劉忠誠(chéng) 杜美利 韓 翔 薛文海 王瀚姣

(西安科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，西安 710054)

前言

硫化氫(H2S)是人們發(fā)現(xiàn)的第三類(lèi)生物內(nèi)源性“氣體信使分子”(其他兩種分別為CO和NO)。內(nèi)源性H2S主要是通過(guò)非酶催化和酶催化兩種途徑產(chǎn)生：非酶催化途徑包括多硫化合物的代謝及存儲(chǔ)硫的釋放[1]；酶催化途徑則是在胱硫醚-β-合成酶(CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(CES)等吡哆醛-5-磷酸鹽(PLP)類(lèi)酶、3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(MST)和半胱氨酸轉(zhuǎn)氨酶(CAT)等多種酶的參與作用下，通過(guò)酶解L-半胱氨酸產(chǎn)生[2]。H2S對(duì)于呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有著非常重要的意義，參與一系列生理調(diào)控活動(dòng)，如調(diào)節(jié)血管舒張、炎癥及胰島素分泌等[3]。但是，細(xì)胞內(nèi)H2S濃度平衡(生理濃度1～10 mmol)一旦破壞可能會(huì)導(dǎo)致亨廷頓式舞蹈癥[4]、糖尿病[5]、阿爾茲海默癥[6]、21-三體綜合癥[7]及帕金森癥[8]等疾病的產(chǎn)生。因此，對(duì)H2S的檢測(cè)尤其是對(duì)生物內(nèi)源性H2S的定量檢測(cè)有著重要意義，這也使得近年來(lái)對(duì)內(nèi)源性H2S的檢測(cè)與研究成為熱點(diǎn)。

目前，常見(jiàn)的H2S檢測(cè)方法有：分光光度法[9]、電化學(xué)法[10]、氣相色譜法[11]以及極譜法[12]。這些方法操作簡(jiǎn)單，但是通常需要破壞樣品，局限于細(xì)胞外H2S檢測(cè)。近年來(lái)發(fā)展的有機(jī)小分子熒光探針由于其優(yōu)良的細(xì)胞滲透性、高靈敏度以及原位檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，為H2S和其他生物活性分子內(nèi)源性檢測(cè)提供了有效的方法，且涌現(xiàn)出一系列豐碩的成果[13-17]。其中以香豆素為母體的H2S熒光探針，因其具有熒光強(qiáng)度高、溶解性與細(xì)胞滲透性好、易于合成與修飾、以及優(yōu)越的熒光量子產(chǎn)率和光穩(wěn)定性等優(yōu)勢(shì)，備受研究者的青睞。

目前文獻(xiàn)中報(bào)道的H2S熒光探針的識(shí)別機(jī)理主要基于三種設(shè)計(jì)策略：1)疊氮基(—N3)、硝基(—NO2)、羥胺(—NH2OH)的還原反應(yīng)；2)親核反應(yīng)；3)H2S與某些金屬結(jié)合能力強(qiáng)，如硫化銅沉淀。本文以不同的識(shí)別機(jī)理綜述近三年以香豆素為母體設(shè)計(jì)的熒光探針對(duì)H2S的檢測(cè)研究。

1 熒光探針?lè)z測(cè)H2S

1.1 基于H2S還原性的熒光探針

H2S能夠?qū)ⅰ狽3、—NO2、—NH2OH等基團(tuán)快速還原為—NH2，其還原速度遠(yuǎn)高于其他硫醇，從而成為一種有效的H2S識(shí)別機(jī)制。其中，—N3、—NO2、—NH2OH 等吸電子基團(tuán)不僅可以作為H2S的識(shí)別位點(diǎn)還可以使熒光團(tuán)的熒光發(fā)生淬滅。當(dāng)被H2S還原之后，熒光團(tuán)前后“推-拉”電子能力的變化會(huì)引起熒光的恢復(fù)(探針和客體分子發(fā)生光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移過(guò)程)?；谏鲜鰴C(jī)理，科研工作者充分利用不同取代基的供電子能力，制備出各種各樣的用于檢測(cè)H2S的香豆素類(lèi)熒光探針。

