王 茹，陳 超，于麗杰，金曉霞

(哈爾濱師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，植物生物學(xué)黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150025)

重金屬作為地殼中存在的天然成分，一般被分為兩部分，一部分為植物生長(zhǎng)發(fā)育必需元素，如鐵(Fe)、鋅(Zn)、銅(Cu)等；另一部分為植物生長(zhǎng)發(fā)育非必需元素，如鎘(Cd)、鉛(Pb)、汞(Hg)等[1]。Cu作為植物生長(zhǎng)所需的微量元素，參與光合作用、呼吸以及清除超氧化物等重要過程，但是Cu含量一旦超過植物體所能承受的范圍便會(huì)產(chǎn)生自由基，對(duì)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)造成損傷[2]。當(dāng)擬南芥中銅含量過高時(shí)，硝酸鹽高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NTRs)表達(dá)降低，導(dǎo)致其對(duì)氮和其他養(yǎng)分的吸收和積累減少[3]。過量的銅還會(huì)破壞大豆體內(nèi)氮代謝及固定，造成大豆減產(chǎn)[4]。Hg是植物生長(zhǎng)非必需的元素，越來越多的證據(jù)表明，Hg2+很容易在高等植物中積累[5-6]。Cargnelutti等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Hg脅迫下，脂質(zhì)過氧化，蛋白質(zhì)氧化水平升高，導(dǎo)致黃瓜幼苗的葉綠素含量減少、光合速率降低，膜損傷增加。Cd含量過高不僅會(huì)抑制植物生長(zhǎng)，甚至?xí)?dǎo)致其死亡。草莓在Cd脅迫下，葉綠素含量降低，生長(zhǎng)量下降，并且在整個(gè)脅迫過程中根中的Cd含量始終低于葉片[8]。當(dāng)土壤中Cd和Hg的濃度達(dá)到一定程度時(shí)，番茄葉片、芽和根的細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量H2O2和MDA，導(dǎo)致膜脂過氧化，從而對(duì)番茄幼苗產(chǎn)生毒害作用[9-10]。

WRKY基因家族是植物特異性的大型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族，可以通過識(shí)別大量植物防御相關(guān)基因序列中的W-box(TTGAC/T)元件來發(fā)揮它的調(diào)節(jié)功能，并通過調(diào)控防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)來提高植物對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)性和耐受性[11]。擬南芥AtWRKY6基因通過在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中直接下調(diào)RAV1的表達(dá)介導(dǎo)種子萌發(fā)和早期幼苗發(fā)育[12]。并且在低磷條件下，AtWRKY6缺失突變會(huì)導(dǎo)致擬南芥根毛密度的增加[13]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子不僅參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育，在植物抵抗非生物逆境脅迫的過程中也起到了很重要的作用。在煙草中，GhWRKY17通過降低ABA的水平調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中ROS的水平來應(yīng)對(duì)干旱和鹽脅迫[14]。擬南芥中WRKY39也被證明在耐熱性中具有正調(diào)節(jié)作用[15]。Huang等[16]分析微陣列數(shù)據(jù)時(shí)發(fā)現(xiàn)有些WRKY轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)重金屬脅迫，例如OsWRKY53響應(yīng)Hg脅迫，OsWRKY12響應(yīng)砷(As)脅迫。在Cd脅迫下，東南景天根、莖、葉中SaWRKY7基因的表達(dá)量顯著上調(diào)[17]。AtWRKY47[18]和ThWRKY7[19]基因的過表達(dá)會(huì)增強(qiáng)擬南芥對(duì)Cd的耐受性，相反AtWRKY12[20]基因的過表達(dá)會(huì)增強(qiáng)擬南芥對(duì)Cd的敏感性。但是近年來關(guān)于WRKY轉(zhuǎn)錄因子在重金屬脅迫方面的研究都集中在模式植物上，關(guān)于園藝作物番茄的研究卻較少。

