張峰，趙玉泉，李習(xí)瑩（開(kāi)封市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 開(kāi)封 475000）

小兒瀉痢片是由葛根、黃芩、白芍、甘草等十味中藥材經(jīng)提取濃縮等工藝制成的片劑，其主要用于治療小兒濕熱下注所致的痢疾、泄瀉[1]。小兒瀉痢片的功效是多種活性成分共同作用的結(jié)果，其中有效成分葛根素能改善心肌代謝及血管微循環(huán)、擴(kuò)張冠狀血管[2]；黃芩苷可以抑菌、利尿、抗炎、抗變態(tài)及解痙作用；厚樸酚與和厚樸酚具有抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、抗血小板聚集等作用[3]；鹽酸小檗堿對(duì)痢疾桿菌、大腸埃希菌所引發(fā)的腸道感染具有抗感染作用；芍藥苷具有平抑肝陽(yáng)、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、抗菌之功效[4]；甘草酸有抗炎、增強(qiáng)免疫力、抗冠狀病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和人巨細(xì)胞病毒等呼吸道病毒的功能[5]。因此，對(duì)小兒瀉痢片主要活性成分進(jìn)行多組分同時(shí)檢測(cè)，可以全面反映其質(zhì)量。

現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)黃芩苷進(jìn)行質(zhì)量控制，無(wú)法全面反映小兒瀉痢片復(fù)方制劑的特點(diǎn)，也無(wú)法實(shí)現(xiàn)有效全面的質(zhì)量控制。目前關(guān)于小兒瀉痢片質(zhì)量控制的研究較多[6]，但大多采用液相色譜法結(jié)合紫外檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定，且檢測(cè)的活性成分僅為一個(gè)或幾個(gè)，方法分離效果不佳、運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)、專(zhuān)屬性差。近幾年發(fā)現(xiàn)偽品刺果甘草與甘草混合售賣(mài)，原標(biāo)準(zhǔn)[1]尚未收載對(duì)甘草的鑒別試驗(yàn)，且尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)小兒瀉痢片中甘草的含量進(jìn)行質(zhì)量控制。因?yàn)楦什菟岬臐舛群艿?，無(wú)法采用HPLC 法進(jìn)行定量分析。因中藥制劑成分復(fù)雜，使用HPLC 法測(cè)定時(shí)待測(cè)組分很難有效分離，且分析時(shí)間較長(zhǎng)致使峰寬過(guò)寬難以得到較好的峰形。因此，選擇更高效靈敏的儀器來(lái)建立快速、準(zhǔn)確、選擇性好的檢測(cè)方法十分必要。

UPLC-MS/MS 法有著專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，它能通過(guò)不同化合物的特征母離子和子離子的相對(duì)應(yīng)使之抗干擾能力強(qiáng)[7]，同時(shí)實(shí)現(xiàn)分離和鑒定的作用，更好地解決復(fù)雜樣品準(zhǔn)確定性、定量的問(wèn)題，故本文采用UPLC-MS/MS 法同時(shí)測(cè)定小兒瀉痢片中葛根素、黃芩苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、厚樸酚、和厚樸酚與甘草酸7 種活性成分的含量，為小兒瀉痢片的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與試藥

美國(guó)Waters 三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀（ACQUITY UPLC H-Class Plus Xevo TQ-S Micro，離子源為ESI 源）；New Classic 電子天平（德國(guó)Mettler Toledo，十萬(wàn)分之一），KQ-300 GDV 超聲儀（昆山超聲儀器有限公司），優(yōu)普ULUP 超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。甲酸、乙腈均為質(zhì)譜純（Fisher 公司），甲醇為色譜純（默克公司），對(duì)照品芍藥苷（批號(hào)：110736-201035，純度：96.5%）、厚樸酚（批號(hào)：110729-201310，純度：100.0%）、和厚樸酚（批號(hào)：110730-201614，純度：99.3%）、甘草酸銨（批號(hào)：110731-202021，純度：96.2%）、黃芩苷（批號(hào)：110715-201016，純度：93.3%）、鹽酸小檗堿（批號(hào)：110713-201613，純度：86.8%）、葛根素（批號(hào)：110752-201615，純度：95.4%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院），小兒瀉痢片（糖衣片，片芯重0.17 g，批號(hào)：1911032、1912121、2001221，桂林三金藥業(yè)股份有限公司）；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件