2020年，Selvaraj Muthusamy等人設(shè)計(jì)了一種含—N3的香豆素(圖1)熒光探針，通過(guò)酰胺骨架熒光團(tuán)與8-氨基喹啉連接，引入雜原子增強(qiáng)了電子離域，從而產(chǎn)生快速的熒光響應(yīng)和高量子產(chǎn)率。通過(guò)波譜和LC-MS分析表明，酰胺骨架-8氨基喹啉(ACAQ)的響應(yīng)時(shí)間為6 min，檢測(cè)限(LOD)為14.6 nmol/L，對(duì)其他可能的干擾物具有很高的抗干擾性。此外，可視化測(cè)量結(jié)果表明，探針ACAQ能夠用于現(xiàn)場(chǎng)樣品中H2S的檢測(cè)[18]。

圖1 含—N3的香豆素探針的識(shí)別位點(diǎn)Figure 1 Recognition sites of coumarin fluorescent probe containing —N3.

2018年，ZHAO等人在7-氨基-4-甲基香豆素和熒光素FRET體系的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一種新型H2S熒光探針Flu-N3(圖2)，該探針對(duì)H2S的檢測(cè)限為3.1 nmol/L。此外，HepG-2細(xì)胞成像和小鼠活體成像實(shí)驗(yàn)都表明，探針能夠應(yīng)用于檢測(cè)生物系統(tǒng)中的H2S[19]。

2019年，解暢等人合成了一種響應(yīng)速率相當(dāng)?shù)臒晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移—分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(FRET-ICT)雙反應(yīng)H2S熒光探針(圖3)。該探針是根據(jù)雙淬滅效應(yīng)(7-硝基-1，2，3-苯并二唑(NBD)-哌嗪參與的FRET淬滅和—N3參與的ICT淬滅，增加熒光淬滅程度。當(dāng)探針和H2S反應(yīng)后，雙淬滅效應(yīng)同時(shí)消失，熒光增強(qiáng)明顯，有效提高探針的靈敏性。探針可以與H2S發(fā)生還原和親核取代反應(yīng)(H2S將—N3還原為—NH2，氫離子取代NBD)；并且探針中兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的反應(yīng)速率相當(dāng)，探針對(duì)H2S的檢測(cè)限為40 nmol/L。此外，探針能夠用于真核細(xì)胞內(nèi)CBS(胱硫醚β-合酶)活性檢測(cè)和抑制劑篩選，并且可以檢測(cè)活細(xì)胞中的H2S[20]。

圖2 探針 Flu-N3的識(shí)別位點(diǎn)Figure 2 Recognition sites of Flu-N3 probe.

圖3 探針的反應(yīng)位點(diǎn)Figure 3 Reaction site of probe.

2018年，Ewelina Zaorska等人合成了兩種用于生物液中H2S檢測(cè)的自釋放熒光探針(圖4)。自釋放為探針通過(guò)H2S介導(dǎo)的疊氮基團(tuán)還原，生成伯胺，伯胺隨后自發(fā)發(fā)生分子內(nèi)內(nèi)酰胺化，釋放7-羥基-4-甲基-香豆素和哌啶-2-酮。在相同的反應(yīng)條件下，化合物2的熒光響應(yīng)要低得多，這是由于化合物2的逐漸自水解所致?；衔?可用于在生物系統(tǒng)和人體體液，以及在生理pH值和快速響應(yīng)時(shí)間的水介質(zhì)中估測(cè)H2S濃度。最后測(cè)量了健康的18～40歲志愿者唾液中的H2S，在獲取樣本后立即進(jìn)行濃度測(cè)定。健康人的唾液H2S濃度范圍為1.641～7.124 mol/L[21]。

圖4 熒光探針的結(jié)構(gòu)Figure 4 Structure of fluorescent probe.

