孫靜瑤，佟偉民，牛亞梅

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 病理學(xué)系， 北京 100005)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是各種癡呆中最常見(jiàn)的一種病癥，臨床上主要表現(xiàn)為記憶、認(rèn)知功能障礙以及其他行為和精神癥狀，給家庭和公共衛(wèi)生帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。因此，亟需闡明AD的發(fā)病機(jī)制、并進(jìn)而研發(fā)有效的診治手段。

迄今為止，多項(xiàng)DNA層面上的研究已在編碼淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)、早老素1(presenilin 1, PSEN1)和早老素2(presenilin 2, PSEN2)的基因中鑒定出與早發(fā)型AD發(fā)生有關(guān)的基因突變、同時(shí)也鑒定出多個(gè)與晚發(fā)型AD發(fā)病有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)基因[2]。蛋白質(zhì)層面的研究則發(fā)現(xiàn)β-淀粉樣肽(β-amyloid peptides, Aβ)沉積導(dǎo)致的淀粉樣斑塊[3]和微管相關(guān)蛋白tau(microtubule associated protein tau, MAPT)異常磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)[4]是AD的主要病理特征。轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是RNA轉(zhuǎn)錄生成之后包括轉(zhuǎn)錄、剪接、出核、翻譯等多個(gè)環(huán)節(jié)在內(nèi)的一系列調(diào)控事件，這一過(guò)程的正常進(jìn)行是確保該基因生物學(xué)功能得以正常發(fā)揮的必要前提之一，其中任一環(huán)節(jié)異常均有可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)是mRNA上最為常見(jiàn)的表觀轉(zhuǎn)錄修飾，而且在腦組織中高豐度存在[5]，幾乎參與調(diào)控mRNA代謝過(guò)程的每個(gè)環(huán)節(jié)，因此推測(cè)m6A甲基化失衡也可能與AD發(fā)生相關(guān)。本文在此總結(jié)了迄今已報(bào)道的AD發(fā)生過(guò)程中出現(xiàn)的各種mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控異常，并根據(jù)現(xiàn)今RNA表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控領(lǐng)域的發(fā)展提出了研究AD發(fā)病機(jī)制新的方向。

1 mRNA的選擇性剪接

選擇性剪接(alternative splicing)是真核生物中一種重要的mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控模式，在神經(jīng)系統(tǒng)中尤為普遍，并與包括AD在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生有關(guān)[6]。

AD中淀粉樣斑塊與神經(jīng)元纏結(jié)的形成即與mRNA選擇性剪接調(diào)節(jié)的異常密切相關(guān)。APPRNA含有18個(gè)外顯子，其選擇性剪接產(chǎn)物主要有3種形式：表達(dá)包含所有外顯子的APP770、缺少外顯子8的APP751和缺少外顯子7、8的APP695，其中APP695在神經(jīng)元中表達(dá)豐富，但在AD患者腦中表達(dá)下降，而APP770則表達(dá)增加，這可能與神經(jīng)元ELAVL蛋白家族的調(diào)節(jié)有關(guān)[6]。APP代謝相關(guān)基因的mRNA剪接異常也參與AD的發(fā)生，如剪接調(diào)節(jié)因子hnRNPA2/B1的表達(dá)降低可導(dǎo)致β-分泌酶BACE1基因的異常剪接[7]，一些早發(fā)型AD病例的研究也發(fā)現(xiàn)PSEN1或PSEN2中突變引起的剪接異?？蓪?dǎo)致蛋白質(zhì)功能喪失[2]。MAPT基因由16個(gè)外顯子組成，其選擇性剪接可產(chǎn)生6種亞型，其中按照外顯子10的剪接分為含有3個(gè)微管重復(fù)結(jié)構(gòu)域的3R-tau和含有4個(gè)微管重復(fù)結(jié)構(gòu)域4R-tau，在成人正常腦組織中二者比例約為1∶1，但在AD患者中這一比例失調(diào)[8]。

另外，許多AD風(fēng)險(xiǎn)基因也存在剪接的失調(diào)。載脂蛋白EAPOE有3種類型的等位基因變異體，攜帶等位基因APOEε4的個(gè)體其Aβ的清除率低，AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高顯著，是AD最主要的風(fēng)險(xiǎn)基因[1]。APOE有包含外顯子1的APOE-001、APOE-002和不包含外顯子1的APOE-005共3種剪接亞型，后者在顳葉中上調(diào)而前者下調(diào)[1]。AD的另一風(fēng)險(xiǎn)基因TREM2在腦中也存在多種不同的轉(zhuǎn)錄本，其中包含全部5個(gè)外顯子和僅缺少外顯子5的蛋白產(chǎn)物通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)域定位在細(xì)胞膜上，而缺少外顯子4的轉(zhuǎn)錄本編碼可溶性的TREM2在AD患者腦脊液中呈升高現(xiàn)象，這可能是由跨膜蛋白的裂解或不同轉(zhuǎn)錄本表達(dá)改變導(dǎo)致[9]。

