黃向月，熊顯榮，2，海 卓，穆松銀，李 鍵，2

(1.西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川 成都 610041；3.動物科學國家民委重點實驗室，四川 成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)是在低氧環(huán)境中具有較強適應能力的牛屬動物之一，有“高原之舟”的美譽[1]。但其繁殖性能較低，阻礙了高原地區(qū)牧業(yè)經濟的發(fā)展。為此，開展牦牛繁殖性能的相關研究可豐富中國畜種資源[2-3]。影響哺乳動物繁殖性能的因素多種多樣，而精子發(fā)生則是眾多因素之一。其過程包括了在睪丸曲細精管中各種精細而復雜調控的細胞分化，生殖細胞經歷一系列分化以及形態(tài)變化后形成單倍體雄性配子[4]，由生精上皮連續(xù)產生液體有助于將精子釋放到腔內，在這之后，精子離開睪丸并進入附睪頭部。在附睪中，精子通過獲得進行性運動并獲能，最后形成特殊形態(tài)的成熟精子。這一過程在諸多因素的協(xié)同調控下進行，其中水轉運在精子運輸、成熟等進程中起著特殊的作用[5-7]。例如，由雄性生殖道上皮細胞分泌和重吸收的水分含量是影響其管腔微環(huán)境穩(wěn)定性及腔內液體組分濃度的原因之一，并通過酶活性的調節(jié)來調控精子的成熟[8]。因此，雄性生殖系統(tǒng)中水轉運的平衡可能是管腔內精子獲得運動和生育能力所必需的條件。

多個存在于哺乳動物中的水通道蛋白家族成員(Aquaporin)，具有不同的通透性特征和不同的亞細胞定位[9]。其具有6個跨膜結構域，是質膜的組成部分，可促進跨膜的水轉運。水通道蛋白家族的成員之一，AQP2在多種組織和細胞中廣泛表達。最初發(fā)現于腎臟的集合管[10]，其細胞表面 AQP2的表達不足會導致腎性尿崩癥[11-12]。目前研究發(fā)現，AQP2在綿羊、兔[13]、小鼠、牛[14]和人類腎臟[15]中表達量極其豐富，主要富集在集合管主細胞和內髓集合管中。有研究表明，AQP2在上皮形態(tài)發(fā)生方面有著關鍵作用，并與整聯蛋白相互作用促進細胞遷移，有助于腎的結構和功能完整性[16]。此外，AQP2還存在于生殖系統(tǒng)中[17-19]，人子宮內膜中的雌激素可介導AQP2的表達水平，AQP2低表達可能導致子宮受體受損，影響胚胎著床[20-21]。AQP2在這些組織中的表達顯示出高水滲透性，并且主要負責腎水濃度以及精子運輸的水轉運機制。由此可知，AQP2在生殖發(fā)育相關生物學活動的調節(jié)中起著一定作用。

目前，關于AQP2在牦牛雄性生殖道中的研究仍未見相關報道。本試驗利用RT-PCR技術得到牦牛AQP2基因的CDS序列，同時分析該序列并預測其蛋白結構。運用免疫組化方法檢測牦牛睪丸組織中AQP2的細胞定位，同時通過qRT-PCR方法檢測牦牛各組織及不同發(fā)育階段雄性生殖器官中AQP2mRNA的表達情況，為進一步從分子水平開展牦牛雄性生殖繁育相關研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

pMDTM19-T載體、 Premix TaqTMDNA聚合酶、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉錄試劑盒購自TaKaRa；熒光定量PCR儀購自Bio-Rad；感受態(tài)細胞DH5α、DEPC、DNA Marker購自天根生化科技有限公司；DNA膠回收試劑盒購自康寧生命科學有限公司。

1.2 樣本采集

牦牛樣本均采自四川廣漢市盛大食品廠，收集腎、睪丸、附睪、脾、腦、肺、心和肝組織；隨后收集胎兒時期(5～6月)、幼年時期(1～2歲)、性成熟時期(4～5歲)牦牛睪丸、附睪、輸精管、前列腺和精囊組織。均采集3頭，置于液氮中。

1.3 總RNA的提取及檢測

根據TRIzol法從牦牛各個組織中提取樣本RNA，使用核酸分析儀測定其濃度和純度，選取符合OD260/280nm值在1.8～2.0作為模板RNA，依照使用說明合成cDNA，-20 ℃保存。