2020年，ZHANG等人通過(guò)將硝基苯并-2-氧雜-1，3二唑(NBD)的一部分和—N3整合到香豆素平臺(tái)上設(shè)計(jì)了一種新型熒光探針(圖5)，用于生物系統(tǒng)中選擇性檢測(cè)半胱氨酸/高半胱氨酸(Cys/Hcy)和H2S。該探針具有較低的細(xì)胞毒性，能夠選擇性地檢測(cè)Cys/Hcy和從藍(lán)色和綠色通道得到海拉細(xì)胞(HeLa)中的H2S[22]。

1.2 基于H2S親核性的熒光探針

在生理pH值下，H2S主要以HS的形式存在，與其他硫醇相比，H2S在細(xì)胞中具有更高的親核性，可以更好地參與親核反應(yīng)?；诖藱C(jī)制，提出了兩種策略，一種是芳香硝基化合物的硫解，另一種是共軛體系的破壞。而采用這兩種策略對(duì) H2S 進(jìn)行檢測(cè)所遇到的最大困難就是如何使探針?lè)肿犹禺愋耘c H2S反應(yīng)。但H2S擁有雙親核性使得這個(gè)問(wèn)題得以解決，研究者們將熒光探針?lè)肿佑脙蓚€(gè)親電中心進(jìn)行修飾，以達(dá)到能夠使得H2S與探針發(fā)生雙硫醇交換機(jī)制或者串聯(lián)邁克爾加成反應(yīng)機(jī)制的目的。利用該機(jī)理，科研工作者也設(shè)計(jì)合成了多種用于檢測(cè)H2S的熒光探針。

2020年，韓志湘等人用花色素和4-(二乙氨基)水楊醛合成了一種近紅外比率熒光探針?lè)肿?(圖6。結(jié)果表明：探針?lè)肿?溶液中加入H2S時(shí)，因H2S與探針?lè)肿?中苯并吡喃部分發(fā)生親核加成反應(yīng)，破壞了其共軛體系，導(dǎo)致720 nm處的近紅外(NIR)發(fā)射熒光強(qiáng)度降低；同時(shí)，其加成產(chǎn)物含有完整的半剛性香豆素?zé)晒鈭F(tuán)，在503 nm處的綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。由于探針1的發(fā)射波長(zhǎng)與半剛性香豆素的發(fā)射波長(zhǎng)不同，因此在加入H2S前后有兩個(gè)完全分離的發(fā)射峰，實(shí)現(xiàn)了對(duì)H2S的有效比率檢測(cè)。當(dāng)加入4.0 μmol/L硫化鈉時(shí)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了19.2倍。探針?lè)肿?對(duì)水溶液中的H2S的線性響應(yīng)范圍是0.1～4 mol/L(R2=0.993 9)，檢測(cè)限為57.8 nmol/L。探針?lè)肿?對(duì)H2S響應(yīng)時(shí)間為110 s，且有較好的選擇性。此外，探針?lè)肿?還被成功應(yīng)用于活細(xì)胞中內(nèi)源性和外源性H2S的熒光成像[23]。

圖5 探針的識(shí)別位點(diǎn)Figure 5 Recognition sites of probe.

圖6 探針的合成Figure 6 Synthesis of probe.

2021年，TANG等人基于羅丹明和香豆素?zé)晒饣鶊F(tuán)，設(shè)計(jì)了一種新的雙識(shí)別位點(diǎn)探針SZ(圖7)。其中，苯肼和2，4-二硝基苯磺酰分別作為ONOO-和H2S的反應(yīng)位點(diǎn)。SZ探針對(duì)ONOO-和H2S具有良好的選擇性和較低的檢測(cè)限；更重要的是，SZ通過(guò)監(jiān)測(cè)ONOO-的波動(dòng)來(lái)評(píng)價(jià)內(nèi)源性H2S對(duì)羰基脅迫的影響。因此，這種新型的羰基應(yīng)激標(biāo)記熒光探針將有助于理解羰基應(yīng)激的發(fā)病機(jī)制和解毒藥物的開(kāi)發(fā)[24]。