色譜柱為phenomenex kinetex C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，2.6 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），流速為0.4 mL·min－1，梯度洗脫（0～0.5 min，10%B；0.5～2 min，70%～30%%B；2～7.5 min，20%～80%B；7.5～7.6 min，10%B；7.6～15 min，10%B），柱溫為35℃，進(jìn)樣量為2 μL。

離子源：ESI 源，正負(fù)離子切換掃描，MRM模式；毛細(xì)管電壓：3.2 kV，錐孔電壓：50 V；離子源溫度：150 ℃；干燥氣溫度：400 ℃，氣體流量800 L·h－1；霧化器壓力240 kPa；霧化氣、干燥氣均為N2，Ar 為碰撞氣，質(zhì)譜其余分析參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 7 種成分的質(zhì)譜參數(shù)Tab 1 MS parameters of 7 components

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)取葛根素、芍藥苷、鹽酸小檗堿、厚樸酚、和厚樸酚與甘草酸對(duì)照品各約10 mg，分別置于10 mL 量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度均約為1 g·L－1；精密稱(chēng)取黃芩苷約10 mg，置20 mL 量瓶中，分別吸取上述6 種對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置該量瓶中，用40%乙腈溶液稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品溶液①，其中葛根素、黃芩苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、厚樸酚、和厚樸酚與甘草酸的質(zhì)量濃度分別為0.1010、0.5010、0.1024、0.2008、0.1022、0.0505 與0.0303 g·L－1。精密量取混合對(duì)照品溶液①2 mL，置100 mL 量瓶中，用40%乙腈溶液稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品溶液②，精密量取混合對(duì)照品溶液②1、2、3、5、10、15 mL 分別置于50 mL 量瓶中，用40%乙腈溶液稀釋至刻度，制成系列濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 取本品20 片，除去包衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，精密稱(chēng)取約0.2 g，置100 mL 錐形瓶中，加入50 mL 70%乙醇溶液，浸漬12 h 后，超聲（500 W，40 kHz）提取30 min，上清液轉(zhuǎn)移至200 mL 量瓶中，殘?jiān)尤?0%乙醇溶液約50 mL，超聲提取30 min，過(guò)濾，合并濾液，殘?jiān)?0 mL 30%乙醇溶液分次洗滌，最后用30%乙醇溶液稀釋到刻度，精密量取續(xù)濾液5 mL，置50 mL 量瓶中，用40%乙腈溶液稀釋至刻度，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)

2.3.1 方法專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下中間濃度的混合對(duì)照品溶液和“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果各組分峰形良好，無(wú)干擾成分。各待測(cè)組分的MRM 圖譜見(jiàn)圖1，二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 對(duì)照品（a）和供試品（b）的MRM 色譜圖Fig 1 Multiple reaction monitoring（MRM）chromatogram of the seven standards（a）and sample（b）

圖2 小兒瀉痢片中各組分的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig 2 Secondary mass spectrogram of 7 components in Xiaoer Xieli tablets

2.3.2 線(xiàn)性關(guān)系的考察 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算，以7 個(gè)待測(cè)組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)的色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 小兒瀉痢片中7 種成分的線(xiàn)性關(guān)系Tab 2 Linear correlation of 7 components in Xiaoer Xieli tablets

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為1911032 的供試品6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，7 個(gè)待測(cè)組分測(cè)得含量的均值分別為葛根素0.4588 mg/片、黃芩苷2.671 mg/片、芍藥苷0.4775 mg/片、鹽酸小檗堿0.9765 mg/片、厚樸酚0.4669 mg/片、和厚樸酚0.2340 mg/片與甘草酸0.1367 mg/片，RSD值分別為葛根素1.5%、黃芩苷1.8%、芍藥苷3.2%、鹽酸小檗堿1.0%、厚樸酚1.7%、和厚樸酚2.3%與甘草酸1.6%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性符合要求。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件在0、2、5、10、15、20、24 h 分別進(jìn)樣，記錄峰面積，7 個(gè)待測(cè)組分峰葛根素、黃芩苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、厚樸酚、和厚樸酚與甘草酸，峰面積的RSD值分別為1.7%、1.9%、3.9%、1.3%、2.0%、2.5%和1.9%，結(jié)果表明各組分在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下中間濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣7 次，記錄峰面積，結(jié)果葛根素、黃芩苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、厚樸酚、和厚樸酚與甘草酸峰面積的RSD值分別為2.3%、1.7%、3.7%、1.6%、2.1%、1.9%和1.7%，表明該儀器精密度滿(mǎn)足試驗(yàn)要求。