1.4 AQP2的擴增與克隆

利用NCBI已報道的黃牛(Bostaurus)AQP2mRNA序列(登錄號：NM_001101199.1)，使用Primer 5.0設計引物(表1)。由金斯瑞生物科技公司合成。反應體系為25 μL，其中ddH2O 9.5 μL，Premix TaqTMDNA聚合酶12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA 1.0 μL。擴增條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。1.5%凝膠電泳檢測產物，紫外光照切下目的條帶，并回收目的DNA。將pMDTM19-T載體與膠回收產物在16 ℃的金屬浴中連接15 h后，轉換于感受態(tài)細胞，二者混合培養(yǎng)1 h后離心。將沉淀均勻涂于LB固體培養(yǎng)基(AMP+)上，37 ℃培養(yǎng)12 h，選取單菌落，搖床振蕩培養(yǎng)8 h，進行PCR篩選陽性菌液送由Sangon Biotech公司測序。

1.5 牦牛AQP2基因生物信息學分析

使用NCBI中的Blast在線工具獲得AQP2基因的核苷酸序列，通過ORF Finder(ORF)預測其氨基酸序列。使用在線軟件分別預測牦牛AQP2蛋白的基本理化性質(ProtParam)、親疏水性(ProtScale)和二級結構(PredictProtein)。使用Megalign軟件比對物種同源性。

1.6 牦牛AQP2基因組織表達譜分析

根據已獲得的牦牛AQP2和NCBI中黃牛GAPDHmRNA序列(登錄號：AC_000162.1)分別設計引物(表1)，采用qRT-PCR方法檢測該基因在牦牛各組織的表達量。反應體系為15 μL：ddH2O 5.5 μL，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 7.5 μL，cDNA 1.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL。擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40個循環(huán)。2-ΔΔCt法均一化處理結果。

表1 引物序列及PCR反應條件Tab.1 Primer sequences and reaction conditions

1.7 AQP2在牦牛睪丸中的定位

通過免疫組化法檢測AQP2蛋白的定位。從4%多聚甲醛固定液中取出性成熟時期的牦牛睪丸組織，并制成石蠟切片。脫蠟復水后封閉在H2O2(0.88 mol/L)中，PBS(0.01 mol/L，pH值7.4)沖洗3次；5%胎牛血清封閉，滴加一抗(單克隆兔抗AQP2，BSA 500倍稀釋，Abcam公司產品)孵育過夜(4 ℃)；PBS(0.01 mol/L，pH值7.4)沖洗3次后滴加二抗(多聚化山羊抗兔IgG，Abcam公司產品)孵育2 h(37 ℃)；PBS(0.01 mol/L，pH值7.4)沖洗，DAB顯色，復染，脫水、透明、封片，鏡下觀察。

1.8 牦牛雄性生殖道中AQP2的表達模式

同樣以GADPH為內參基因，利用qRT-PCR檢測AQP2在牦牛雄性生殖道的3個階段(胎兒時期、幼年時期、性成熟時期)的表達水平，反應體系同1.6。

1.9 數據分析

每組試驗至少檢測3次，數據使用“平均值±標準誤(Mean±s)”表示。SPSS軟件分析顯著性，P<0.05差異顯著，P>0.05差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 牦牛AQP2基因的克隆

以牦牛腎組織總cDNA為模板，進行擴增AQP2基因的CDS區(qū)，經凝膠電泳檢測，獲得937 bp大小的條帶，對其進行測序并拼接所得序列，結果顯示，其CDS區(qū)為816 bp，共編碼271個氨基酸。

將牦牛AQP2基因與其他物種通過Megalign軟件進行同源性比對發(fā)現，牦牛AQP2mRNA序列與其他哺乳動物的相似度極高，均在90%以上(圖1)。牦牛AQP2基因序列與黃牛、水牛、山羊、藏羚羊、綿羊的相似性分別為99.9%，98.9%，97.3%，97.3%，97.2%。同時對14個物種AQP2基因CDS區(qū)進行系統(tǒng)進化樹構建，結果顯示，該基因CDS區(qū)序列具有很高的保守性，與牦牛親緣關系最近是黃牛，其次是水牛、山羊等(圖2)。由此可見，AQP2基因在物種進化過程中表現高度保守，且多為同義突變。

