程 潛，官 梅，張振乾，常 濤，譚 敏，官春云

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

隨著人們生活質(zhì)量的提高和對食品營養(yǎng)保健功能認(rèn)識的加強(qiáng)，我國食用植物油的需求不斷增加[1]，油菜是我國重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物之一，菜籽油不僅富含人體所必需的氨基酸和脂肪酸，而且能較長時間地儲存[2]，為了更好地滿足廣大人民對優(yōu)質(zhì)食用植物油的需求，菜籽油品質(zhì)改良已成為當(dāng)前油菜育種領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

菜籽油的主要成分是脂肪酸，油脂的優(yōu)劣由脂肪酸決定，而油脂脂肪酸的好壞則主要取決于其碳?xì)滏滐柡统潭?。脂肪酸根?jù)碳?xì)滏滐柡团c不飽和分為3類：飽和脂肪酸(主要有棕櫚酸、硬脂酸等)、單不飽和脂肪酸(油酸、芥酸等)和多不飽和脂肪酸(亞油酸、亞麻酸等)[1]，有研究表明，預(yù)防冠心病的指導(dǎo)方針集中在將飲食中的飽和脂肪和反式脂肪轉(zhuǎn)變?yōu)椴伙柡椭綶3]，飽和脂肪酸熔點(diǎn)較高，易凝固在血管壁上，從而導(dǎo)致高血壓和動脈粥樣硬化，且飽和脂肪酸還導(dǎo)致血膽固醇濃度上升[4]，不飽和脂肪酸熔點(diǎn)較低，容易被人體吸收。

本研究以湖南省水稻油菜抗病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期對高亞麻酸甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)近等基因系進(jìn)行的miRNA測序結(jié)果為基礎(chǔ)，篩選到的與脂肪酸代謝相關(guān)的bna-miR396及其靶基因乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(Acetyltransferase gene，AT)[5]。研究表明，AT通過催化乙?；鶊F(tuán)從乙酰輔酶A(乙酰CoA，Acetyl-CoA)轉(zhuǎn)移到其作用底物芳香胺及雜環(huán)胺類物質(zhì)上，參與脂肪酸轉(zhuǎn)化與降解，AT缺失會推遲植物開花時間并降低育性[6-7]。利用同源基因克隆，得到AT基因的2個拷貝，分別構(gòu)建過表達(dá)載體與干擾載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，分析轉(zhuǎn)基因擬南芥后代種子脂肪酸組成，探究該基因在脂肪酸合成過程的功能，以期促進(jìn)甘藍(lán)型油菜脂肪酸合成分子機(jī)理研究。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

高亞麻酸甘藍(lán)型油菜近等基因系(低亞麻酸株系575，亞麻酸含量為5.1%；高亞麻酸株系574，亞麻酸含量9.8%)，野生型擬南芥(WT)由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家油料改良中心提供。大腸桿菌感受態(tài)DH5α，限制性內(nèi)切酶、dNTP、T4DNA Ligation Kit購自北京擎科生物科技有限公司；pMD18-T載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；pCambia1300-35s-N1、pCambia1300-RNAi載體購于上?？殿伾锟萍加邢薰?；本試驗(yàn)中所用到的引物均由北京擎科合成。

1.2 AT基因克隆

利用TAIR(https：//www.arabidopsis.org)和Brassica Database(http：//brassicadb.org/brad/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)AT基因有2個拷貝，分別在A基因組和C基因組，并以此序列(GSBRNA2T00114025001、GSBRNA2T00148464001)進(jìn)行后續(xù)引物設(shè)計(jì)(表1)，其中5′端酶切位點(diǎn)前的序列用于重組連接。

采用TransZol UP植物總RNA提取試劑盒(北京全式金)提取低亞麻酸甘藍(lán)型油菜株系575自交授粉后20～35 d混合種子總RNA，并用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金)合成cDNA第一鏈，以此為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系包含KOD-FX聚合酶 1 μL，2×PCR Buffer 25 μL，dNTP(2.5 μmol/L) 10 μL，正反向引物各0.2 μmol/L，cDNA小于500 ng，用ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件為98 ℃ 2 min預(yù)變性；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，35個循環(huán)；68 ℃ 7 min延伸。

