杜志花，聞 美，王永吉，張粉果

（山西師范大學生命科學學院，山西 臨汾 041000）

我國的石灰?guī)r礦資源十分豐富，相關統(tǒng)計表明，出露地表的石灰?guī)r總面積多達130 萬km2，而埋藏于地下的則更為廣泛。近幾年來，石灰?guī)r被廣泛應用于建筑、化工和農(nóng)業(yè)等方面，市場需求量逐年增加[1]，石灰?guī)r生態(tài)系統(tǒng)受到極大破壞。石灰?guī)r土壤含有較高的鈣鎂元素，其土層淺薄，鹽堿性高，持水能力弱，受到破壞后其植被恢復和生態(tài)修復難度大。當前對石灰?guī)r地區(qū)的研究主要集中于石灰?guī)r地區(qū)動植物、細菌、真菌等物種的組成與多樣性分布以及該地區(qū)特有植物的適應生境分布[2-3]，而鈣對植物生長影響的研究則主要集中于鈣離子對其他因子脅迫的緩解作用[4-6]，有關石灰?guī)r地區(qū)利用植物生態(tài)恢復的研究則相對較少。因此，開展植物在石灰?guī)r地區(qū)的生態(tài)適應性研究，對于石灰?guī)r地區(qū)生態(tài)恢復尤為重要。

多年生黑麥草(Lolium perenne)是禾本科(Poaceae)黑麥草屬(Lolium)草本植物，叢生，根系發(fā)達，分蘗多，易種植，耐鹽堿，能增加土壤有機質，改善土壤結構，防止水土流失，是優(yōu)質牧草和綠肥作物[7]。開展黑麥草相關研究，不僅能為畜牧業(yè)提供足夠的牧草，而且可以改善和恢復我國日益嚴重的石灰?guī)r地區(qū)生態(tài)環(huán)境。溫度是植物生長過程中必不可少的條件，對種子萌發(fā)有著非常大的影響，溫度過高或過低均會對種子萌發(fā)起到一定的遏制作用[8]。目前，國內外對黑麥草的研究主要集中于重金屬污染脅迫[8-10]、鹽脅迫[11-15]、高溫脅迫[16]、干旱脅迫[17-18]、凍融[19-21]、各種生長激素刺激等[22]對黑麥草生長發(fā)育、生理生化等的影響，以及黑麥草栽培管理、分布分類、種植利用等方面。汪霞等[11]、Marcum 和Pessarakli[13]發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度的增高，黑麥草種子發(fā)芽率和活力指數(shù)逐漸下降；徐彥紅等[23]指出不同鈣磷元素比對黑麥草根的抑制作用大于苗，5 mmol·L?1是適宜黑麥草萌發(fā)的鈣磷濃度比；而有關溫度和氯化鈣濃度共同對黑麥草種子萌發(fā)作用的研究鮮見報道。本研究以多年生黑麥草種子為材料，在適合的光照條件下研究溫度和氯化鈣對黑麥草種子萌發(fā)的影響，尋找適合石灰?guī)r地區(qū)黑麥草種子萌發(fā)的適宜溫度和氯化鈣濃度，以期豐富黑麥草適應性方面的研究，為石灰?guī)r土地的改良、利用以及水土保持提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 種子的來源與保存

試供種子材料為禾本科黑麥草屬多年生黑麥草種子，品種為卡特，2018 年購買于北京德農(nóng)種業(yè)股份公司。經(jīng)試驗測定，初始含水量約為10%。種子千粒重為1.836 7 g。初始發(fā)芽率在90%左右。

1.2 種子萌發(fā)試驗

種子預處理：挑選籽粒飽滿、大小均勻的黑麥草種子，經(jīng)0.3%的高錳酸鉀溶液浸種消毒5 min，去離子水充分洗凈，吸水紙吸干種子表面水分，備用。

溫度和光照：將黑麥草種子置于直徑為6 cm 的一次性無菌培養(yǎng)皿中，內鋪雙層濾紙，分別在5 ℃/15 ℃、10 ℃/20 ℃、15 ℃/25 ℃、20 ℃/30 ℃的溫度范圍內以及在光照/黑暗(12 h/12 h)和全黑暗(24 h)的光照條件下進行萌發(fā)，光照強度為1 500 lx，培養(yǎng)溶液為純凈水，每組4 個重復，每個重復25 粒種子。溫度和光照發(fā)芽試驗持續(xù)17 d，并于每日18: 00 觀察記錄黑麥草種子發(fā)芽數(shù)(胚根或胚芽突破種皮1 mm 即視為種子萌發(fā))，且定期補充蒸餾水以保持培養(yǎng)皿的濕潤。最后計算種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)，確定黑麥草種子的最適光照條件。