2018年，YANG等人以香豆素為熒光團(tuán)和二硝基苯基作為高效的熒光猝滅劑設(shè)計(jì)了一種探針(Cda-DNP) 香豆素-二硝基苯(圖8)。該探針結(jié)合了高效的開(kāi)關(guān)效率和顯著的膜穿越能力，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)自發(fā)產(chǎn)生的H2S檢測(cè)和動(dòng)態(tài)繪圖。H2S在生物體內(nèi)的檢測(cè)具有以下前所未有的優(yōu)點(diǎn)：H2S容易進(jìn)入幾乎所有的細(xì)胞，整個(gè)細(xì)胞空間映射H2S；單細(xì)胞中自發(fā)H2S的動(dòng)態(tài)定位；動(dòng)物器官中自發(fā)H2S的體內(nèi)成像。該探針對(duì)H2S的檢測(cè)限為0.18 μmol/L，特別是，探針穿越血液/組織/細(xì)胞屏障，實(shí)現(xiàn)對(duì)活斑馬魚(yú)代謝器官內(nèi)源性H2S的定位。本研究的結(jié)果將為研究H2S生理和H2S相關(guān)疾病提供令人興奮的機(jī)會(huì)[25]。

圖7 探針的識(shí)別位點(diǎn)Figure 7 Recognition sites of probe.

圖8 探針的識(shí)別機(jī)理Figure 8 Recognition mechanism of probe.

2020年，ZHANG等人合成了兩種比率型H2S熒光探針(圖9)，該探針選擇香豆素衍生的花青素?zé)晒鈭F(tuán)作為受體，引入兩個(gè)綠色熒光團(tuán)作為供體。該探針在665 nm處表現(xiàn)出強(qiáng)大的近紅外發(fā)射。HS-與亞胺碳的親核加成反應(yīng)破壞了花青素的大共軛體系，導(dǎo)致其吸收能力下降，從而阻斷了FRET過(guò)程，增加了綠色熒光發(fā)射。探針NBD-CMC和Nap-CMC在水溶液中均表現(xiàn)出特定比例的H2S檢測(cè)能力。對(duì)H2S的響應(yīng)時(shí)間分別為60和90 s。此外，探針NBD-CMC還成功地應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)外源性和內(nèi)源性H2S的檢測(cè)，為H2S比值熒光成像探針的研制提供了有力的設(shè)計(jì)思路，為H2S各種生理和病理功能的研究奠定了基礎(chǔ)[26]。

2021年，F(xiàn)ENG等人首次設(shè)計(jì)了一種雙功能三位點(diǎn)熒光探針GH(圖10)，不僅可以將紙條與顏色識(shí)別器耦合，對(duì)廢水中的H2S進(jìn)行可視化定量分析，還可以對(duì)活細(xì)胞中的GSH進(jìn)行靈敏監(jiān)測(cè)，這取決于不同的發(fā)射通道和溶液的pH值。通過(guò)熒光、紫外-可見(jiàn)光譜、核磁共振氫譜和密度泛函(DFT)計(jì)算，證明了GH對(duì)H2S/GSH的識(shí)別性能。更重要的是，熒光試紙與帶有顏色識(shí)別器應(yīng)用程序的便攜式智能手機(jī)傳感平臺(tái)可以實(shí)現(xiàn)低成本、快速的比色水質(zhì)檢測(cè)，在環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用潛力[27]。

圖9 探針的識(shí)別位點(diǎn)Figure 9 Recognition sites of probe.

圖10 探針的識(shí)別位點(diǎn)Figure 10 Recognition sites of probe.