經(jīng)PCR純化回收后，與pMD18-T載體相連，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，由北京擎科公司進(jìn)行測序。

表1 與脂肪酸代謝相關(guān)的miRNA及其靶基因Tab.1 miRNA and its target genes related to fatty acid metabolism

1.3 生物信息學(xué)分析

用SnapGene 3.2.1將克隆到的靶基因序列翻譯成氨基酸，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫BlastP進(jìn)行鑒定后，登錄ExPASy-ProtParam tool網(wǎng)站，預(yù)測對應(yīng)蛋白的一級結(jié)構(gòu)，包括氨基酸組成、理化性質(zhì)等；分別登錄PredictProtein、SOPMA、TMHMM網(wǎng)站進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測、結(jié)構(gòu)預(yù)測、跨膜螺旋區(qū)分析；通過SWISS-MODEL構(gòu)建蛋白三級結(jié)構(gòu)模型。

1.4 AT基因干擾片段的擴(kuò)增

根據(jù)甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫獲得AT基因全長序列，選擇長度為300 bp特異序列設(shè)計(jì)引物(表2)，以合成的cDNA為模板進(jìn)行高保真擴(kuò)增，反應(yīng)體系與1.2克隆體系相同，反應(yīng)條件為98 ℃ 2 min預(yù)變性；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，35個循環(huán)；68 ℃ 7 min延伸。經(jīng)PCR純化回收后，與pMD18-T載體相連，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，由北京擎科公司進(jìn)行測序。

表2 RNAi干擾引物Tab.2 RNAi interference primers

1.5 過表達(dá)載體與RNAi干擾載體構(gòu)建

用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切pCambia1300-35s-N1載體，膠回收，產(chǎn)物進(jìn)行體外同源重組反應(yīng)，獲得重組質(zhì)粒。

用XbaⅠ及BamHⅠ雙酶切pCambia1300-RNAi載體以及各個基因的RNAi片段的PCR產(chǎn)物，具體方法參考劉芳等[8]，并進(jìn)行改進(jìn)，膠回收后進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒。測序檢驗(yàn)正確后，用PstⅠ和SalⅠ雙酶切重組質(zhì)粒及各個基因的RNAi片段的PCR產(chǎn)物，再次進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，獲得最終的RNAi載體。

將構(gòu)建好的過表達(dá)載體與RNAi干擾載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，以野生型擬南芥為受體，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，獲得T0種子；用潮霉素篩選T0擬南芥陽性苗并種植，之后，用PCR鑒定轉(zhuǎn)基因苗，收取得到T1種子。

1.6 脂肪酸成分測定

采用SP-6890型氣相色譜儀、FID檢測器、N3000色譜工作站、毛細(xì)管色譜柱DB-23對轉(zhuǎn)基因擬南芥T1種子進(jìn)行脂肪酸成分測定[9]，對7個主要的脂肪酸成分進(jìn)行分析，測定時取5個轉(zhuǎn)基因后代株系，每個材料檢測約30粒種子。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶基因與特異干擾片段克隆及檢測結(jié)果

以低亞麻酸甘藍(lán)型油菜20～35 d自交種cDNA為模板，高保真擴(kuò)增了乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的2個拷貝，大小均為1 350 bp。分別對2個靶基因特異片段進(jìn)行PCR高保真擴(kuò)增，得到了目的片段長度大小的DNA片段。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析 以SnapGene 3.2.1分別對AT基因翻譯出來的氨基酸序列，通過ExPASy-ProtParam tool進(jìn)行理化性質(zhì)分析表明(表3)，AT基因的2個拷貝114與148氨基酸均為449個，分子量約50.5 ku，114編碼的氨基酸偏中性而148編碼的蛋白偏堿性。不穩(wěn)定系數(shù)顯示114與148均為穩(wěn)定蛋白，且親水性較差，屬于脂溶性蛋白。