溫度和氯化鈣：取96 個培養(yǎng)皿，分別用2 mL 的0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%濃度氯化鈣溶液潤濕濾紙，把黑麥草種子用0.3%的高錳酸鉀溶液消毒處理后，每組隨機取100 粒，每個培養(yǎng)皿25 粒，均勻平攤在培養(yǎng)皿的濾紙上，使種子間留有一定間距。溫度與氯化鈣試驗在最適光照條件下進行，將培養(yǎng)皿分別放入5 ℃/15 ℃、10 ℃/20 ℃、15 ℃/25 ℃、20 ℃/30 ℃的智能光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每個溫度下設置6 種濃度，在最適光照(12 h光照/12 h 黑暗)條件下催芽，每個處理4 次重復。每日18：00 觀察并記錄種子發(fā)芽數(shù)，定期補充相應濃度的氯化鈣溶液以保持培養(yǎng)皿內的濕潤，連續(xù)培養(yǎng)觀察17 d。

1.3 測定指標

種子千粒重：隨機抽取4 份種子，每份1 000 粒，以精確度為0.000 01 水平的電子天平稱重，求平均值。

發(fā)芽率(germination rate, GR) = 種 子 發(fā) 芽 總 數(shù)/供試種子總數(shù) × 100%[6]。

發(fā)芽勢(germination energy, GE) = 日發(fā)芽種子數(shù)達到高峰時，發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù) × 100%[6](光照試驗中發(fā)芽勢在第4 天達到最高峰，溫度與氯化鈣試驗中發(fā)芽勢在第5 天達到最高峰)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差和多因素方差分析，用Duncan′s 法進行顯著性差異分析，檢驗顯著性水平設為0.05，利用Origin 2019b 整理數(shù)據(jù)和繪圖。

2 結果與分析

2.1 黑麥草種子萌發(fā)的最適光照條件

黑麥 草 種子在最 適 光 照(12 h 光 照/12 h 黑暗)條件下，溫度為20 ℃/30 ℃時，光照處理下黑麥草種子的發(fā)芽率顯著高于黑暗處理下的發(fā)芽率(P ＜0.05) (圖1)，而其他溫度時各處理發(fā)芽率無顯著差異(P ＞ 0.05)；且光照處理下，黑麥草發(fā)芽率在4 個不同的溫度梯度下無顯著差異(P ＞ 0.05)；相對于光照處理，黑暗處理下的黑麥草發(fā)芽率受溫度影響大，其中5 ℃/15 ℃時發(fā)芽率最高，高達96%，而20℃/30 ℃的發(fā)芽率僅為75%，可見光照對黑麥草發(fā)芽率有促進作用。

圖1 溫度和光照對黑麥草發(fā)芽率的影響Figure 1 Effects of temperature and light on the germination rate of ryegrass

溫度為5 ℃/15 ℃和10 ℃/20 ℃時，黑暗處理較光照處理下的黑麥草發(fā)芽勢高(圖2)，但差異不顯著(P ＞ 0.05)。而溫度為20 ℃/30 ℃時，光照處理下的發(fā)芽勢顯著高于黑暗處理(P ＜ 0.05)。

溫 度 為5 ℃/15 ℃、10 ℃/20 ℃和15 ℃/25 ℃時，黑暗處理與光照處理的黑麥草發(fā)芽指數(shù)均無顯著差異(P ＞ 0.05) (圖3)，但在20 ℃/30 ℃時，光照處理下的黑麥草種子的發(fā)芽指數(shù)顯著高于黑暗處理(P ＜ 0.05)，高36.82%?？梢?，光照能促進黑麥草的發(fā)芽指數(shù)。

圖2 溫度和光照對黑麥草發(fā)芽勢的影響Figure 2 Effects of temperature and light on the germination potential of ryegrass

圖3 溫度和光照對黑麥草發(fā)芽指數(shù)的影響Figure 3 Effects of temperature and light on the germination index of ryegrass

綜上所述，溫度為20 ℃/30 ℃時，光照條件處理下的黑麥草種子的各項萌發(fā)指標顯著高于黑暗處理(P ＜ 0.05)，因此，正式試驗選擇在光照條件下研究溫度和氯化鈣對黑麥草萌發(fā)的影響。