番茄(SolanumlycopersicumL.)作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于植物防御生物和非生物脅迫的研究上[21]。Huang等[22]在番茄中確定了81個(gè)SlWRKY基因，并根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)將其分成了3個(gè)組。現(xiàn)已經(jīng)有學(xué)者確定WRKY6轉(zhuǎn)錄因子在抵抗非生物脅迫中的功能，例如在擬南芥中AtWRKY6負(fù)調(diào)控磷酸鹽運(yùn)輸[23]，還可以通過直接下調(diào)RAV1的表達(dá)，在ABA轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)中發(fā)揮重要作用[24]，水稻中OsWRKY6異源表達(dá)使水稻的抗病能力增強(qiáng)[25]。然而WRKY6轉(zhuǎn)錄因子在重金屬脅迫方面的研究鮮有報(bào)道。本研究以番茄為試驗(yàn)材料，克隆出番茄SlWRKY6基因并對(duì)其核酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究在不同組織中和經(jīng)過重金屬脅迫處理后該基因的表達(dá)情況，進(jìn)一步分析SlWRKY6基因在番茄抵抗重金屬脅迫過程中的功能，旨在為深入研究SlWRKY6基因在番茄抵抗重金屬脅迫過程中的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及重金屬脅迫處理

本研究所用材料為黑龍江地方常規(guī)番茄品種紅羅成。使用草炭土將番茄培育至五葉期后，取其幼根、老根、幼莖、老莖、幼葉、老葉組織，迅速轉(zhuǎn)入液氮中冷凍處理，隨后保存至-80 ℃中用于后續(xù)基因克隆。將生長(zhǎng)狀況良好的五葉期的番茄幼苗，先用1% Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)1 d，隨后進(jìn)行重金屬脅迫處理，處理組分別為：50，100 μmol/L CdCl2；200，400 μmol/L CuCl2；600，800 μmol/L HgSO4，均以1% Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的水溶液作為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，在0，3，6，12 h時(shí)取材，各處理均混合收取10株番茄幼苗的根和第3，4片真葉，用濾紙吸干水分后轉(zhuǎn)入液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 SlWRKY6基因克隆

根據(jù)從NCBI中GenBank在線網(wǎng)站下載的番茄WRKY6基因序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，送上海生工公司合成。提取番茄葉片RNA(康為世紀(jì)公司，植物總RNA提取試劑盒)，反轉(zhuǎn)錄為cDNA(TaKaRa，ReverTra Ace qPCR RT Kit)。以番茄cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得WRKY6基因PCR產(chǎn)物。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 μL，dNTPs 5 μL，MgSO43 μL，KOD-Plus-Neo 1 μL，上下游引物1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 33 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min 30 s 35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min，-20 ℃保存。通過1%瓊脂糖凝膠電泳將其分離，純化PCR產(chǎn)物(康為世紀(jì)公司，OMEGA Gel Extraction kit)后用KpnⅠ 和BamH Ⅰ 酶切，使用T4連接酶將其與pCAMBIA2300載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DHα5感受態(tài)，37 ℃培養(yǎng)12 h，菌落PCR鑒定后，挑陽性菌落搖菌，提取質(zhì)粒(康為世紀(jì)公司，PurePlasmid Mini Kit)，雙酶切進(jìn)一步驗(yàn)證后送往上海生工公司測(cè)序。

1.3 SlWRKY6基因生物信息學(xué)分析

從NCBI網(wǎng)站中獲得SlWRKY6基因的堿基序列和氨基酸序列信息，使用在線分析工具ORFinder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)對(duì)SlWRKY6基因進(jìn)行開放閱讀框(ORF)預(yù)測(cè)，使用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列預(yù)測(cè)；使用Expasy(https：//web.expasy.org/)在線網(wǎng)站分析SlWRKY6蛋白的理化性質(zhì)和親/疏水性；使用Blast(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線分析工具查找同源序列，使用ClustalX對(duì)其氨基酸同源序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，并使用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹；使用Phytozome(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)查找SlWRKY6啟動(dòng)子序列，導(dǎo)入PlantCARE(https：//phytozome.jgi.doe.gov/)中，分析與非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件。

1.4 SlWRKY6基因表達(dá)模式分析

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI7500)，以番茄β-Actin基因?yàn)閮?nèi)參，檢測(cè)番茄的各組織以及重金屬脅迫處理下SlWRKY6基因的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系(25 μL)：2×UltraSYBR Mixture(Low ROX)12.5 μL，上下游引物1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。所用特異性引物及內(nèi)參引物見表1。反應(yīng)程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，94 ℃ 2 min。每個(gè)處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)，以0 h表達(dá)量為對(duì)照，相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。使用Excel 2010作圖，IBM SPSS Statistics V25.0軟件中配對(duì)樣本T檢驗(yàn)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1 PCR 特異性引物Tab.1 PCR specific primer

