蘭小英，盧榕（通信作者），練明建

廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科·廈門市基因檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （福建廈門 361003）

結(jié)核病為結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染所引起的慢性傳染性疾病，位列全球十大死因之中，同時(shí)也是單一傳染病中的“頭號(hào)殺手”[1]。據(jù)《全球結(jié)核病報(bào)告》顯示，2018年約有1 000萬(wàn)新發(fā)結(jié)核病患者，其中57%為成年男性，我國(guó)的結(jié)核病發(fā)病率居世界第二[2]。人體感染MTB初期，無(wú)明顯臨床表現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體免疫力低下或變態(tài)反應(yīng)增高時(shí)會(huì)發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病，給患者及其家屬身心帶來(lái)嚴(yán)重傷害[3]。因此，早期診斷并及時(shí)有效治療結(jié)核病是降低我國(guó)結(jié)核病發(fā)病率的關(guān)鍵[4]。目前，如何快速、準(zhǔn)確診斷結(jié)核病成了研究的熱點(diǎn)。本研究將比較結(jié)核菌素（purified protein derivative，PPD）試驗(yàn)、結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-cell spot test for tuberculosis infection，T-SPOT.TB）、結(jié)核分枝桿菌抗體（mycobacterium tuberculosis antibody，TB-Ab）檢測(cè)和抗酸染色涂片（acid-fast smear，AFS）4種檢測(cè)方法對(duì)結(jié)核病診斷的臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月至2019年12月我院收治的326例患者為研究對(duì)象，其中結(jié)核病患者198例，非結(jié)核病患者128例。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，經(jīng)患者知情同意并簽署知情同意書(shū)。所有確診結(jié)核病患者均根據(jù)既往病史、臨床癥狀和體征、影像學(xué)檢查及抗結(jié)核治療有效而確診，結(jié)核感染確診根據(jù)我國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（WS 196-2017）[5]。

1.2 方法

PPD試驗(yàn)：于左前臂掌側(cè)前1/3無(wú)瘢痕處皮內(nèi)注射5 IU PPD，經(jīng)72 h（48～96 h）測(cè)量皮膚硬結(jié)直徑。判讀標(biāo)準(zhǔn)：陰性（-），硬結(jié)平均直徑＜5 mm或無(wú)反應(yīng)；弱陽(yáng)性（+），5 mm≤硬結(jié)平均直徑＜10 mm；中度陽(yáng)性（2+），10 mm≤硬結(jié)平均直徑＜15 mm；強(qiáng)陽(yáng)性（3+），硬結(jié)平均直徑≥15 mm或局部出現(xiàn)劇烈紅腫、雙圈、水泡、組織壞死及淋巴管炎。

T-SPOT.TB：按照T-SPOT.TB試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，該實(shí)驗(yàn)采用免疫印跡的方法，將采集好的5 ml肝素抗凝外周靜脈血，采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），洗滌，記數(shù)PBMCs；然后分別將50 μl陰性對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)液、陽(yáng)性對(duì)照植物血凝素、A抗原早期分泌性靶抗原6（6 kDa early secretary antigenic target，ESAT-6）及B抗原濾液培養(yǎng)蛋白10（culture filtrate protein 10，CFP-10）加入已包被有抗干擾素-γ（interferongamma，IFN-γ）抗體的微量板4個(gè)孔中，每孔再加入100 μl PBMCs，同時(shí)置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育16～20 h；磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS） 洗滌，再加入50 μl底物工作液37 ℃孵育2～3 h，采用斑點(diǎn)計(jì)數(shù)儀自動(dòng)計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)。判斷標(biāo)準(zhǔn)：要求陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≤5個(gè)，陽(yáng)性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥20個(gè)，當(dāng)檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)-陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥5個(gè)時(shí)，結(jié)果判定為陽(yáng)性。

TB-Ab 檢測(cè)：按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將質(zhì)控品和檢測(cè)試劑預(yù)先平衡至室溫，在質(zhì)控孔和檢測(cè)孔上依次加入封閉液、40 μl 新鮮的血清、6滴洗滌液、2滴金標(biāo)液、6滴洗滌液，每次滴入后等待薄膜吸入，最后觀察結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)：陰性，質(zhì)控點(diǎn)顯示紅色，反應(yīng)孔中間無(wú)紅色斑點(diǎn)或僅為痕跡；陽(yáng)性，質(zhì)控點(diǎn)顯示紅色，反應(yīng)孔中間有紅色斑點(diǎn)出現(xiàn)。