2019年，LEI等人設(shè)計(jì)了一種基于香豆素的熒光探針I(yè)AC(圖11)，該探針在580 nm具有較強(qiáng)的紅色熒光，通過(guò)DFT和ESI-MS研究了感應(yīng)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)親核反應(yīng)有助于IAC與H2S之間的紅色熒光增強(qiáng)。IAC能快速、選擇性地檢測(cè)H2S，檢測(cè)限為3.3×10-8mol/L。細(xì)胞毒性(MTT)檢測(cè)和細(xì)胞成像結(jié)果表明，IAC具有良好的膜通透性和低毒性，這使得IAC可以應(yīng)用于活細(xì)胞和動(dòng)物檢測(cè)[28]。

圖11 探針的識(shí)別位點(diǎn)Figure 11 Recognition sites of probe.

2019年，YANG等人基于α，β-不飽和乙醇香豆素?zé)晒鈭F(tuán)，設(shè)計(jì)了用于檢測(cè)H2S的探針(圖12)。乙醇/水緩沖液中DHC的紫外-可見(jiàn)光譜在470 nm處有明顯的吸收。加入H2S后，吸收強(qiáng)度降低，從470 nm轉(zhuǎn)移到482 nm，而其他分析物則不能引起上述現(xiàn)象。該探針對(duì)H2S的檢測(cè)限低至5×10-8mol/L，響應(yīng)時(shí)間小于60 s。此外，4～11的寬pH值范圍使其能夠在生物系統(tǒng)中應(yīng)用。最重要的是，MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)表明探針具有低毒和膜透性突出的特點(diǎn)，使探針能夠成功成像于H2S小倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞[29]。

圖12 探針對(duì)H2S的反應(yīng)機(jī)理Figure 12 Reaction mechanism of probe to H2S.

2020年，ZHAO等人合成了首個(gè)線粒體靶向雙檢測(cè)單熒光探針Mit-CM(圖13)，該探針以花青素-香豆素作為熒光團(tuán)(花青素的染料不僅可以作為能量受體，而且也可以作為4-氨基苯乙烯基4位ICT的能量供體。香豆素基染料的丙烯酸酯能有效淬滅Cys的熒光，并提供特定的識(shí)別位點(diǎn)。具有供電子基團(tuán)的4-氨基苯乙烯基到吲哚的ICT和香豆素到花青素的FRET可以同時(shí)發(fā)生)。該探針可分別單獨(dú)和連續(xù)顯示H2S、Cys和H2S/Cys的多響應(yīng)信號(hào)。此外，Mit-CM對(duì)H2S檢測(cè)限低至42 nmol/L。因此，我們期望Mit-CM能成為研究復(fù)雜多樣內(nèi)部環(huán)境中相關(guān)生物分子間相互關(guān)系的有力分子工具。此外，在特定的細(xì)胞器中，合理的設(shè)計(jì)策略應(yīng)被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建具有多種功能的單一熒光探針來(lái)追蹤生物活性物質(zhì)[30]。

2020年，LI等人研制了一種雙通道香豆素?zé)晒馓结?圖14)。該探針α，β不飽和酮與苯甲醛相鄰，建立了空間阻性反應(yīng)模型。長(zhǎng)鏈GSH既能與探針的α、β不飽和酮反應(yīng)，又能與醛基反應(yīng)，從而產(chǎn)生綠色熒光。結(jié)構(gòu)緊湊的H2S首先與α、β-不飽和酮反應(yīng)，然后巰基與醛發(fā)生二次親核環(huán)化反應(yīng)，形成一個(gè)五元環(huán)將整個(gè)分子接合，使體系發(fā)出黃色熒光。實(shí)現(xiàn)了兩種發(fā)射通道對(duì)GSH和H2S的高選擇性識(shí)別檢測(cè)。該探針對(duì)GSH和H2S的檢測(cè)限分別為7.55和28.55 μmol/L。同時(shí)，該探針在選擇性、毒性、穩(wěn)定性等方面表現(xiàn)出良好的性能。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證明該探針能同時(shí)檢測(cè)內(nèi)源性和外源性GSH和H2S[31]。

圖13 探針的識(shí)別位點(diǎn)Figure 13 Recognition sites of probe.

