封紫嫣，王相國，袁夢儀，付博凡，謝彤彤，常 迪，吳春陽，倪和民，肖龍菲

(北京農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

哺乳動物的妊娠過程需要母體與胎兒間建立聯(lián)系、進(jìn)行物質(zhì)交換并協(xié)同發(fā)展。子宮是孕育胎兒的重要場所，在哺乳動物生殖過程中，子宮內(nèi)膜與胚胎附植間有著密切聯(lián)系。子宮內(nèi)膜位于哺乳動物的子宮腔面，正常的子宮內(nèi)膜由內(nèi)側(cè)的上皮層(具有分泌功能的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞)和其下方的固有層(基質(zhì)細(xì)胞)構(gòu)成。在生殖過程中，子宮內(nèi)膜與胚胎附植間有著密切聯(lián)系[1]；同時，子宮內(nèi)膜作為卵巢激素的作用靶點(diǎn)，其多種生物功能受卵巢激素調(diào)節(jié)，如雌激素和孕激素[2]。哺乳動物的卵巢、黃體、胎盤和睪丸均可分泌雌激素。雌二醇(Estradiol，E2)作為功能性最強(qiáng)的雌激素，參與了調(diào)節(jié)子宮內(nèi)細(xì)胞增殖、腔上皮腺體分泌以及增加子宮內(nèi)血管通透性和子宮肌收縮等功能[3]。

環(huán)氧合酶2(Cyclooxygenase-2，COX-2)是合成前列腺素類化合物(Prostaglandins，PGs)的關(guān)鍵限速酶，COX-2催化合成的PGs在排卵、胚胎植入和胚胎發(fā)育等方面發(fā)揮了重要作用。PGs是由環(huán)氧合酶催化不飽和脂肪酸形成的一類脂類介質(zhì)[4]，屬于膜磷脂的衍生物，其可被催化為5種前列腺素，分別為PGE2、PGF2α、PGI2、PGD2及血栓烷TXA2[5]。妊娠早期，PGF2α能促進(jìn)排卵及配子結(jié)合，妊娠過程中PGF2α參與調(diào)控胚胎附著和發(fā)育[6]。研究顯示，子宮來源的PGF2α對嚙齒類和反芻類動物的黃體溶解發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[7]，PGF2α還可促進(jìn)子宮頸成熟和促進(jìn)分娩等。PGF2α通過誘導(dǎo)豬子宮平滑肌收縮從而參與調(diào)節(jié)分娩過程[8]。E2能誘導(dǎo)牛輸卵管上皮細(xì)胞[9]和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞COX-2的表達(dá)，從而促進(jìn)PGF2α的分泌[10]。哺乳動物妊娠過程中的激素調(diào)控十分復(fù)雜，關(guān)于E2調(diào)控妊娠早期奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中COX-2的表達(dá)及PGF2α合成的具體調(diào)控機(jī)制，目前研究尚不充分。

因此，試驗(yàn)以奶牛為模式動物，通過體外培養(yǎng)妊娠早期奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，利用qRT-PCR、Western Blot、ELISA等技術(shù)，探究E2對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中COX-2的表達(dá)及PGF2α分泌的影響，并深入研究相關(guān)的作用途徑及分子機(jī)制，為進(jìn)一步探究奶牛的生殖生理和繁殖機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 奶牛子宮樣品收集

奶牛子宮收集自河北省大廠縣屠宰場。根據(jù)子宮中胎兒大小，選取外觀健康，妊娠45～90 d的奶牛子宮。將收集的子宮組織用37 ℃預(yù)溫含0.01 mol/L雙抗的DPBS(磷酸鹽緩沖液)清洗后，2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室用于后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2 奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)

無菌條件下，用眼科鑷和眼科剪將子宮內(nèi)側(cè)脂肪組織去除干凈。剝離子宮內(nèi)膜并用含0.01 mol/L雙抗的DPBS清洗3次后，剪成1 mm2大小的組織塊。將組織塊接種于75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，靜置2 h后，加入5 mL含10% FBS的完全培養(yǎng)基(DMEM/F12，HYClone)并放入37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔48 h進(jìn)行換液，當(dāng)細(xì)胞鋪滿至80%時，根據(jù)子宮基質(zhì)細(xì)胞和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞消化時間不同，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞純化和傳代。

1.3 子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的鑒定

將純化后的F2子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞均勻傳至6孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片。培養(yǎng)3 d后選取細(xì)胞量為50%～60%的細(xì)胞去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用4 ℃預(yù)冷的DPBS清洗3次；加入1 mL 4%的多聚甲醛固定30 min。4 ℃預(yù)冷的DPBS清洗3次后，加入1 mL 0.01% Triton X-100通透15 min。用4 ℃預(yù)冷的DPBS清洗3次后，加入1 mL 5%的BSA封閉30 min。加入200 μL稀釋好的兔抗多克隆角蛋白-18抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-2043R，1∶100)4 ℃過夜，之后加入100 μL PE標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗(北京全式金生物技術(shù)有限公司，HS121，1∶150)，37 ℃避光孵育1 h。4 ℃預(yù)冷的DPBS清洗后，加入200 μL的1 μg/mL DAPI避光孵育1 min。預(yù)冷的DPBS清洗并用倒置熒光顯微鏡拍照觀察。