表3 AT基因編碼蛋白一級結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)分析Tab.3 Analysis of the physical and chemical properties of the primary structure of the protein encoded by the AT gene

2.2.2 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析 通過在線PredictProtein軟件對AT基因不同拷貝編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)2個蛋白均定位在細(xì)胞質(zhì)；TMHMM跨膜螺旋區(qū)分析表明，2個蛋白均為膜外蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)。SOPMA結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，AT蛋白中，無規(guī)則卷曲占比最高，均在43%左右，其次為α-螺旋，約占35%，延伸鏈約占18%，β-轉(zhuǎn)角約占4%，兩蛋白有一定差異(表4)。

2.2.3 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析 經(jīng)SWISS-MODEL同源建模發(fā)現(xiàn)，114、148均適應(yīng)酰基轉(zhuǎn)移酶模型，但其構(gòu)象略不同(圖1，2)。

表4 AT蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測
Tab.4 Prediction of secondary structure of AT proteins

%

2.3 過表達(dá)與RNAi干擾重組質(zhì)粒圖譜

AT基因的2個拷貝114與148過表達(dá)重組質(zhì)粒見圖3-A。AT基因的2個拷貝114與148RNAi重組質(zhì)粒見圖3-B。

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥檢測

經(jīng)潮霉素篩選T0轉(zhuǎn)基因擬南芥種子后(圖4)，對T1進(jìn)行pCambia1300-35s-114、pCambia1300-RNAi-114、pCambia1300-35s-148及pCambia1300-RNAi-148載體潮霉素鑒定，結(jié)果表明(圖5),目的質(zhì)粒T-DNA均已插入擬南芥基因組，表明擬南芥轉(zhuǎn)基因成功。

2.5 轉(zhuǎn)基因株系種子中脂肪酸成分分析

2.5.1 轉(zhuǎn)114基因T1種子脂肪酸成分分析 分別收集野生型擬南芥(對照)、114基因過表達(dá)(35s-114)與RNAi干擾(114R)轉(zhuǎn)基因T1種子，烘干后用氣相色譜儀測定各脂肪酸含量，用Excel 2019單因素方差分析法分析各個脂肪酸成分，結(jié)果見表5。

表5 轉(zhuǎn)114基因T1種子脂肪酸成分分析Tab.5 Fatty acid composition analysis of T1 seeds of trans 114 genes

由表5可知，與野生型擬南芥種子脂肪酸各成分相比，干擾114基因(114R)表達(dá)會導(dǎo)致硬脂酸和油酸含量極顯著的增加，增加幅度分別為10.25%,38.33%，而軟脂酸和亞麻酸是極顯著的減少，減少幅度分別為10.57%,17.90%，顯著減少亞油酸的含量，花生烯酸的含量也有減少，但是差異不顯著；過表達(dá)114基因(35s-114)會導(dǎo)致軟脂酸、油酸和亞油酸含量的顯著增加，增加幅度分別達(dá)到15.52%，37.88%,12.33%，而硬脂酸、亞麻酸和花生烯酸含量達(dá)到極顯著的減少，幅度分別為50.22%，10.86%，29.93%。

在對飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸分析中，干擾114基因會使飽和脂肪酸含量下降，對不飽和脂肪酸無顯著影響；過表達(dá)114基因會增加不飽和脂肪酸的含量，而對飽和脂肪酸無顯著影響。

2.5.2 轉(zhuǎn)148基因T1種子脂肪酸成分分析 分別收集野生型擬南芥(對照)、148基因過表達(dá)(35s-148)與RNAi干擾(148R)轉(zhuǎn)基因T1種子，烘干后用氣相色譜儀測定各脂肪酸含量，用Excel 2019單因素方差分析法分析各個脂肪酸成分，結(jié)果見表6。