圖14 探針的識(shí)別位點(diǎn)Figure 14 Recognition sites of probe.

2018年，侯鵬等人以 2，4-二硝基苯基為識(shí)別基團(tuán)，香豆素類(lèi)染料為信號(hào)表達(dá)基團(tuán)，合成了反應(yīng)型H2S熒光探針(圖15)。熒光團(tuán)與2，4-二硝基苯基之間的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)過(guò)程，導(dǎo)致探針的熒光淬滅，探針本身無(wú)熒光或發(fā)出很弱的熒光。當(dāng)加入H2S后，H2S具有較強(qiáng)的親核性，和探針發(fā)生親核取代反應(yīng)使識(shí)別基團(tuán)脫離，體系內(nèi)PET過(guò)程失效；生成具有強(qiáng)烈綠色熒光的香豆素類(lèi)染料。通過(guò)反應(yīng)前后熒光光譜的變化來(lái)檢測(cè)H2S。該探針對(duì)H2S具有良好的選擇性和靈敏度，可以在生理?xiàng)l件(pH=7.4)下檢測(cè)H2S。當(dāng)探針的濃度為10 μmol/L時(shí)，其對(duì)H2S的檢測(cè)限為3.0×10-8mol/L，在490 nm熒光強(qiáng)度最大增強(qiáng)75倍[32]。

2020年，JING等人設(shè)計(jì)了一種新的雙發(fā)射溶酶體靶向熒光探針CM-NBD(圖16)，該探針能有效區(qū)分Cys和H2S以及Hcy/GSH雙色模式。探針遇到生物硫醇時(shí)，醚鍵破裂，釋放出香豆素?zé)晒鈭F(tuán)，在465 nm處發(fā)出藍(lán)色熒光，NBD發(fā)色團(tuán)(NBD-cys)發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光，NBD-Hcy表現(xiàn)出非常模糊的綠色熒光，NBD-GSH/NBD-SH在565 nm處沒(méi)有綠色信號(hào)。遇到Cys時(shí)，CM-NBD在藍(lán)、綠通道出現(xiàn)明顯的熒光增強(qiáng)，而Hcy的加入在綠通道表現(xiàn)出有限的增強(qiáng)，GSH和H2S僅呈藍(lán)色熒光增強(qiáng)。探針CM-NBD對(duì)外源生物硫醇進(jìn)行了成像實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)HeLa細(xì)胞和斑馬魚(yú)中Cys、Hcy/GSH和H2S的鑒別。這項(xiàng)工作為Cys的特異性檢測(cè)以及溶酶體Cys在生物醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中的相關(guān)作用提供了一個(gè)潛在的工具[33]。

圖15 探針的合成Figure 15 Synthesis of probe.

圖16 探針的識(shí)別位點(diǎn)Figure 16 Recognition sites of probe.

2020年，Zhang等人設(shè)計(jì)了一種新型熒光探針FHC-O-NBD(圖17)，提出了一種實(shí)用的熒光鑒別Cys/Hcy和GSH/H2S的方法，特別是對(duì)H2S的比色檢測(cè)。FHC-O-NBD與Cys/Hcy反應(yīng)在486和550 nm處產(chǎn)生兩個(gè)熒光信號(hào)，而GSH/H2S在486 nm處只產(chǎn)生一個(gè)熒光信號(hào)。而且，只加入H2S，體系的顏色會(huì)從無(wú)色變?yōu)榉凵?。因此，它可以作為“肉眼”檢測(cè)H2S的比色探針。此外，F(xiàn)HC-O-NBD能選擇性地區(qū)分活細(xì)胞中的Cys/Hcy和GSH/H2S[34]。

