屠云潔，束婧婷，單艷菊，姬改革，章 明，劉一帆，巨曉軍，唐燕飛，蔣華蓮，鄒劍敏*

(1. 江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇省家禽遺傳育種重點實驗室，江蘇揚州，225125；2. 廣西富鳳農(nóng)牧集團有限公司，廣西 南寧，530024)

棕櫚脂酰肉堿轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1，CPT1)是脂肪酸β-氧化的限速酶，對脂肪的分解供能具有重要的調(diào)控作用。CPT1與機體脂肪的沉積有密切的關(guān)系，其表達水平與體脂含量相關(guān)，表達水平升高有助于增加脂肪酸分解，降低體脂肪含量[1-2]。肝亞型(CPT1A或CPTI-L)是CPT1的一種重要亞型， CPT1A定位于11q13.2，是肝臟組織細(xì)胞中長鏈脂肪酸β-氧化的限速酶和關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶[3-4]。CPT1A在淋巴瘤、食管癌和乳腺癌等多種惡性腫瘤中高表達，抑制CPT1A活性和表達的藥物具有明顯的抗腫瘤作用。CPT1A在能量代謝中具有重要作用，與心肌肥厚、糖尿病等許多代謝疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，對其深入研究將為脂代謝相關(guān)疾病的藥物治療提供新的思路[5-6]。肉雞的體脂是肉雞產(chǎn)業(yè)的主要關(guān)注點之一，肉雞生長速度和腹部脂肪沉積很快，所以肉雞可以作為研究質(zhì)代謝、腫瘤和生長發(fā)育等的模型[7-8]。研究表明，牛，羊等哺乳動物CPT1AmRNA存在不同組織差異表達性，并存在品種和個體差異[9-10]，作者前期研究發(fā)現(xiàn)CPT1A在隱性白羽雞產(chǎn)蛋高峰期(217日齡)在肝臟的表達量高于其他組織[11]，但未見CPT1AmRNA在肉雞不同發(fā)育階段的表達規(guī)律的報道。研究肉雞CPT1A基因的時空表達調(diào)控規(guī)律對于了解肉雞脂肪沉積規(guī)律和脂質(zhì)代謝調(diào)控機理具有重要意義。本研究對廣西麻雞從胚胎期到性成熟的不同發(fā)育階段CPT1A基因肝臟、心臟、胸大肌和腓腸肌mRNA表達量進行研究，以揭示CPT1A在廣西麻雞不同組織中以及同一組織不同發(fā)育階段的相對表達量，為研究CTP1A基因在調(diào)控體內(nèi)脂肪代謝過程中的作用提供一定的基礎(chǔ)資料，為研究腫瘤和代謝性疾病提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物飼養(yǎng)管理

廣西麻雞種蛋來自廣西某農(nóng)牧集團有限公司，300個廣西麻雞種蛋在江蘇省家禽科學(xué)研究孵化、出雛和飼養(yǎng)。飼養(yǎng)試驗的程序按江蘇省家禽科學(xué)研究所制定的飼養(yǎng)管理程序執(zhí)行。 管理要求按照黃羽肉雞飼養(yǎng)管理指南。小雞群公母混合，育雛舍地面平養(yǎng)。42日齡轉(zhuǎn)移到育成雞舍，42～120日齡，公母分群飼養(yǎng)地面平養(yǎng)， 公母雞之間要有要用攔網(wǎng)隔開，120日齡轉(zhuǎn)移到個體籠飼養(yǎng)。

1.2 樣品采集

每個發(fā)育階段采集廣西麻雞10個樣品，公母各5個，共采集11個時間點：9胚齡，12胚齡，16胚齡，1日齡，1、3、5、7、9、13和16周齡。屠宰后迅速采取腓腸肌、胸大肌、心臟和肝臟樣本并投入液氮中，然后置于-80 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA的提取以及cDNA的合成

利用Trizol Reagent Kit試劑盒提取胸大肌、腓腸肌、心臟和肝臟RNA，cDNA第一鏈的合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說明書進行，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20 ℃ 備用。 以提取的總RNA為模板，按照RT-PCR試劑盒 (Takara, Dalian, China) 說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為 20 μL, 其中總 RNA 2 μL，OligodT20 1 μL, AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 ( 200 U/μL) 1 μL , RNA 酶抑制劑 1 μL , dNTP Mix ( 10 mmol/L) 2 μL , 5×RT Buffer 4 μL, DEPC水9 μL。反轉(zhuǎn)錄條件42 ℃ 30 min , 99 ℃ 5 min。

1.4 引物設(shè)計

根據(jù)CTP1A和β-actin基因的mRNA序列，利用Primer 5.0 設(shè)計熒光定量PCR引物，由上海生物技術(shù)有限公司合成。

雞CPT1A基因正反向引物序列為：F:5'-GCCCTGATGCCTTCATTCAA-3'，R:5'-ATTTTCCCATGTCTCGGTAGTGA-3'，雞內(nèi)參基因β-actin基因正反向引物序列為F:5'-GTCCACCGCAAATGCTTCT-3'，R:5'-TGCGCATTTATGGGTTTTGTT-3'。CPT1A和β-actin基因PCR擴增片段大小分別為60和58 bp。