2.2 牦牛AQP2蛋白結構和功能預測

通過ExPASy工具進行預測AQP2蛋白的理化性質。得到該蛋白分子式為C1322H2080N352O360S7，半衰期為30 h，分子量為28.889 62 ku，等電點為6.70，脂肪族系數為115.94，不穩(wěn)定系數為43.04，推測為酸性不穩(wěn)定蛋白。該蛋白包含20種氨基酸，出現頻率較高的有Leu(14.8%)、Ala(13.3%)、Val(9.6%)、Gly(8.1%)和Ser(7.0%)。帶正電荷氨基酸(Arg+Lys)有17個，帶負電荷氨基酸(Asp+Glu)有18個，由此表明，該蛋白整體帶負電。疏水性預測發(fā)現，牦牛AQP2蛋白的平均親水指數為0.547，最大疏水指數存在于20，21位點(2.789)，最小親水指數存在于251位點(-3.089)，為疏水性蛋白。

SignalP和TMHMM預測發(fā)現AQP2蛋白具有6個跨膜結構域，在第31-32位氨基酸存在信號肽。磷酸化位點預測顯示，AQP2蛋白共有17個磷酸化位點，包含Ser(11個)、Thr(5個)、Tyr(1個)。二級結構預測顯示，該蛋白的α-螺旋占41.33%，β-轉角占2.95%，無規(guī)卷曲占37.27%，延伸鏈占18.45%。

2.3 牦牛AQP2基因的組織表達譜

利用qRT-PCR，參照GAPDH，對AQP2基因在牦牛心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸、附睪組織中的表達模式進行檢測(圖3)。結果顯示，牦牛各組織中AQP2差異表達，以附睪AQP2的表達量為參考，其在睪丸和腎中的表達水平顯著高于其他組織(P<0.05)，附睪、脾、心、肝、肺、腦中該基因表達水平無顯著差異(P>0.05)。

2.4 牦牛睪丸中AQP2蛋白的表達與定位

免疫組化檢測牦牛睪丸中AQP2的定位結果見圖4。棕黃色或黃色著色判定為陽性細胞，主要定位于圓形精子細胞，而其他生精細胞、間質細胞、上皮細胞以及支持細胞均未見陽性反應。

2.5 不同發(fā)育時期牦牛雄性生殖道中AQP2基因的表達

利用qRT-PCR，參照GAPDH，對AQP2基因在不同時期牦牛雄性生殖道中的表達情況進行檢測(圖5)。結果顯示，AQP2基因在牦牛雄性生殖道發(fā)育過程中表達呈動態(tài)變化。其中，在睪丸和輸精管中該基因從胎兒到性成熟時期，即隨著年齡增長，其表達水平呈明顯的上升趨勢。以該基因在胎兒時期睪丸中的表達量作為參考，幼年和性成熟時期顯著高于該時期(P<0.05)。AQP2基因在附睪及精囊中基本不表達，而在輸精管中高表達，性成熟時期其表達量達到最高，約為胎兒時期的12.3倍(P<0.05)。該基因在胎兒期前列腺中的表達量較高，隨生長發(fā)育的進行，其表達水平稍有降低，但差異不顯著(P>0.05)。

3 討論與結論

AQP2，血管加壓素依賴性組成型水通道蛋白，主要受抗利尿激素血管加壓素(ADH)的調節(jié)，通過cAMP/PKA信號轉導的級聯反應使水通道AQP2磷酸化，從而調節(jié)主要細胞對水的跨上皮重吸收[22-23]。除此之外，AQP2還受泛素化、糖基化等其他多種修飾[24-25]。研究表明，許多水通道亞型在哺乳動物雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育和精子濃度方面發(fā)揮關鍵作用。例如，AQP1參與調節(jié)小鼠雄性生殖生理過程中的水穩(wěn)態(tài)[26]。AQP3基因敲除小鼠的精子細胞顯示出正常的運動性，但其在輸卵管中的遷移能力受損，導致雄性生育能力降低[27]。此外，AQP1、2和7在成年犬雄性生殖道中差異表達，對犬的雄性生育能力同樣至關重要[28]。最近研究發(fā)現，AQPs的功能還與細胞體積的控制有關，可通過在附睪液中發(fā)生滲透性變化或在精子成熟過程中參與細胞質去除階段，從而調控細胞體積[6]。因此，探索AQP2在牦牛雄性生殖道發(fā)育過程中的表達規(guī)律將對解析其在牦牛雄性生殖中的作用機制奠定基礎。