AFS：按照涂片、固定、抗酸染色的步驟制作玻片，顯微鏡下觀察結(jié)果，抗酸桿菌具有耐受酸性介質(zhì)脫色的生物特性，石碳酸（苯酚）和復(fù)紅將抗酸桿菌染色后，加入3%鹽酸乙醇脫色，標(biāo)本中的非抗酸菌及其他脫落細(xì)胞被復(fù)染劑亞甲藍(lán)染為藍(lán)色，抗酸桿菌在顯微鏡下保持紅色。判斷標(biāo)準(zhǔn)：抗酸桿菌陰性，連續(xù)觀察300個(gè)不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌；抗酸桿菌陽(yáng)性（1+），3～9條/100視野，連續(xù)觀察300個(gè)視野；（2+），1～9條/10視野，連續(xù)觀察100個(gè)視野；（3+），1～9條/1視野；（4+），≥10條/1視野。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

比較PPD 試驗(yàn)、T-SPOT.TB、TB-Ab 檢測(cè)和AFS 4種檢測(cè)方法的靈敏度和特異度，靈敏度=結(jié)核病患者陽(yáng)性例數(shù)/結(jié)核病患者總例數(shù)×100%，特異度=非結(jié)核病患者陰性例數(shù)/非結(jié)核病患者總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

T-SPOT.TB 與其他3種檢測(cè)方法相比，靈敏度最高，特異度最低；AFS 與其他3種檢測(cè)方法相比，特異度最高，靈敏度最低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 4種檢測(cè)方法在結(jié)核病患者和非結(jié)核病患者中的靈敏度、特異度比較

3 討論

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病，近年來(lái)，隨著環(huán)境污染的加劇和艾滋病的傳播，結(jié)核病的發(fā)病率呈明顯升高趨勢(shì)，且高耐藥性結(jié)核病患者的數(shù)量不斷增加，對(duì)潛伏性結(jié)核病患者的早期診斷和及時(shí)治療成為控制結(jié)核病的重要措施。AFS 具有操作簡(jiǎn)單快捷、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，在實(shí)際工作中運(yùn)用廣泛。Lee 等[6]研究結(jié)果顯示，在活動(dòng)性肺結(jié)核病診斷中，AFS 的特異度高達(dá)100.00%。本研究結(jié)果顯示，AFS 與其他3種檢測(cè)方法相比，特異度最高，與上述研究結(jié)果相似。但是，AFS 的靈敏度較低，易漏診，這可能與部分患者留痰困難、標(biāo)本留取不合格有關(guān)。

PPD 試驗(yàn)以MTB 純蛋白衍生物為抗原，在左前臂掌側(cè)前1/3中央皮內(nèi)注射， 48～72 h 后注射部位會(huì)出現(xiàn)皮膚硬結(jié)，根據(jù)硬結(jié)的平均直徑來(lái)判斷結(jié)果，價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單方便，被廣泛應(yīng)用于臨床。本研究結(jié)果顯示，PPD 試驗(yàn)的靈敏度為54.55%，特異度為78.13%，其他3種檢測(cè)方法相比，結(jié)果較為居中，可以作為潛伏性感染者的篩查方法。需要注意的是，將其應(yīng)用于免疫抑制劑、免疫力低下的患者中，可能出現(xiàn)PPD 試驗(yàn)假陰性，從而降低靈敏度[7]；此外，卡介苗的普遍接種會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性的發(fā)生，同時(shí)人工記錄結(jié)果的方式也會(huì)影響判斷的客觀性[8]。