2.3.6 回收試驗(yàn) 分別取已知含量的批號(hào)為1911032 的供試品6 份，每份約0.11 g，精密稱(chēng)定，分別置200 mL 量瓶中，精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液①1、2 和3 mL，平行2 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定回收率。結(jié)果7 個(gè)待測(cè)組分的平均加樣回收率分別為葛根素101.8%（RSD為1.2%）、黃芩苷99.8%（RSD為3.9%）、芍藥苷95.5%（RSD為2.8%）、鹽酸小檗堿106.9%（RSD為2.5%）、厚樸酚97.2%（RSD為3.8%）、和厚樸酚95.5%（RSD為3.4%）與甘草酸104.3%（RSD為3.6%）。

2.3.7 樣品含量測(cè)定 取3 個(gè)批號(hào)的供試品各2 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 含量測(cè)定結(jié)果(mg/片)Tab 3 Content determination (mg/片)

3 討論

參考文獻(xiàn)[8-10]中葛根素、黃芩苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、厚樸酚、和厚樸酚與甘草酸的提取方法有超聲波提取法、浸漬法、回流提取法，提取溶劑也不盡相同。本文分別用30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇及30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇結(jié)合超聲提取法提取樣品，發(fā)現(xiàn)采用同樣含水量的甲醇和乙醇提取效率相當(dāng)，但不同含水量的溶劑提取出來(lái)的待測(cè)組分差別較大。因乙醇無(wú)毒便宜，故本文采用乙醇作為溶劑，且考慮到苷類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物有較高的水溶性，而其他組分使用70%乙醇溶液提取率最高，故綜合考慮采用70%乙醇溶液和30%乙醇溶液分次提取。通過(guò)對(duì)比70%乙醇溶液浸漬12 h 后分次超聲提取和回流提取，發(fā)現(xiàn)待測(cè)物含量無(wú)明顯變化，故采用較為簡(jiǎn)便的浸漬12 h 后分次超聲提取法。分別使用超聲提取20 min、30 min、60 min，發(fā)現(xiàn)待測(cè)物超聲提取30 min 時(shí)的含量與60 min 時(shí)的相當(dāng)。綜合考慮提取方法如下，樣品用70%乙醇溶液浸漬12 h 后超聲提取30 min，濾過(guò)，濾渣再用30%乙醇溶液超聲提取30 min。

參考文獻(xiàn)[11-15]采用甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-10 mmol·L－1甲酸銨溶液進(jìn)行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)各物質(zhì)在乙腈-0.1%甲酸溶液中響應(yīng)良好且有較好的峰形。由于在使用40%乙腈溶液稀釋時(shí)溶劑效應(yīng)最小，故選用40%乙腈溶液稀釋樣品。為保證本法具有合適的定量限，使用含量最低的甘草酸的質(zhì)譜條件作為最優(yōu)化條件，且根據(jù)響應(yīng)值的高低采用了正負(fù)離子切換掃描的方式，采集模式選擇MRM 對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行掃描，將豐度最大的子離子作為定量離子，保證了方法的專(zhuān)屬性和準(zhǔn)確性。

通過(guò)測(cè)定3 批樣品的含量，發(fā)現(xiàn)每批待測(cè)組分的含量比值差別較大，藥品的均一性和一致性難以保證，本文為標(biāo)準(zhǔn)提高提供了數(shù)據(jù)支撐。

本試驗(yàn)首次建立了UPLC-MS/MS 法同時(shí)測(cè)定小兒瀉痢片中7 種有效成分的含量，本法節(jié)省溶劑、快速準(zhǔn)確、靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)，為該藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考。