2018年，ZHANG等人合成一種溶酶體靶向熒光探針Lyso-RC(圖18)，用于同時(shí)區(qū)分溶酶體中的Cys/Hcy、GSH和H2S。Lyso-RC對(duì)不同的生物硫醇反應(yīng)時(shí)，表現(xiàn)出不同的信號(hào)模式(分別為藍(lán)-紅、綠-紅、紅)，當(dāng)Lyso-RC與H2S作用時(shí)，相應(yīng)的醚鍵被切斷，釋放出游離的間苯二酚，產(chǎn)生非發(fā)射性的巰基香豆素(Lyso-C-SH)，從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的紅色熒光信號(hào)。當(dāng)用GSH處理Lyso-RC時(shí)，相應(yīng)的醚鍵也被切斷，釋放出紅色的間苯二酚和綠色的硫代香豆素(Lyso-C-S-GSH)。我們希望這一獨(dú)特的探針能夠成為解開(kāi)溶酶體中生物硫醇的復(fù)雜相互作用網(wǎng)絡(luò)的強(qiáng)大分子工具[35]。

圖17 探針的比色檢測(cè)Figure 17 Colorimetric detection of probe.

圖18 探針的識(shí)別位點(diǎn)Figure 18 Recognition sites of probe.

2019年，ZHANG等人受多信號(hào)組合策略的啟發(fā)，首次通過(guò)醚鍵將7-二乙基香豆素和間苯二酚結(jié)合成功，用于生物硫醇檢測(cè)和鑒別的單分子熒光探針RC (圖19)。同時(shí)檢測(cè)Cys、Hcy、GSH和H2S。令人滿意的是，RC在溶液和活細(xì)胞中對(duì)各自的生物硫醇表現(xiàn)出不同的信號(hào)模式(H2S為紅色，Cys為藍(lán)色-紅色，Hcy為藍(lán)色-綠色-紅色，GSH為綠色-紅色)。這項(xiàng)工作有可能為發(fā)現(xiàn)同時(shí)區(qū)分不同RSS的熒光探針開(kāi)辟新的途徑，并為闡明生物硫醇復(fù)雜的相互作用和確切的生物學(xué)功能提供強(qiáng)大的化學(xué)工具[36]。

圖19 探針的識(shí)別位點(diǎn)Figure 19 Recognition sites of probe.

2018年，YANG等人以2，4-二硝基苯和7-硝基-1，2，3-苯并惡二唑兩個(gè)熒光團(tuán)通過(guò)醚鍵合成了一種熒光探針NCQ(圖20)，NCQ有兩個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)。對(duì)于反應(yīng)位點(diǎn)1，醚鍵可以被5個(gè)硫醇全部切斷，底物釋放出藍(lán)色的CQ和非熒光的硫取代的NBD中間體。2號(hào)位點(diǎn)僅對(duì)噻吩有反應(yīng)，對(duì)Cys/Hcy/GSH/H2S無(wú)反應(yīng)。噻吩可以同時(shí)裂解DNB和NBD的醚鍵，釋放出藍(lán)色的香豆素1，進(jìn)而形成紅色的TQC。NCQ溶液對(duì)Cys/Hcy、GSH/H2S和硫酚呈現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)：Cys/Hcy為藍(lán)色和綠色，GSH/H2S為藍(lán)色，硫酚為藍(lán)色和紅色。通過(guò)藍(lán)-綠-紅發(fā)射色組合，可在溶液和活細(xì)胞中鑒別檢測(cè)Cys/Hcy、GSH/H2S[37]。

1.3 基于CuS沉淀機(jī)理的熒光探針

向熒光團(tuán)引入一個(gè)含Cu2+的配位基團(tuán)后，順磁性的Cu2+金屬中心能夠有效地將熒光基團(tuán)的熒光淬滅掉。由軟硬酸堿理論，軟堿S2-與交界酸Cu2+有較強(qiáng)的親和力；因此若向該Cu2+配合物中引入H2S，則Cu2+會(huì)傾向于生成比配合物更加穩(wěn)定的CuS沉淀(Ksp=1.26×10-36)，從而使得探針主體中的Cu2+被“剔除”，于是熒光得以恢復(fù)，就此達(dá)成對(duì)H2S的識(shí)別和檢測(cè)。