2 結(jié)果與分析

2.1 SlWRKY6基因克隆及生物信息學(xué)分析

2.1.1SlWRKY6基因克隆及序列分析 以番茄的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增后連接到pCAMBIA2300載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，選取PCR鑒定出的陽性菌提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定。經(jīng)測(cè)序后結(jié)果顯示，基因編碼區(qū)片段大小為1 342 bp，編碼447個(gè)氨基酸(圖1)。使用NCBI網(wǎng)站的ORF finder查找分析，SlWRKY6基因序列的編碼區(qū)最大的開放閱讀框?yàn)? 185 bp，編碼394個(gè)氨基酸。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)(圖2)結(jié)果顯示，SlWRKY6蛋白在296-352位堿基處具有WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族所具備的典型的WRKY結(jié)構(gòu)，鋅指結(jié)構(gòu)模式為C2H2，因此，判斷SlWRKY6屬于番茄WRKY家族的Group Ⅱ亞家族的成員。

2.1.2 SlWRKY6蛋白的理化性質(zhì)及親疏水性分析 ProtParam分析顯示，SlWRKY6蛋白分子式為C2071H3330N614O676S27，相對(duì)分子質(zhì)量為48.512 55 ku，等電點(diǎn)為8.13；理論推導(dǎo)其不穩(wěn)定參數(shù)為44.50，屬于不穩(wěn)定蛋白，該蛋白中的氨基種類含量最多的為絲氨酸(Ser)，帶負(fù)電荷的殘基總和(Asp+Glu)為47，帶正電荷的殘基總和(Arg+Lys)為49，蛋白的脂肪系數(shù)為63.39，親水平均數(shù)為-0.616，預(yù)測(cè)該蛋白為親水性蛋白。

2.1.3 SlWRKY6蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用SPOMA對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列的二維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋(Alpha helix)、β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)、延伸鏈(Extended strand)和無規(guī)卷曲(Random coil)，其中無規(guī)則卷曲是該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中最多的結(jié)構(gòu)元件，α-螺旋和延伸鏈則分散地分布在蛋白質(zhì)中；根據(jù)PredictProtein網(wǎng)站得到的結(jié)果可知無規(guī)則卷曲占48.14%，α-螺旋占16.13%，延伸鏈占26.05%，β-轉(zhuǎn)角占9.68%，可見無規(guī)則卷曲是SlWRKY6最主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3)。

2.1.4SlWRKY6基因進(jìn)化分析 通過Blast查找SlWRKY6的同源氨基酸序列，ClustaX進(jìn)行序列比對(duì)分析并使用MEGA構(gòu)建進(jìn)化樹(圖4)，結(jié)果表明，番茄SlWRKY6與辣椒(Capsicumannuum)、煙草(Nicotianatomentosiformis)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)等物種中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子序列相似性在78.53%～99.37%，并與番茄SpWRKY31聚成一類，可信度達(dá)到99%，說明SlWRKY6與SpWRKY31在進(jìn)化上親緣關(guān)系最近。番茄SlWRKY6的氨基酸序列與以上物種氨基酸序列多重比對(duì)分析表明(圖5)，它們具有共同的WRKYGQK結(jié)構(gòu)域和C2H2型的鋅指結(jié)構(gòu)，說明SlWRKY6氨基酸序列具有高度保守性。

2.1.5SlWRKY6啟動(dòng)子順式作用元件分析 為了研究SlWRKY6基因表達(dá)及調(diào)控機(jī)制，使用PlantCARE分析該基因起始密碼子ATG上游2 000 bp序列的非生物脅迫相關(guān)順式作用元件。結(jié)果顯示(表2)，SlWRKY6啟動(dòng)子中存在著許多與逆境脅迫有關(guān)的順式作用元件，如AT1-motif、Box 4、G-box等光響應(yīng)元件；響應(yīng)脫落酸的元件ABRE；響應(yīng)茉莉酸甲酯的調(diào)控元件CGTCA-motif等。還有厭氧調(diào)節(jié)元件和低溫響應(yīng)元件，如ARE和GC-motif是調(diào)節(jié)厭氧感應(yīng)的順勢(shì)作用元件；LTR是低溫響應(yīng)元件。此外，還包括TC-rich repeats(逆境脅迫響應(yīng)元件)、RY-element(種子特異性調(diào)控元件)等。預(yù)測(cè)SlWRKY6基因在植物抵抗逆境脅迫過程中起到一定的作用。

表2 SlWRKY6啟動(dòng)子順式作用元件Tab.2 Cis-acting elements of SlWRKY6 promoter

表2(續(xù))