2.2 溫度和氯化鈣對黑麥草種子發(fā)芽率的影響

溫度和氯化鈣及其交互作用對黑麥草種子的發(fā)芽率均有顯著影響(P ＜ 0.05) (表1)。同一溫度下(20 ℃/30 ℃除外)，1.0%氯化鈣處理下的黑麥草種子發(fā)芽率最高(表2)；溫度為10 ℃/20、15 ℃/25、20℃/30 ℃且氯化鈣濃度 ＞ 1.0%時，隨著氯化鈣濃度的增大，黑麥草種子在發(fā)芽率逐漸降低。在氯化鈣濃度 ≤ 1.5%時，溫度對黑麥草種子發(fā)芽率無顯著影響(P ＞ 0.05) (表2)，氯化鈣濃度為2.0%時，黑麥草種子發(fā)芽率在15 ℃/25 ℃時達到最大，為78%，5℃/15℃時發(fā)芽率最小，為11%；同樣，在氯化鈣濃度為2.5%和3.0%時，發(fā)芽率都是在15 ℃/25 ℃時達到最大，分別是45%和23%，在5 ℃/15℃和20 ℃/30 ℃時最小，分別為15%和3%。由此可知，當氯化鈣濃度 ＜ 2.0%時，溫度對黑麥草種子發(fā)芽率無顯著影響(P ＞ 0.05)，但當氯化鈣濃度 ≥ 2.0%，溫度在15 ℃/25 ℃時可促進黑麥草種子的發(fā)芽率，且溫度過高或過低都會對黑麥草種子發(fā)芽率造成一定的影響。

表1 溫度和氯化鈣對黑麥草種子發(fā)芽指標的影響Table 1 Effect of temperature and calcium chloride on germination index of ryegrass seeds

表2 溫度和氯化鈣處理對黑麥草種子發(fā)芽率的影響Table 2 Effects of temperature and calcium chloride treatment on germination rate of ryegrass seeds%

2.3 溫度和氯化鈣對黑麥草種子發(fā)芽勢的影響

溫度和氯化鈣對黑麥草發(fā)芽勢有顯著影響(P ＜0.05) (表1)。同一溫度下，黑麥草發(fā)芽勢在氯化鈣濃度為3.0%最小(表3)；在溫度為15 ℃/25 和20 ℃/30℃時，氯化鈣濃度從1.0%開始黑麥草發(fā)芽勢隨著氯化鈣濃度的增加而呈逐級遞減趨勢，但在5 ℃/15 ℃時，2.5%氯化鈣處理下黑麥草的發(fā)芽勢顯然要比2.0%和3.0%的高，這對溫度低且氯化鈣濃度高的環(huán)境下黑麥草培育有一定的意義。在2.0%的氯化鈣濃度下，黑麥草種子的發(fā)芽勢在5 ℃/15 ℃和10 ℃/20 ℃下具有顯著差異(P ＜ 0.05) 。在氯化鈣濃度≤1.5%時，不同溫度下的發(fā)芽勢普遍都比較高。氯化鈣濃度為2.0%時，溫度在5 ℃/15 ℃時會抑制黑麥草的發(fā)芽勢，適當?shù)脑鰷赜欣诤邴湶莅l(fā)芽勢的上升，在15 ℃/25 ℃時達到最高，可見溫度過高或過低都會抑制黑麥草的發(fā)芽勢。

2.4 溫度和氯化鈣對黑麥草種子發(fā)芽指數(shù)的影響

溫度和氯化鈣對黑麥草發(fā)芽指數(shù)有顯著影響(P ＜ 0.05) (表1)。同一溫度下，氯化鈣濃度≤ 1.5%時，黑麥草種子發(fā)芽指數(shù)較高(表4)，其中在20 ℃/30 ℃時，0.5%濃度的氯化鈣有助于黑麥草種子發(fā)芽指數(shù)的升高，隨著氯化鈣濃度逐漸增大，黑麥草發(fā)芽指數(shù)越來越低，3.0%的氯化鈣最不利于黑麥草的發(fā)芽指數(shù)。由此可見，在溫度為10 ℃/20 ℃和15 ℃/25 ℃時，一定濃度的氯化鈣對黑麥草種子萌發(fā)具有一定的促進作用，但濃度過高(3.0%)則會大大抑制黑麥草種子發(fā)芽指數(shù)，不利于種子萌發(fā)。同時，同一濃度下，隨著溫度升高，黑麥草發(fā)芽指數(shù)呈增加趨勢，溫度在5 ℃/15 ℃下發(fā)芽指數(shù)最低，0.5%氯化鈣處理下，黑麥草發(fā)芽指數(shù)在20 ℃/30 ℃時達到最高，2.0%氯化鈣處理下，黑麥草發(fā)芽指數(shù)在15 ℃/25 ℃時高于其他溫度。