1.4 細(xì)胞處理

將純化后子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞按106/mL細(xì)胞密度接種于6孔板中，放入37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞量為80%～90% 時棄去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基對細(xì)胞饑餓12 h。為了檢測E2對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞COX-2表達(dá)及PGF2α分泌的影響，加入E2(Sigma公司，美國)使其終濃度分別為0,10-9,10-8,10-7mol/L，分批處理細(xì)胞，處理1 h后收集的細(xì)胞檢測Akt及p38 MAPK磷酸化水平；處理24 h后收集的細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基檢測COX-2基因和蛋白的表達(dá)及PGF2α分泌水平的變化。為了驗(yàn)證E2是否通過p38 MAPK和PI3K/Akt信號通路調(diào)控子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞COX-2表達(dá)及PGF2α的分泌，添加10-7mol/L的E2單獨(dú)或聯(lián)合p38 MAPK通路抑制劑SB203580和PI3K通路抑制劑LY294002處理奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞24 h，檢測COX-2基因和蛋白的表達(dá)及PGF2α分泌水平的變化。

1.5 總RNA提取及qRT-PCR

將收集的細(xì)胞按照TriQuick Resgent總RNA提取試劑(北京索萊寶科技有限公司)說明書提取RNA，保存于-80 ℃冰箱。按照Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將得到的cDNA保存于-20 ℃冰箱。

引物序列交由北京生物工程有限公司合成，具體信息見表1。按照SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKaRa))試劑盒說明書進(jìn)行操作，以GAPDH為參照基因，每個樣品重復(fù)3次，具體反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt定量分析法分析基因的表達(dá)變化。

表1 實(shí)時熒光定量PCR引物Tab.1 Primers used in Real-time PCR

1.6 總蛋白提取及Western Blot

向收集到的細(xì)胞中加入150 μL添加了1% PMSF和蛋白酶抑制劑的 RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司)，反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞，12 000 r/min離心5 min，用BCA試劑盒測定蛋白濃度；取總蛋白40 μg加入4×Loading Buffer(北京索萊寶科技有限公司)，98 ℃變性10 min后置于冰盒上。上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后，分別用Akt多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-6951R，1∶500)，p-Akt多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-0876R，1∶500)，p38 MAPK多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-0637R，1∶500)，p-p38 MAPK多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-2210R，1∶500)，COX-2多克隆抗體(Abcam，美國，ab169782，1∶500)和GAPDH多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-10900R，1∶3 000)4 ℃孵育過夜。二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-0295G-HRP，1∶3 000)37 ℃孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光(南京諾唯贊生物科技有限公司)檢測蛋白條帶。

1.7 細(xì)胞上清液PGF2α檢測

將收集的細(xì)胞培養(yǎng)基3 000 r/min離心20 min，按照Bovine PGF2αELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)進(jìn)行操作，測定不同濃度E2處理細(xì)胞24 h和E2聯(lián)合ICI182780處理24 h后的細(xì)胞培養(yǎng)基中PGF2α的濃度，每個樣品3個重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(s)表示。通過使用SPSS 19.0(IBM Corporation，NY，USA)進(jìn)行單因素方差分析來評估統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示無差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 上皮細(xì)胞鑒定

通過體外培養(yǎng)妊娠早期奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，研究E2對妊娠早期奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞COX-2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果如圖1所示：純化后的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞之間緊密銜接，連接成片，呈蜂窩狀貼壁生長；通過細(xì)胞免疫熒光染色鑒定奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中角蛋白-18含量，結(jié)果顯示，超過95%的細(xì)胞及細(xì)胞質(zhì)呈陽性表達(dá)，表明獲得的細(xì)胞可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 不同濃度E2對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞COX-2及PGF2α的影響

由圖2可知，不同濃度E2處理子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞24 h后，10-8，10-7mol/L的E2顯著促進(jìn)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中PGF2α的分泌 (P<0.05)；COX-2mRNA的表達(dá)呈濃度依賴性升高(P<0.05)，COX-2蛋白表達(dá)趨勢與基因水平變化一致，均隨著E2水平上升而蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)。

2.3 不同濃度E2對Akt和p38 MAPK磷酸化的影響

結(jié)果如圖3所示，不同濃度E2處理1 h后，10-8，10-7mol/L濃度的E2顯著促進(jìn)了子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中Akt蛋白的磷酸化水平(P<0.05)，而10-9mol/L 的E2則對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中Akt磷酸化水平無顯著影響(P>0.05)。p38 MAPK蛋白的磷酸化與Akt相似，10-9mol/L的E2處理1 h后，p38 MAPK蛋白的磷酸化水平并無顯著變化，而10-8,10-7mol/L E2顯著提高了子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中p38 MAPK蛋白的磷酸化水平(P<0.05)。