2018年，尹正日利用香豆素酰肼肟熒光配體合成了一個(gè)H2S熒光探針1-Cu2+(圖21)。配體1和Cu2+的配合作用，容易得到配合物1-Cu2+。由于具有順磁效應(yīng)的Cu2+具有猝滅熒光的特點(diǎn)，1-Cu2+的熒光很弱。Cu2+的脫除可以使得熒光配體的熒光得到恢復(fù)，表現(xiàn)出對(duì)H2S的熒光增強(qiáng)。此探針對(duì)H2S顯示出很高的選擇性。在PBS緩沖溶液中，此探針對(duì)H2S的響應(yīng)時(shí)間為5 s，檢測(cè)限為37 nmol/L。該探針具有可再生利用和抗干擾的特點(diǎn)，具有很強(qiáng)的實(shí)用性[38]。

圖20 探針的識(shí)別位點(diǎn)Figure 20 Recognition sites of probe.

圖21 探針的合成Figure 21 Synthesis of probe.

2019年，LIU等人合成一種新型的香豆素?zé)晒馓结楥MOH(圖22)，用于檢測(cè)水介質(zhì)和活細(xì)胞中的Cu2+和S2-。CMOH對(duì)Cu2+具有較高的靈敏度和選擇性，探針通過(guò)1∶1的結(jié)合方式與Cu2+形成非熒光絡(luò)合物CMOH-Cu2+。根據(jù)位移法，CMOH-Cu2+的熒光在S2-存在下被恢復(fù)，其檢測(cè)限為11.4 nmol/L。

這種“開(kāi)-關(guān)-開(kāi)”過(guò)程可在1 min內(nèi)完成，并至少重復(fù)5次。此外，CMOH滲透性好，細(xì)胞毒性低，可作為檢測(cè)生物系統(tǒng)中Cu2+和S2-變化的合適工具[39]。

2019年，YAN等人設(shè)計(jì)一種基于香豆素的“開(kāi)-關(guān)-開(kāi)”比色熒光探針L(圖23)，用于連續(xù)識(shí)別Cu2+和S2-。該探針對(duì)Cu2+和S2-的檢測(cè)限分別為2×10-8和6×10-8mol/L。此外，合適的寬pH值(4～10)，表明探針L可以應(yīng)用于生物檢測(cè)，MTT實(shí)驗(yàn)表明探針的細(xì)胞毒性可以忽略，在體內(nèi)識(shí)別Cu2+和S2-的潛力很大，而且可用于測(cè)定A375細(xì)胞中的Cu2+和S2-[40]。

圖22 探針的作用機(jī)理Figure 22 Mechanism of probe.

圖23 探針的識(shí)別位點(diǎn)Figure 23 Recognition sites of probe.

本文從H2S熒光探針的識(shí)別機(jī)理進(jìn)行歸納和整理。如表1所示，文獻(xiàn)中報(bào)道的大多數(shù)H2S探針不僅可以用于細(xì)胞中內(nèi)源性和外源性H2S的檢測(cè)，而且還可以用于氣體中檢測(cè)H2S。

表1 H2S熒光探針匯總

2 結(jié)論和展望

近三年來(lái)，熒光探針檢測(cè)H2S報(bào)道的不少，但基于香豆素?zé)晒鈭F(tuán)所設(shè)計(jì)的H2S熒光探針報(bào)道的較少，仍然有大量的創(chuàng)新有待研發(fā)。例如，通過(guò)在香豆素3、4號(hào)位上連接不同的基團(tuán)用來(lái)形成不同的探針，在7號(hào)位上連接不同的基團(tuán)，如羥基，二乙氨基等，這樣香豆素基團(tuán)3、4或7號(hào)位上都能連接不同的基團(tuán)，可以形成同時(shí)檢測(cè)兩種物質(zhì)或者起到協(xié)同作用。已有少數(shù)科研工作者做了一些研究，但更深入的研究仍需要更多的探索。