本試驗獲得了牦牛AQP2基因的核苷酸序列。比較分析結果顯示，AQP2序列在哺乳動物中的同源性相對較高。同時發(fā)現，黃牛、水牛與牦牛AQP2的氨基酸序列高度吻合，由此可見，AQP2在蛋白質結構水平上及物種進化過程中具有較高保守性。進而推測AQP2氨基酸序列及其蛋白功能的穩(wěn)定性對協(xié)調生物體適應其生存環(huán)境是必要的。

本試驗采用qRT-PCR的方法檢測到AQP2基因在牦牛組織中的表達水平存在差異。結果表明，AQP2mRNA在睪丸和腎中的表達水平顯著高于其他組織，附睪和脾中的表達相對較低。Nelson等[29]研究發(fā)現，AQP2在小鼠腎集合管、輸精管上皮細胞和睪丸內的生精小管中高表達，這與本試驗結果吻合。為進一步確認AQP2蛋白在牦牛睪丸中的細胞定位，本試驗采用免疫組織化學技術對牦牛睪丸AQP2的表達進行了檢測，發(fā)現睪丸中僅圓形精子表達AQP2蛋白。Klein等[30]發(fā)現AQP2在馬曲細精管的圓形精子細胞中表達，推測該基因可能參與精子發(fā)生過程中精子的變態(tài)成形階段。該基因在腎和睪丸中表達量高的原因可能與其各自的生物學功能有關，腎中水的重吸收以及睪丸中的生精過程對水濃度的要求比較高，因此，負責水轉運的AQP2在兩者中顯著表達，以上結果提示AQP2基因可能通過調節(jié)水重吸收和/或精子轉運過程中液體形成和精子發(fā)生等過程，從而對牦牛睪丸發(fā)育起重要作用。

本研究檢測了不同發(fā)育階段雄性牦牛生殖器官中AQP2的表達。qRT-PCR結果顯示，在雄性牦牛生殖道發(fā)育過程中AQP2基因的表達呈現動態(tài)變化。該基因mRNA在睪丸和輸精管中從胎兒到性成熟期的表達水平隨年齡依賴性逐漸增加，直至性成熟時期其表達量達到最高。其表達趨勢與精母細胞減數分裂的開始和圓形精子的發(fā)生等過程相一致，表明該基因可能與精子形成以及后續(xù)的精子運輸有關。已有研究發(fā)現，在輸精管和曲細精管的主要細胞中AQP2高表達，但在附睪中不存在[28]。Da silva等[31]發(fā)現，AQP2蛋白在出生后的幼年期大鼠附睪尾部短暫表達，盡管存在mRNA，但在成年大鼠附睪中不表達，這與本試驗結果基本吻合，而另一研究發(fā)現AQP2蛋白在兔的附睪中表達較高[32]，這可能與物種間的差異相關。Ramli等[33]發(fā)現睪酮可通過上調AQP2的表達水平來促進輸精管液分泌速率的增加，從而對輸精管液體內穩(wěn)態(tài)有重要作用，以確保正常的雄性生育能力。AQP2是輸精管中不受血管加壓素調節(jié)的組成型頂膜蛋白，在輸精管中高表達，可能是由于其參與改變腔內液體含量的過程，通過提取腔內液體進入輸精管來改變精子濃度。因此，AQP2在睪丸和輸精管中的表達水平可能隨著生殖道的發(fā)育和睪酮的增多而逐漸升高，促使精子成熟。而該基因在胎兒時期的前列腺中高表達，后隨生長發(fā)育的進行逐漸降低。這一結果與文獻報道一致[34]。以上結果表明，雄性生殖系統(tǒng)中AQP2的功能可能與維持適當的腔內環(huán)境有關，精子可以在該環(huán)境中進一步成熟。

本研究克隆獲得了牦牛AQP2基因序列，其具有顯著的組織特異性表達，且在生物進化過程中高度保守。在睪丸中AQP2蛋白主要定位于圓形精子細胞，且該基因在牦牛雄性生殖道中表達模式存在顯著差異，提示AQP2可能與牦牛精子發(fā)生、運輸及睪丸生殖功能完善相關，具體作用機制有待進一步研究。