表3 溫度和氯化鈣處理對黑麥草種子發(fā)芽勢的影響Table 3 Effects of temperature and calcium chloride treatment on germination potential of ryegrass seeds%

表4 溫度和氯化鈣處理對黑麥草種子發(fā)芽指數(shù)的影響Table 4 Effects of temperature and calcium chloride treatment on germination index of ryegrass seeds

3 討論

種子是植物生活史中的重要階段，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)反映了種子發(fā)芽速度、整齊度和幼苗健壯的潛勢和生物量[24]。鈣是高等植物生長所必需的元素之一，Ca2+作為信號物質，參與植物生長發(fā)育以及種子萌發(fā)的過程[25-26]。種子萌發(fā)過程中，溫度也是一個不可缺少的因素，溫度過高或過低均會對種子萌發(fā)造成較大的影響。本研究結果顯示，每個溫度下，黑麥草發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)在0.5%和1.0%的氯化鈣濃度下均較其他濃度的高(其中1.0%氯化鈣處理下的種子萌發(fā)得最好)，且受溫度影響相對較小；當氯化鈣濃度為2.0%、2.5%、3.0%時，黑麥草種子萌發(fā)受到了抑制，受溫度影響相對較大，其中15 ℃/25 ℃是最適合黑麥草種子萌發(fā)的，由此可知，一定低濃度下的氯化鈣可促進黑麥草種子的萌發(fā)，但高濃度的氯化鈣則會抑制黑麥草種子的發(fā)芽率，本研究結果與周際海等[27]黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長對重金屬離子的響應表現(xiàn)為“低促高抑”的結果有相似性。可能原因是低濃度的Ca2+有利于維持細胞質膜的完整性，且Ca2+是偶聯(lián)胞外刺激和胞內反應的第二信使，對植物生長發(fā)育的各個方面有調節(jié)作用，能幫助植物抵抗一定的逆境，在Ca2+濃度較低時，Ca2+的作用明顯，掩蓋了溫度對黑麥草的影響，因此各個溫度下低濃度氯化鈣處理的黑麥草長勢都比較好[28]；而當氯化鈣濃度較大時，Ca2+過多，水勢降低，導致種子幼芽吸水困難，使植物細胞滲透失衡，導致種子萌發(fā)過程中生理缺水，影響種子萌發(fā)，此時溫度對種子的萌發(fā)有了較明顯的作用，溫度的適當升高促進了種子的呼吸，溫度過低或過高都會影響種子酶的活性[29]。該研究表明，高濃度的氯化鈣處理下，15 ℃/25 ℃是適合黑麥草萌發(fā)的最佳溫度，該溫度范圍也符合前人研究結果。賈風勤[16]研究指出，最適合車前(Plantago asiatica)種子萌發(fā)的溫度為20～30 ℃，劉林等[30]同樣指出報春花(Primula malacoides)的最適溫度在20 ℃或25 ℃。本研究中，當氯化鈣濃度為3.0%時，黑麥草發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均最低，尤其是發(fā)芽指數(shù)，推測引發(fā)黑麥草種子萌發(fā)的氯化鈣濃度最大閾值為3.0%。

4 結論

低濃度(≤ 1.5%)氯化鈣促進了黑麥草種子萌發(fā)，而高濃度(≥ 2.0%)氯化鈣抑制了黑麥草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)，黑麥草種子萌發(fā)的氯化鈣濃度最大閾值為3.0%。低濃度氯化鈣處理下，溫度對黑麥草萌發(fā)幾乎無影響，但當高濃度氯化鈣處理時，溫度對黑麥草種子萌發(fā)影響顯著，在15 ℃/25 ℃時最佳。本研究證明，黑麥草是石灰?guī)r地區(qū)生態(tài)恢復的優(yōu)良物種，在利用其進行生態(tài)恢復時，需充分考慮當?shù)貧夂蚝屯寥乐锈}離子的含量。