1.5 PCR反應(yīng)條件

Real time PCR擴增的反應(yīng)條件設(shè)置如下：

CPT1A：95 ℃ 預(yù)變性 20～30 s, 然后 40 個循環(huán)的95 ℃ 變性20～30s, 退火55～60 ℃ 20～30 s, 最后95 ℃ 變性10～15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 10～15 s，連續(xù)測定樣品的熒光強度以獲取溶解曲線。

β-actin：95 ℃ 預(yù)變性 20 s, 然后 40 個循環(huán)的95 ℃ 變性20～30 s, 退火56～59 ℃ 20～30 s, 最后95 ℃ 變性10～15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 10～15 s ，連續(xù)測定樣品的熒光強度以獲取溶解曲線。

1.6 mRNA定量數(shù)據(jù)分析

雞各組織樣本經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈后，分別利用CPT1A和β-actin基因各自優(yōu)化好的條件進行Real time PCR反應(yīng)，每個樣品均做3個平行管，每次反應(yīng)均設(shè)無模板對照(NTC)。以β-actin基因為內(nèi)參照，對CPT1A基因mRNA表達水平進行校正，并采用2-ΔΔ Ct法對數(shù)據(jù)進行處理，其中Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)，同一組織不同發(fā)育階段的相對表達量，是以一個發(fā)育階段基因表達量為參照，比如以3周齡Ct作為其他發(fā)育階段的參照，計算相對表達量Ct，Ct=(CtXgroup-Ct參照)，以此來比較各組以相對于3周齡組表達倍數(shù)的變化顯示CPT1A基因在不同發(fā)育階段的相對表達量。利用前面同一組織不同發(fā)育階段計算好的相對表達量，直接用SPSS 16.0的單因素方差分析中的Tukey檢驗，分析不同組織之間的相對表達量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2007和SPSS 16.0 單因素方差分析法中的Tukey檢驗進行兩兩比較統(tǒng)計分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶解曲線分析

為檢測反應(yīng)的特異性，在Real-time反應(yīng)后，進行溶解曲線分析，以確定得到的產(chǎn)物為目的產(chǎn)物。結(jié)果顯示如圖1，CPT1A和β-actin基因均只有一個特異性峰。則設(shè)計的CPT1A引物有很好的特異性，可以進行CPT1A基因定量析。

2.2 CPT1A基因在廣西麻雞不同組織和不同發(fā)育階段的時空表達特性

CPT1A在廣西麻雞心臟、肝臟、胸大肌和腓腸肌時空表達規(guī)律見表1和圖2。從表1可以看出，CPT1A在不同發(fā)育階段4種組織中表達差異性不同。在胚胎期(9、12、16胚齡)，CPT1A基因在腓腸肌的表達量顯著高于在心臟，肝臟和胸大肌的表達量(P<0.05)；1日齡和1周齡時，CPT1A在心臟的表達量顯著高于其他3種組織；3周齡時，在4種組織中的表達量差異不顯著(P>0.05)；5、7、9、13和16周齡時，CPT1A在胸大肌的表達量顯著高于其他3種組織(P<0.05)。

由圖2A可見，CPT1A在肝臟不同發(fā)育階段變化呈現(xiàn)升高降低再升高的趨勢。CPT1A在肝臟3、7和16周齡時的表達量顯著高于胚胎期(9、12、16胚齡)，在胚胎期和1日齡的幾個發(fā)育階段的表達量差異不顯著； 在1、5、7、9、13和16周齡這幾個試驗發(fā)育階段表達量差異不顯著。出雛后的各個試驗階段的表達量顯著高于胚胎期(P<0.05)。

圖1 β-actin 和CPT1A基因溶解曲線Fig. 1 CPT1A and β-actin gene dissolution curve

圖2 CPT1A在廣西麻雞不同發(fā)育階段4種組織中的相對表達量柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Fig.2 Relative expression of CPT1A in four tissues of Guangxi Partridge Chicken at different developmental stageDifferent lowercase letter above columns mean significant difference(P<0.05)

表1 CPT1A在廣西麻雞同一發(fā)育階段4種組織相對表達量Table 1 Relative expression of CPT1A in 4 tissues at the same developmental stage

由圖2B可見，CPT1A在心臟胚胎期的表達量逐漸升高，但差異不顯著，1日齡和1周齡時的相對表達量顯著高于胚胎期(P<0.05)，3周齡時的表達量顯著低于1日齡和1周齡(P<0.05)，5周齡和7周齡時的相對表達量比3周齡時的表達量顯著上升(P<0.05)，9、13和16周齡的表達量雖有先下降再升高的趨勢，但差異不顯著；CPT1A在出雛后的各個發(fā)育階段的表達量顯著高于胚胎期(P<0.05)。