2.4 E2和LY294002對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞COX-2表達(dá)和PGF2α分泌的影響

由圖4可知，E2對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中COX-2 mRNA和蛋白的表達(dá)以及PGF2α的分泌有顯著促進(jìn)作用(P<0.05)，雖然單獨(dú)使用PI3K通路抑制劑LY294002對COX-2 mRNA和蛋白的表達(dá)以及PGF2α的分泌沒有顯著影響(P>0.05)，但LY294002與10-7mol/L的E2共同處理時，COX-2 mRNA和蛋白的表達(dá)以及PGF2α的分泌水平則顯著低于10-7mol/L的E2處理組(P<0.05)。

2.5 E2和SB203580對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞COX-2表達(dá)和PGF2α分泌的影響

由圖5可知，E2對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中COX-2mRNA和蛋白的表達(dá)以及PGF2α的分泌有顯著促進(jìn)作用(P<0.05)，雖然單獨(dú)使用p38 MAPK通路抑制劑SB203580對COX-2mRNA和蛋白的表達(dá)以及PGF2α的分泌沒有顯著影響(P>0.05)，但SB203580與10-7mol/L的E2共同處理時，COX-2mRNA和蛋白的表達(dá)以及PGF2α的分泌水平則顯著低于10-7mol/L的E2處理組(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

E2是一種重要的生殖激素，主要由卵巢中的顆粒細(xì)胞合成，胎盤亦可合成E2。哺乳動物的各個器官和組織中都分布著雌激素，子宮和卵巢是雌激素的重要靶器官，雌激素廣泛的參與了調(diào)節(jié)子宮的生殖和生理功能。PGF2α來源于子宮內(nèi)膜，由COX-2催化不飽和脂肪酸形成，具有調(diào)節(jié)胚胎植入、子宮肌收縮和溶解黃體等功能[11]。先前的研究表明，類固醇激素具有調(diào)節(jié)各類細(xì)胞中COX-2的表達(dá)及PGF2α分泌的功能。在本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)10-8，10-7mol/L的E2能促進(jìn)妊娠早期奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中COX-2mRNA和蛋白的表達(dá)，這與Membrive等[12]研究一致，然而Sobrino等[13]表明10-11～10-7mol/L的E2對HUVEC細(xì)胞中的COX-2mRNA表達(dá)無顯著影響。此外，Xiao等[14]研究發(fā)現(xiàn)在牛發(fā)情晚期子宮內(nèi)膜細(xì)胞中，E2則抑制了COX-2的表達(dá)及PGF2α的分泌。這提示E2對不同時期的奶牛子宮中COX-2的表達(dá)可能存在差異。

p38 MAPK信號通路是絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated proteinkinases，MAPKs)家族的重要成員。E2可通過激活細(xì)胞中的p38 MAPK信號通路，參與細(xì)胞增殖、分化和遷移的調(diào)節(jié)[15]。Akt稱為蛋白激酶B，最初發(fā)現(xiàn)為小鼠自發(fā)性胸腺的轉(zhuǎn)化逆轉(zhuǎn)錄病毒中v-akt致癌基因的同源物，該酶是PI3K的直接下游效應(yīng)因子，Akt還能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、影響葡萄糖的使用和血管生成[16]。郭瑞霞等[17]研究發(fā)現(xiàn)E2能激活PI3K/Akt信號通路來促進(jìn)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長。E2可激活PI3K/Akt或p38 MAPK信號通路已在多種細(xì)胞中得到證實(shí)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)E2處理后激活了奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中PI3K/Akt及p38 MAPK信號通路，與在其他細(xì)胞上的發(fā)現(xiàn)一致。

研究顯示，p38 MAPK參與介導(dǎo)人氣道肌細(xì)胞中COX-2的表達(dá)[18]；同時，p38 MAPK還參與介導(dǎo)皮質(zhì)酮對大鼠心肌細(xì)胞中COX-2mRNA的調(diào)控作用。Patterson等[19]研究發(fā)現(xiàn)，E2通過GPER非基因組效應(yīng)反式激活EGFR，促進(jìn)下游的PI3K/Akt磷酸化，進(jìn)而調(diào)控大鼠輸卵管上皮中COX-2的表達(dá)及PGF2α的分泌。PI3K/Akt[20]和p38 MAPK[21]信號通路是包括COX-2在內(nèi)的多種炎性細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)靶標(biāo)。在本研究中，用E2與LY294002、SB203580單獨(dú)或聯(lián)合處理奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，E2對COX-2的表達(dá)及PGF2α分泌的促進(jìn)作用被抑制，PI3K/Akt及p38 MAPK信號通路可通過多種途徑調(diào)控炎癥或癌癥的發(fā)生。而生理濃度的E2對調(diào)控發(fā)情周期、配子植入、胚胎發(fā)育和分娩方面具有重要意義。

綜上所述，通過體外培養(yǎng)妊娠早期奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)E2可通過激活p38 MAPK及PI3K/Akt信號通路，從而促進(jìn)COX-2的表達(dá)及PGF2α的分泌。本試驗(yàn)深入研究E2調(diào)控奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中COX-2的表達(dá)及PGF2α分泌的作用機(jī)制，為探究子宮源性不孕、異位妊娠、早產(chǎn)和其他子宮內(nèi)膜疾病的原因提供了新思路。