剪接因子等RNA結(jié)合蛋白在選擇性剪接過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，如MAPTmRNA的剪接即受到SC35和ASF/SF2蛋白等多種SR剪接因子的復(fù)雜調(diào)控，通過(guò)此途徑可影響tau亞型的比例并改變小鼠的認(rèn)知功能[8]。已有研究嘗試?yán)梅戳x寡核苷酸干擾mRNA與剪接相關(guān)RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合及其剪接過(guò)程，可在細(xì)胞水平減少Aβ的產(chǎn)生[3]，這是目前AD治療方法研究的新方向之一。

2 mRNA出核運(yùn)輸

真核細(xì)胞中核酸的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程一般通過(guò)核孔復(fù)合體進(jìn)行，一旦發(fā)生核孔復(fù)合體損傷、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白或核膜異常，則會(huì)影響包括mRNA在內(nèi)的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)程。核孔復(fù)合體由富含F(xiàn)G結(jié)構(gòu)域的多種核孔蛋白(phenylalanine-glycine rich, Nups)核孔蛋白組裝而成，其中Nup98直接參與mRNA的出核運(yùn)輸，而AD中它可與病理性tau蛋白直接相互作用，導(dǎo)致Nup98錯(cuò)誤定位于細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)加速tau蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的聚集和纖維化[4]。

核膜的異常也會(huì)對(duì)核質(zhì)運(yùn)輸產(chǎn)生影響，AD患者死后的腦組織中發(fā)現(xiàn)大約60%的神經(jīng)元存在核膜內(nèi)陷，這種核質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張可能是tau蛋白誘導(dǎo)的Lamin蛋白水平降低導(dǎo)致的[10]。由于從轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)擴(kuò)散到核孔復(fù)合體是mRNA出核轉(zhuǎn)運(yùn)的限速步驟，而內(nèi)陷的核被膜上有核孔，故猜想核質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張可以促進(jìn)mRNA的出核轉(zhuǎn)運(yùn)[10]。在AD的果蠅模型中發(fā)現(xiàn)了核質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)陷以及附近poly(A) RNA的聚集，而敲除或抑制與RNA出核轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的重要蛋白如NTF2樣輸出因子1 (nuclear transport factor 2-like export factor 1, NXT1)后，tau轉(zhuǎn)基因果蠅中神經(jīng)元死亡減少，雖然還未證明NXT1等蛋白是否存在其他功能導(dǎo)致這種現(xiàn)象，但這可以作為未來(lái)療法研究的新方向[10]。

3 mRNA翻譯

成熟的mRNA在核糖體中翻譯合成蛋白質(zhì)，穩(wěn)定的翻譯對(duì)突觸的功能至關(guān)重要[11]，核糖體功能障礙和蛋白質(zhì)合成的改變?cè)贏D早期即可出現(xiàn)。Tau蛋白可以與核糖體蛋白S6相互作用使得后者功能損傷[11]，Aβ42寡聚肽會(huì)導(dǎo)致45S pre-rRNA和18S 和28S rRNA的水平下調(diào)，影響rRNA的合成和加工[12]，這都可能使AD患者中mRNA翻譯過(guò)程受到影響，進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知障礙[11]。

另外，神經(jīng)元軸突和神經(jīng)末梢的蛋白質(zhì)局部合成對(duì)軸突和突觸功能至關(guān)重要[13]。例如,在正常情況下tau蛋白主要位于軸突，而AD患者中tauRNA與RNA結(jié)合蛋白共同定位于樹(shù)突和突觸后的顆粒結(jié)構(gòu)中，受到特定刺激會(huì)引起mRNA翻譯迅速上調(diào)[14]。蛋白質(zhì)局部合成過(guò)程受到多種RNA結(jié)合蛋白的調(diào)控，如脆性X智力低下蛋白FMRP可以通過(guò)結(jié)合定位于突觸的mRNA、妨礙核糖體發(fā)揮作用達(dá)到抑制翻譯的作用，APPRNA的翻譯即通過(guò)這種機(jī)制受到抑制，而mGluR5的激活可解除這種抑制，導(dǎo)致APP上調(diào)[15]。雖然目前在AD患者中沒(méi)有觀察到FMRP表達(dá)水平的顯著變化，其功能的調(diào)節(jié)在AD發(fā)病過(guò)程中的機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究探索[15]。