2.2 SlWRKY6基因表達(dá)模式分析

2.2.1SlWRKY6基因在不同組織中的表達(dá)SlWRKY6基因在番茄不同組織中的表達(dá)結(jié)果顯示(圖6)，SlWRKY6基因在番茄不同組織中的表達(dá)量依次為：老葉>老根>幼根>老莖>幼莖>幼葉，在幼葉、幼莖、老莖中的表達(dá)量沒有顯著差異，說明SlWRKY6基因在番茄中的表達(dá)具有空間特異性。

2.2.2SlWRKY6基因在重金屬脅迫下的表達(dá) 不同種類的重金屬處理下，SlWRKY6基因在番茄的根和葉中均有不同程度的響應(yīng)(圖7)。CdCl2脅迫，50，100 μmol/L處理番茄根中SlWRKY6基因相對(duì)表達(dá)量在3，6，12 h時(shí)均顯著上調(diào)，且均于6 h時(shí)達(dá)到最大值，約是0 h的88，130倍，且在6～12 hSlWRKY6基因表達(dá)均表現(xiàn)為劑量效應(yīng)；葉中SlWRKY6基因相對(duì)表達(dá)量在50 μmol/L處理僅在12 h時(shí)較0 h顯著上調(diào)，而在100 μmol/L處理各時(shí)間的表達(dá)差異均未達(dá)顯著水平。

CuCl2脅迫下，番茄葉和根中SlWRKY6基因表達(dá)量顯著上調(diào)，葉中SlWRKY6基因表達(dá)量隨時(shí)間呈先升高后降低的趨勢(shì)，在3 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值，且SlWRKY6基因表達(dá)量在200 μmol/L CuCl2處理是400 μmol/L CuCl2處理的1.6倍；番茄根中SlWRKY6基因相對(duì)表達(dá)量在200 μmol/L CuCl2處理隨時(shí)間呈升-降-升的趨勢(shì)，而在400 μmol/L CuCl2處理則呈先升后將的趨勢(shì)，分別于12，6 h達(dá)到最大值，約是0 h的134，34倍，且SlWRKY6基因相對(duì)表達(dá)量在3，6，12 h時(shí)均表現(xiàn)為200 μmol/L CuCl2處理高于400 μmol/L CuCl2處理，前者分別是后者的2.5，1.8，9.6倍。HgSO4脅迫，葉中SlWRKY6基因相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)，其中在600 μmol/L處理隨時(shí)間呈先升后降的趨勢(shì)且在3 h時(shí)達(dá)到最大值，約是0 h的7.6倍，而在800 μmol/L處理則隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)于12 h時(shí)達(dá)到最大值，約是0 h的6.8倍；根中SlWRKY6基因相對(duì)表達(dá)量在600 μmol/L HgSO4處理隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)且在6，12 h時(shí)顯著上調(diào)表達(dá)，于12 h時(shí)達(dá)到最大值，約是0 h的9倍，800 μmol/L HgSO4處理SlWRKY6基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)且隨時(shí)間呈先升后降的趨勢(shì)，于3 h時(shí)達(dá)到最大值，約是0 h的7.7倍；番茄葉中SlWRKY6基因表達(dá)水平在3，6 h時(shí)表現(xiàn)為600 μmol/L高于800 μmol/L處理，而在12 h時(shí)表現(xiàn)為600 μmol/L低于800 μmol/L處理，而在根中則相反。

3 討論

在重金屬脅迫下，植物體對(duì)所需離子的吸收、運(yùn)輸、滲透和調(diào)節(jié)等過程會(huì)受到影響，從而導(dǎo)致離子穩(wěn)態(tài)被破壞，造成植物體內(nèi)代謝紊亂[26]。而WRKY基因家族作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)來發(fā)揮作用，從而確保細(xì)胞對(duì)內(nèi)外部的刺激做出適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)。本研究從番茄中克隆了SlWRKY6基因的cDNA序列，并對(duì)其cDNA序列和啟動(dòng)子序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和表達(dá)特性研究。通過在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)及構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，番茄SlWRKY6與番茄SpWRKY31親緣關(guān)系最近。并且發(fā)現(xiàn)SlWRKY6蛋白含有1個(gè)WRKYGQK保守基序，鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型，判定該基因是WRKY轉(zhuǎn)錄家族的Group Ⅱ亞家族成員，與Huang等[22]、Eulgem等[27]分析結(jié)果一致。Huang等[28]通過系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)番茄中的WRKY轉(zhuǎn)錄家族Group Ⅱ共包括52個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，其中大部分轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫中起作用。陳青奇等[29]研究發(fā)現(xiàn)，SlWRKY50下調(diào)表達(dá)后會(huì)導(dǎo)致植物耐低溫的能力下降。SlWRKY23的過表達(dá)會(huì)提高番茄的耐鹽能力[30]。SlWRKY39基因通過激活發(fā)病相關(guān)基因和脅迫相關(guān)基因的表達(dá)來增強(qiáng)番茄抵抗生物和非生物脅迫的能力[31]。通過對(duì)SlWRKY6基因啟動(dòng)子順勢(shì)作用元件分析可以看出，該基因啟動(dòng)子中包括光、激素、低溫等逆境響應(yīng)元件。除此之外還存在參與防御和應(yīng)激反應(yīng)元件，推測(cè)在重金屬脅迫下，該元件會(huì)發(fā)揮防御和應(yīng)激作用。

