～1.000。在相似性系數(shù)0.206處可將供試曬煙資源分為2個類群（圖2）。其中HN2（海南島-2）和HN8（海南6）單獨聚為一類，與其他供試材料遺傳距離最遠，且均來自于海南省陵水縣。HN1和HN21，HN3和HN4，HN5、HN12和HN15遺傳距離最近。從聚類圖中還發(fā)現(xiàn)，聚類結果與資源的地理來源沒有明顯的相關性。

圖2 基于23份煙草種質資源12對SSR標記的聚類圖

2.7 23份煙草種質資源指紋圖譜的構建

根據(jù)12對SSR引物的擴增結果（以引物PT50599為例，圖3），結合參照分子量標記，構建23個供試煙草資源的指紋圖譜（圖4）。在后期進行資源鑒定和品種審定時，可利用這12對SSR標記的擴增結果獲得其指紋圖譜，與已有的指紋圖譜進行比對，即可完成鑒定。

圖3 引物PT50599對23份煙草種質資源PCR擴增結果

圖4 23份煙草種質資源的指紋圖譜

3 結論與討論

本研究采用21個田間表型性狀對煙草種質資源進行聚類分析，結果表明，23份煙草資源遺傳多樣性總體較高，農(nóng)藝性狀變異系數(shù)范圍為20.69%～29.41%，質量性狀的遺傳多樣性指數(shù)范圍為0.808～2.111。利用表型性狀可將這23份資源進行分類，其中第Ⅱ類群的植株較高、葉片較大、葉數(shù)較多，可作為高產(chǎn)種質加以利用。通過表型聚類可有效地對煙草資源進行鑒定評價。SSR標記遺傳多樣性分析結果顯示，期望雜合度(He)變化范圍為0.0974～0.8269，平均值為0.4700，He平均值小于0.5，說明供試材料遺傳多樣性較低，這可能與海南省相對隔絕的地理位置有關；各品種間的遺傳相似性系數(shù)在0.143～1.000之間，聚類分析結果表明，供試種質的親緣關系與地理來源相關性不大，這與前人多數(shù)研究結果一致[3,13-14]。通過12對SSR標記構建的指紋圖譜，為曬煙資源鑒定及新品種審定提供新思路。本研究通過表型性狀和分子標記2種方法對海南煙草資源進行了遺傳多樣性分析，得到的結果并不完全一致，這種情況在辣椒[17]、紅三葉[18]、梅花[19]等植物中也報道過。原因可能有以下2點：（1）形態(tài)學性狀易受外界環(huán)境條件影響導致鑒定結果出現(xiàn)一定的偏差；（2）所選的SSR位點可能與所調(diào)查的表型性狀不存在關聯(lián)，因而造成2種聚類結果的差異。

近年來，國內(nèi)高度重視“中式雪茄”的發(fā)展，雪茄煙已成為中國煙草行業(yè)新的增長點。然而，國內(nèi)優(yōu)質的雪茄煙原料絕大部分依賴于進口，主要原因是品種匱乏和生態(tài)環(huán)境不適宜[20-21]。國內(nèi)的雪茄煙種質資源僅占煙草種質資源的3%，主要來源于地方優(yōu)質晾曬煙品種篩選和國外優(yōu)良品種引進。然而，篩選出的地方優(yōu)質晾曬煙品種經(jīng)過多年種植種性退化較為嚴重，逐漸失去雪茄煙葉的應有特征，國內(nèi)自然環(huán)境與原產(chǎn)地之間的差異也導致引進的雪茄煙資源表現(xiàn)不出自身的特征特性[22-23]。因此，從地方優(yōu)質晾曬煙種質資源中發(fā)掘具有雪茄煙特性的種質是解決品種單一問題的有效方法。氣象、土壤等生態(tài)因子是決定雪茄煙葉風格特色的重要因素，適宜的自然環(huán)境是生產(chǎn)優(yōu)質雪茄煙葉的基礎[24-25]。全球優(yōu)質的雪茄煙葉生產(chǎn)基地均分布在南北回歸線之間，特別是23°N附近。海南省位于23°N以南地區(qū)，同古巴優(yōu)質雪茄煙種植區(qū)VueltaAbajo地區(qū)和印度尼西亞東爪哇省Jember雪茄煙葉生產(chǎn)基地緯度相近，氣候相同，土壤富含有機質和礦物質，理化特性類型也極為相近，被公認為是國內(nèi)發(fā)展“中式雪茄”最具潛在優(yōu)勢的地區(qū)之一[20-21,26]。本研究對海南省收集到的23份煙草種質資源的遺傳多樣性進行了綜合分析，探索了種質間的親緣關系，為基因挖掘及地方品種鑒定奠定了良好理論基礎，后期應對其化學成分和感官評吸質量等方面做進一步研究，以期為“中式雪茄”研究提供優(yōu)質育種材料。