4 mRNA降解

除了轉(zhuǎn)錄和翻譯之外，mRNA的豐度同樣取決于其降解速度，非編碼RNA與RNA結(jié)合蛋白都在此過(guò)程的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。例如，AD患者的腦樣本中BACE1 mRNA的穩(wěn)定性是由于lncRNA BACE1-AS表達(dá)上調(diào)、抑制了miR-485-5p介導(dǎo)的RNA降解所致[16]。而AD中tauRNA穩(wěn)定性會(huì)因RNA結(jié)合蛋白TDP-43表達(dá)下調(diào)而降低從而進(jìn)一步導(dǎo)致tau蛋白的表達(dá)抑制，提示TDP-43的下調(diào)可能與AD和相關(guān)神經(jīng)退行性疾病有關(guān)[17]。Rbfox蛋白家族也可調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性，其中Rbfox1在AD中下調(diào)，可能通過(guò)影響相關(guān)突觸傳遞蛋白mRNA的穩(wěn)定性和豐度而導(dǎo)致突觸損傷，同時(shí)Rbfox1的表達(dá)與性別及年齡密切相關(guān)，在女性及老年人中表達(dá)水平低也與AD風(fēng)險(xiǎn)因素一致[18]。因此，鑒定AD中的mRNA降解異?；蛞彩亲罱K闡明AD發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。

5 m6A調(diào)控因子在AD疾病中的異常表現(xiàn)

m6A甲基化平衡主要由甲基轉(zhuǎn)移酶(包括METTL3、METTL14等)和去甲基化酶(包括ALKBH5、FTO)共同調(diào)控[5]。其中，去甲基化酶FTO在AD小鼠模型腦組織中上調(diào)，通過(guò)TSC1-mTOR-Tau信號(hào)通路調(diào)節(jié)tau蛋白的磷酸化[19]， 雖然FTO是否能夠?qū)SC1 RNA直接去甲基化并影響其穩(wěn)定性需要進(jìn)一步研究證實(shí)，但提供了m6A參與AD病理的可能性。另一方面，m6A對(duì)RNA代謝的調(diào)控功能主要通過(guò)其結(jié)合蛋白[如YTH(YT521-B homology)家族]介導(dǎo)完成。其中YTHDC1可與多個(gè)SR蛋白(serine/arginine-rich protein)家族成員發(fā)生相互作用，與SRSF3的結(jié)合可參與調(diào)節(jié)mRNA的剪接和出核[20-21]。在參與tau蛋白選擇性剪接的SR蛋白家族中，SRSF2可結(jié)合有m6A的RNA并促進(jìn)外顯子的包含[22]。另外，參與APP mRNA翻譯調(diào)節(jié)的FMRP(fragile mental retardation protein)也可識(shí)別m6A，并有可能籍此調(diào)控神經(jīng)元突觸的局部蛋白質(zhì)合成[23]或參與調(diào)節(jié)m6A依賴的mRNA出核運(yùn)輸[24]。

6 問(wèn)題和展望

本課題組主要從事表觀轉(zhuǎn)錄標(biāo)記m6A在腦腫瘤與神經(jīng)退行性疾病中的作用與機(jī)制的研究。前期研究已發(fā)現(xiàn)，與正常腦組織相比，AD患者的顳葉腦組織中RNA m6A水平發(fā)生明顯改變(未發(fā)表數(shù)據(jù))，由此推測(cè)m6A介導(dǎo)的mRNA代謝改變可能與AD的發(fā)病有關(guān)，而其中的機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

綜上所述，AD發(fā)病過(guò)程中存在多種mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控異常，因素多種多樣且仍有很多不明之處。隨著RNA生物學(xué)領(lǐng)域的不斷發(fā)展，對(duì)AD以及其他神經(jīng)退行性疾病中mRNA代謝的研究將變得更加便利。負(fù)責(zé)維持m6A甲基化平衡、介導(dǎo)其生物學(xué)作用的m6A調(diào)控基因在AD中表現(xiàn)異常，我們推測(cè)這有可能進(jìn)一步破壞正常的RNA代謝過(guò)程，因此研究AD發(fā)病過(guò)程中的m6A甲基化變化將為闡明AD的發(fā)病機(jī)制提供新的思路與方向。