由表6可知，與野生型擬南芥種子脂肪酸各成分相比，干擾148基因(148R)會導(dǎo)致油酸含量增加，幅度為31.19%，而軟脂酸、亞麻酸會極顯著減少，而花生烯酸含量顯著減少，減少幅度分別為5.46%，18.68%，13.16%，并使硬脂酸增加，亞油酸和芥酸減少，但是增減幅度沒有達(dá)到顯著水平，干擾148基因還會導(dǎo)致芥酸含量增加；過表達(dá)148基因(35s-148)會導(dǎo)致軟脂酸、油酸、亞油酸含量的極顯著增加，其增加幅度分別為23.50%，45.12%,14.03%，而硬脂酸、亞麻酸和花生烯酸的含量與野生型擬南芥相比，都有極顯著的下降。

在對飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸分析中，干擾148基因會使飽和脂肪酸含量下降，對不飽和脂肪酸無顯著影響；過表達(dá)148基因會顯著增加不飽和脂肪酸的含量，而對飽和脂肪酸無顯著影響。

2.5.3 對具有相同變化趨勢的脂肪酸成分進(jìn)行分析 結(jié)合表5，6，選取在2個拷貝基因的過表達(dá)與干擾體系中，脂肪酸成分具有相同變化趨勢的油酸、亞麻酸、花生烯酸和芥酸，并進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表7。

表7 過表達(dá)與干擾體系間方差分析Tab.7 Analysis of variance between overexpression and interference systems

結(jié)果顯示，過表達(dá)114基因會導(dǎo)致花生烯酸極顯著的下降，而對其他脂肪酸含量無顯著影響；干擾148基因會導(dǎo)致芥酸含量的極顯著增加，而對其他脂肪酸成分無顯著影響。

3 討論與結(jié)論

棕櫚酸是游離脂肪酸中最主要的飽和脂肪酸，能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞、骨骼肌和心肌細(xì)胞等發(fā)生胰島素抵抗[10-12]，硬脂酸是自然界廣泛存在的一種脂肪酸，在動物脂肪中的含量較高，植物油中含量較少，主要應(yīng)用于橡膠和化妝品工業(yè)，人若長期微量攝入可能會刺激眼睛、呼吸系統(tǒng)。油酸是人體最易消化吸收的脂肪酸，高油酸具有降低人體血液中有害的低密度脂，同時可減少血漿中脂蛋白膽固醇含量[13]，有效的預(yù)防及治療動脈的硬化[14]。亞油酸是一種人體必需脂肪酸，在機(jī)體內(nèi)含量極為豐富，具有降血脂、降血壓、防止動脈硬化，還參與了人體物質(zhì)循環(huán)和免疫調(diào)節(jié)[15]。α-亞麻酸是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的前體物質(zhì)，EPA和DHA在視網(wǎng)膜和大腦的結(jié)構(gòu)膜中也起重要作用[16-17]，亞麻酸還具有抗動脈粥樣硬化、預(yù)防心腦血管疾病及減肥、降血脂等生理功能[16，18]?；ㄉ南┧峋哂性黾友軓椥?、酯化膽固醇，調(diào)節(jié)血細(xì)胞功能等一系列生理活性，對預(yù)防心血管疾病、糖尿病和腫瘤等具有重要功效[19]。花生四烯酸及其代謝產(chǎn)物還參與了人體造血和免疫調(diào)節(jié)[20]，花生四烯酸降低血液中膽固醇的效果是亞油酸和亞麻酸的4倍，其降低血液中血脂和血壓的能力也要強(qiáng)于亞油酸和亞麻酸[21-22]。芥酸在人體內(nèi)不易被消化吸收，而且芥酸凝固點(diǎn)高，不適于食品加工[23]。高芥酸的油菜籽餅粕需經(jīng)過脫毒處理才能用作動物飼料，因此，降低芥酸含量是油菜食用目的脂肪酸改良的首要任務(wù)[24]。