T-SPOT.TB 是近年來(lái)運(yùn)用較為廣泛的檢測(cè)結(jié)核病的方法，也是一種新興的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)，基本原理是將PBMCs 與抗原置于反應(yīng)孔中進(jìn)行特異抗體反應(yīng)，刺激所有的致敏T 細(xì)胞；致敏T 細(xì)胞分泌的IFN-γ 被預(yù)包被在反應(yīng)孔膜上的特異抗體捕獲，經(jīng)過(guò)洗滌、標(biāo)記二抗，堿性磷酸酶與細(xì)胞因子上不同的抗原決定簇結(jié)合；通過(guò)洗滌去除無(wú)任何標(biāo)記的抗體；可溶的底物溶液加入每個(gè)檢測(cè)孔中，在反應(yīng)部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑點(diǎn)，1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)分泌細(xì)胞因子的T 細(xì)胞，記數(shù)斑點(diǎn)數(shù)量可以獲得外周血中被結(jié)核致敏的T 細(xì)胞數(shù)量?？ń槊缇旰痛蟛糠址墙Y(jié)核分枝桿菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）缺少或丟失與T-SPOT.TB 相同的抗原，因此該試驗(yàn)不受卡介苗和大部分環(huán)境分枝桿菌影響[9-10]，卡介苗導(dǎo)致的假陽(yáng)性基本可以排除[11]。查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，多篇文獻(xiàn)評(píng)估了T-SPOT.TB 在活動(dòng)性結(jié)核病特別是痰涂片陰性結(jié)核病中的診斷價(jià)值，報(bào)道的T-SPOT.TB 總體靈敏度和總體特異度分別為80%和79%，高于PPD 試驗(yàn)的65%和75%[12-13]。本研究結(jié)果顯示，T-SPOT.TB 與其他3種檢測(cè)方法相比，靈敏度最高，特異度最低，說(shuō)明T-SPOT.TB 在診斷結(jié)核病方面具有較高的價(jià)值。有研究表明，T-SPOT.TB 在潛伏性感染患者中有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，如果為陰性則可以排除活動(dòng)性結(jié)核病[14]。需要注意的是，T-SPOT.TB 測(cè)定針對(duì)MTB 特異的效應(yīng)T 淋巴細(xì)胞，在感染早期及少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不全等基礎(chǔ)疾病患者中，如艾滋病感染者、腫瘤患者、嬰幼兒等都會(huì)引起假陰性的發(fā)生，從而降低靈敏度[15]。

TB-Ab 檢測(cè)采用純化的MTB 特異性外膜抗原，利用斑點(diǎn)免疫金滲濾試驗(yàn)（dot-immunogold filtration assay，DIGFA）原理，檢測(cè)血清中的MTB 抗體，用于結(jié)核病的輔助診斷。本研究結(jié)果顯示，TB-Ab 檢測(cè)的靈敏度為12.24%（較低），特異度為92.19%（較高），說(shuō)明TB-Ab 檢測(cè)可以作為一種初篩試驗(yàn)，為結(jié)核病的診斷提供參考，其陽(yáng)性結(jié)果表明有MTB感染的可能，或近期有結(jié)核病患者的密切接觸史。

在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家中，潛伏性感染者有5%～10%的可能性發(fā)展成為活動(dòng)性結(jié)核病，并成為新的傳染源，造成結(jié)核病的進(jìn)一步傳播，WHO 指出，全球僅有37%的結(jié)核病患者被確診，發(fā)達(dá)國(guó)家也僅有50%的結(jié)核病患者被確診[16]。因此，對(duì)潛伏性感染者的有效篩查及結(jié)核病的有效防治是控制結(jié)核病的根本。T-SPOT.TB 的靈敏度較高，且受機(jī)體免疫狀態(tài)的影響較小，對(duì)結(jié)核病的診斷具有較高價(jià)值，同時(shí)標(biāo)本獲取方便，只需1管外周血，2 d 快速診斷，但是特異度低，不能作為單獨(dú)或決定性的結(jié)核病確診依據(jù)，需結(jié)合患者的年齡、免疫情況、患病狀態(tài)等進(jìn)行綜合評(píng)估，同時(shí)操作相對(duì)復(fù)雜，需要較高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)條件，價(jià)格相對(duì)昂貴，在我國(guó)基層廣泛開(kāi)展和推進(jìn)具有一定的難度。因此，研究新的抗原、開(kāi)發(fā)新的分子診斷標(biāo)記將是T-SPOT.TB 未來(lái)研究的方向[17]。目前，結(jié)核病的確診需結(jié)合其他檢測(cè)方法、臨床表現(xiàn)及影像學(xué)檢測(cè)，提高靈敏度和特異度，共同作為診斷結(jié)核病的依據(jù)。

綜 上 所 述， T-SPOT.TB 與PPD 試 驗(yàn)、TB-Ab 檢 測(cè) 和AFS 比較，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，是臨床快速診斷結(jié)核病的有效檢測(cè)方法，但由于特異度較低，需要與其他方法聯(lián)合檢測(cè)，以提高早期診斷結(jié)核病的價(jià)值。