本研究表明，SlWRKY6基因在番茄的根莖葉中均有不同程度的表達(dá)，老葉中SlWRKY6基因的相對(duì)表達(dá)量最高，老根次之，與楊明澤[32]、Robatzek等[33]、劉震[34]的研究結(jié)果一致，WRKY6基因在植物衰老器官中的表達(dá)量會(huì)顯著上調(diào)，推測(cè)SlWRKY6基因可能主要在衰老葉中發(fā)揮作用。近年來有許多研究發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子受重金屬脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，AtWRKY13[35]在Cd脅迫下上調(diào)表達(dá)，AtWRKY12[20]在Cd脅迫下轉(zhuǎn)錄水平受到抑制。本研究通過測(cè)定SlWRKY6基因在不同濃度重金屬處理下的表達(dá)水平可知，在CdCl2脅迫下，SlWRKY6基因上調(diào)表達(dá)，并且根中SlWRKY6基因受CdCl2誘導(dǎo)程度遠(yuǎn)高于葉，與彭喜旭等[36]、王影等[17]研究結(jié)果一致，Cd脅迫下水稻OsWRKY15和東南景天SaWRKY7在根部的受誘導(dǎo)程度都明顯高于葉片。研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CuCl2脅迫濃度升高時(shí)，番茄根和葉中SlWRKY6基因表達(dá)水平出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，并且該基因在根中的相對(duì)表達(dá)量要高于葉片。Liu等[37]研究發(fā)現(xiàn)，水稻根中OSLAC基因的表達(dá)水平也隨著Cu2+濃度的增加而降低。過量的Cu會(huì)加速植物體內(nèi)活性氧的積累，破壞氧化還原平衡導(dǎo)致植物體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)[38]。所以在200 μmol/L CuCl2脅迫下，該基因響應(yīng)CuCl2脅迫誘導(dǎo)程度最高，并推測(cè)SlWRKY6基因可能在番茄根系響應(yīng)銅脅迫中起重要作用。劉震[34]在研究番茄SpWRKY6基因的功能時(shí)也發(fā)現(xiàn)該基因響應(yīng)HgCl2脅迫。HgSO4脅迫下番茄根中SlWRKY6基因相對(duì)表達(dá)量沒有CdCl2和CuCl2脅迫下高，推測(cè)與重金屬脅迫種類有關(guān)。在600 μmol/L HgSO4脅迫下，葉中SlWRKY6基因相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間增加顯著下調(diào)表達(dá)，根中該基因表達(dá)水平隨著時(shí)間延長(zhǎng)顯著上調(diào)。而在800 μmol/L HgSO4脅迫下SlWRKY6基因表達(dá)水平與600 μmol/L HgSO4脅迫下呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，Ding等[39]研究發(fā)現(xiàn)，根系比葉片更容易吸收Hg2+，并且Hg脅迫會(huì)改變植物根系中的抗性蛋白發(fā)生變化。推測(cè)在HgSO4脅迫激發(fā)了番茄根系中抗性蛋白的活性，導(dǎo)致番茄根和葉中SlWRKY6相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)差異，并且Hg脅迫下根中該基因相對(duì)基因表達(dá)量低于另外2種重金屬。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，SlWRKY6基因在番茄體內(nèi)的表達(dá)具有組織表達(dá)特異性，并且能夠響應(yīng)CdCl2、CuCl2、HgSO4的誘導(dǎo)，推測(cè)該基因在番茄抵抗重金屬脅迫中扮演重要的角色。本研究為番茄抵抗重金屬脅迫提供了新的候選基因。