在西方飲食中，棕櫚酸(C16∶0)和硬脂酸(C18∶0)是最常食用得飽和脂肪酸[25]。一般認(rèn)為棕櫚酸比硬脂酸更能提高膽固醇[26-28]，世界衛(wèi)生組織(WHO)與聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)曾建議食用油中飽和脂肪酸∶單不飽和脂肪酸∶多不飽和脂肪酸=1∶1∶1[29]。熊秋芳等[1]分析認(rèn)為，在亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于5%的前提下，飽和脂肪酸含量越低、油酸含量越高、且ω-6與ω-3比例為1～4∶1的天然食用植物油品最具營養(yǎng)價(jià)值。

擬南芥作為模式植物，并與甘藍(lán)型油菜同屬于蕓薹屬十字花科且有著共同的原始祖先，開展擬南芥研究可為甘藍(lán)型油菜研究提供重要參考與借鑒[30-31]。

本研究對克隆得到的AT基因的2個拷貝進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)114與148同屬于?；D(zhuǎn)移酶模型，但其構(gòu)象略有不同，推測其在甘藍(lán)型油菜中發(fā)生了序列變異，將進(jìn)一步研究；脂肪酸組成分析表明，乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的這2個拷貝在飽和脂肪酸的代謝過程中具有相同的功能，過表達(dá)114基因與148基因均會導(dǎo)致軟脂酸含量的增加，硬脂酸含量的減少，干擾114基因與148基因均會導(dǎo)致軟脂酸含量的減少，硬脂酸含量增加，表明在軟脂酸向硬脂酸合成過程中發(fā)揮抑制作用，抑制這2個拷貝表達(dá)，可以促進(jìn)軟脂酸向硬脂酸轉(zhuǎn)化；這2個拷貝在不飽和脂肪酸代謝過程中存在差異，過表達(dá)114基因和148基因均會引起亞油酸含量的增加，而通過分析其他幾個具有相同變化趨勢的脂肪酸成分后，發(fā)現(xiàn)可以通過過表達(dá)114基因，可以使花生烯酸含量顯著下降，干擾148基因的表達(dá)會導(dǎo)致芥酸含量的增加。這2個拷貝可以促進(jìn)菜籽油品質(zhì)改良。

本研究以前期對高亞麻酸油菜近等基因系材料miRNA測序結(jié)果為基礎(chǔ)，同源克隆獲得了AT基因的2個拷貝114與148(均為1 350 bp)，分別構(gòu)建了這2個基因的過表達(dá)載體和RNAi干擾載體并成功轉(zhuǎn)化擬南芥。生物信息學(xué)分析表明，114編碼的蛋白偏中性而148編碼的蛋白偏堿性，114與148均為穩(wěn)定蛋白，親水性差，屬于脂溶性蛋白，且定位在細(xì)胞質(zhì)，無跨膜結(jié)構(gòu)。114基因與148基因在脂肪酸代謝途徑中，抑制軟脂酸向硬脂酸轉(zhuǎn)化。過表達(dá)114基因和與148基因可以提高不飽和脂肪酸含量，抑制這2個拷貝基因會導(dǎo)致飽和脂肪酸含量的增加；過表達(dá)114基因可以顯著增加軟脂酸、油酸和亞油酸的含量，并減少硬脂酸、亞麻酸和花生烯酸的含量，干擾114基因的表達(dá)可以增加硬脂酸和油酸的含量，減少軟脂酸、亞油酸和亞麻酸的含量；過表達(dá)148基因可以增加軟脂酸、油酸和亞油酸的含量，減少硬脂酸、亞麻酸和花生烯酸的含量，而干擾148基因會導(dǎo)致油酸、花生烯酸以及芥酸含量的增加，軟脂酸、亞油酸和亞麻酸含量的減少；可以通過過表達(dá)114基因，促使花生烯酸含量的下降，干擾148基因的表達(dá)會導(dǎo)致芥酸含量的增加。因此，乙酰轉(zhuǎn)移酶基因這2個拷貝對改良甘藍(lán)型油菜脂肪酸成分作用明顯。