由圖2C可見，CPT1A在腓腸肌不同發(fā)育階段呈現(xiàn)下降的趨勢。CPT1A在腓腸肌胚胎期和1日齡表達量顯著高于出雛后的其他各個實驗發(fā)育階段的表達量(P<0.05)，出雛后的幾個發(fā)育階段(1、3、5、7、9、13和16周齡)間的表達量差異不顯著。

由圖2D可見，CPT1A在胸大肌胚胎期到性成熟呈現(xiàn)升高的趨勢，在胚胎期，1日齡，1周齡和3周齡表達量逐漸上升，但差異不顯著，5周齡時表達量顯著上升，隨后7、9、13和16周齡的表達量有升高降低再升高再降低的趨勢，但這幾個階段的表達量差異不顯著。各個發(fā)育階段表達量差異如下：5、7、9、13和16周齡>1周齡、3周齡、1日齡、9胚齡、12胚齡、16胚齡。

3 討 論

CPT1A屬于肝臟型棕櫚脂酰肉堿轉(zhuǎn)移酶，諸多研究報道CPT1A在肝臟中表達量最高。于寶莉等研究發(fā)現(xiàn)CPT1A基因在180日齡的綿羊和山羊肝臟中表達最高，但也存在個體差異和品種差異[9]。作者前期研究發(fā)現(xiàn)CPT1A在隱性白羽雞產(chǎn)蛋高峰期(217 d)CPT1A基因在肝臟的表達量高于其他組織，且其表達量無性別差異，也無性別和組織互作的影響[11]。本研究也發(fā)現(xiàn)CPT1A在廣西麻雞公雞和母雞的不同組織中表達量差異不顯著，無性別效應(yīng)。所以只分析CTP1A在廣西麻雞不同組織不同發(fā)育階段相對表達量。CPT1A廣西麻雞肝臟胚胎期和出雛后到性成熟(16周齡)的各個實驗發(fā)育階段表達量均較低，且變化趨勢最緩慢，與其他研究結(jié)果不一致[9,11-12]，這可能與雞的日齡和品種不同有關(guān)，不同品種不同發(fā)育階段所需的能量不同。肝臟是動物脂肪代謝的主要部位，肝細(xì)胞液中的脂肪酸以及肌肉和其他組織細(xì)胞攝取的脂肪酸借助CPT-Ⅰ被轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)，經(jīng)β-氧化后生成乙酰CoA，肝臟中生成的乙酰CoA 除經(jīng)三羧酸循環(huán)產(chǎn)生ATP 供自身利用外，更多的是轉(zhuǎn)化為酮體運輸?shù)侥X等肝外組織氧化利用[12]。

本研究還開展了CPT1A基因在廣西麻雞不同組織不同發(fā)育階段的表達規(guī)律研究，CPT1A基因在胸大肌和腓腸肌的不同發(fā)育階段變化趨勢不同。

CPT1A在心臟胚胎期的表達量逐漸升高，1日齡和1周齡時的表達量顯著上升，3周齡時的表達量顯著下降，5周齡和7周齡時顯著上升，9、13和16周齡之間差異不顯著；CPT1A在胚胎期心臟表達量較低，在出雛后各個時期表達量較高，這可能由于雞出雛后雛雞運動量加大，心臟活動量加大，CPT1A對體內(nèi)脂肪酸的氧化能力增強，為心臟提供更多的能量。CPT1A在腓腸肌胚胎期和1日齡表達量顯著高于出雛后的其他各個實驗發(fā)育階段；CPT1A在胸大肌的變化趨勢最顯著，各個發(fā)育階段表達量差異如下：5、7、9、13和16周齡>1周齡、3周齡、1日齡、9胚齡、12胚齡、16胚齡。有研究證實在肥胖及糖尿病人的研究中也發(fā)現(xiàn)肌肉中CPT1基因的表達與肌纖維發(fā)育快慢和類型有密切的關(guān)系[13-14]。有研究發(fā)現(xiàn)雞胚胎期胸肌的發(fā)育均顯著慢于腿肌[15]，出雛后的雞胸肌和腿肌肌纖維發(fā)育快慢也不同[16]。在廣西麻雞胸大肌，腓腸肌，心臟和肝臟具有不同的表達模式，且不同發(fā)育階段表達量變化趨勢不同，提示不同部位組織發(fā)育的潛在分子機制可能存在差異。

4 結(jié) 論

CPT1A在廣西麻雞不同發(fā)育階段4種組織表達量不同，在胚胎期，CPT1A基因在腓腸肌的表達量顯著高于在心臟、肝臟和胸大肌、1日齡和1周齡時，CPT1A在心臟的表達量顯著高于其他3種組織； 5～16周齡時，在胸肌的表達量顯著高于其他3種組織。CPT1A基因在4種組織不同發(fā)育階段變化趨勢不同，CPT1A在肝臟各個試驗發(fā)育階段表達量均較低，且變化趨勢最緩慢。CPT1A在腓腸肌胚胎期和1日齡表達量顯著高于出雛后的其他各個發(fā)育階段；CPT1A在胸大肌的表達量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，且變化趨勢最顯著，5、7、9、13和16周齡的表達量顯著高于其他試驗階段。