武君霞,劉 澤，楊辰濤,韓 燕,柏鳳偉,李 雄,劉思春,郝慶紅,吳國江,劉月琴,郭云霞*

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001；2. 保定市畜牧工作站, 河北 保定 071051；3. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院， 河北 保定 071001)

近年來有關(guān)于超級耐藥菌的報道逐漸增多，而產(chǎn)生超級耐藥菌的主要原因在于抗生素的濫用。畜牧養(yǎng)殖中濫用抗生素導(dǎo)致畜禽體內(nèi)殘留進(jìn)而轉(zhuǎn)嫁給人類，導(dǎo)致人類耐藥菌的出現(xiàn)，致使抗生素的藥效減弱甚至無效。世界上許多國家相繼頒發(fā)了一系列法律法規(guī)，禁止或限制飼料中抗生素的使用。2006年1月，歐盟全面禁止抗生素用作飼料添加劑，提出了微生態(tài)制劑在動物營養(yǎng)中的應(yīng)用的安全性[1]。2019年，中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了第194號公告[2]，促生長藥物飼料添加劑在2020年7月1日后全部退出，綠色、環(huán)保、健康、高效的養(yǎng)殖新體系逐漸成為養(yǎng)殖業(yè)的趨勢。研究無殘留、無耐藥性的飼用添加劑如抗菌肽[3]、微生態(tài)制劑及其發(fā)酵產(chǎn)物等[4]成為新形勢下養(yǎng)殖業(yè)的焦點。目前，我國也已全面啟動和實施無毒、無公害的微生態(tài)飼料添加劑工程，這為微生態(tài)制劑替代抗生素應(yīng)用提供了廣闊的前景。

益生菌通過在動物黏膜、皮膚等表面定植或者產(chǎn)生功能性的酶，在細(xì)胞間形成生物屏障，以降低病原菌的侵染和定植[5]，同時也產(chǎn)生宿主所需的營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、維生素、微量元素、生長因子等[6]，還可通過激活巨噬細(xì)胞、增強NK細(xì)胞活性、提高細(xì)胞因子及免疫球蛋白的含量促進(jìn)特異性免疫和非特異性免疫反應(yīng)[7]。通過補充、調(diào)整和維持動物腸道微生態(tài)平衡，改善腸道菌群紊亂，從而減少細(xì)菌、病毒等引起的感染性腹瀉與非感染性腹瀉，進(jìn)而達(dá)到防病治病的目的[8]。但目前可用于不同畜種專屬的微生態(tài)制劑較少，同時市售產(chǎn)品菌種活性不穩(wěn)定，因而，篩選優(yōu)良動物源益生菌菌株，開發(fā)綠色安全飼用益生菌制劑，推動畜牧業(yè)健康、快速發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。本研究本著同源性的原則，由動物腸道中篩選出對腹瀉有明顯緩解或治療效果的益生菌，為益生菌劑在動物生產(chǎn)上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 大腸桿菌(E.coli)指示菌，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程系實驗室保存。

1.1.2 樣品 取健康羊的腸道內(nèi)容物，混合后冷藏備用。

1.1.3 試劑 0.5%的番紅水溶液、孔雀綠染色液、接觸酶試驗試劑、甲基紅試劑、乙酸鉛紙條、10%三氯化鐵水溶液、1%瓊脂糖凝膠、TAE緩沖液等。

人工胃液配制：9.5%～10.5%的鹽酸16.4 mL，加水稀釋，使pH分別達(dá)到2.0、3.0、4.0；每100 mL液體中加入1.0 g胃蛋白酶，混勻，用0.22 μm的無菌濾頭過濾待用。

人工腸液配制：取KH2PO46.8 g，加水500 mL溶解，用0.4%的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.5，加水稀釋至1 000 mL，每100 mL液體中加入1.0 g胰蛋白酶，混勻，用0.22 μm的無菌濾頭過濾待用。

1.1.4 培養(yǎng)基

1.1.4.1 細(xì)菌用培養(yǎng)基

瓊脂培養(yǎng)基(NA)：瓊脂20 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蛋白胨10 g，溶到1 000 mL蒸餾水中。調(diào)pH到7.2～7.4。

種子培養(yǎng)基(NB)：NaCl 5 g，牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，溶到1 000 mL蒸餾水中。調(diào)pH到7.2～7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基：配方同NB一樣。

1.1.4.2 生理生化試驗鑒定用培養(yǎng)基

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，選擇相近的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行V-P、M.R等生理生化試驗。生理生化試驗用培養(yǎng)基見伯杰細(xì)菌鑒定手冊(第8版)[9]。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的采集與處理 將新鮮的羊腸道用無菌剪刀從中間剖開，用無菌的載玻片刮取腸道內(nèi)含物于無菌燒杯中，再輕輕刮取腸粘膜壁一并放入燒杯，用滅菌的玻璃棒攪拌均勻后，采用五點取樣法取大約1 g左右內(nèi)容物，放入含有99 mL無菌水的試管中，37 ℃、150 r/min振搖30 min，分散菌群。取出菌樣，梯度稀釋，從中取3個稀釋梯度(10-4、10-5、10-6)的菌懸液進(jìn)行涂布，每個稀釋度涂布3個平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h，得到單菌落。挑取形態(tài)有差異的單個菌落做劃線接種，編號，置于37 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24 h。放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株的篩選

1.2.2.1 病原菌平板的制備 將大腸桿菌轉(zhuǎn)入50 mL的NB培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)過夜，得到菌懸液，然后用UV法，在λ為600 nm下測定其OD值，調(diào)整菌液OD值為0.6。吸取1 mL菌懸液轉(zhuǎn)入已冷卻至40～45 ℃的100 mL NA培養(yǎng)基中，迅速混合均勻，立即倒平板，每個平板大約15 mL，冷卻，備用。

1.2.2.2 初篩 從劃線接種的斜面上用竹簽輕輕刮取菌體，在病原菌平板上劃十字，每個病原菌平板平均分成4部分，在病原板的背面做好標(biāo)記，每個菌劃一個十字，平板上的編號要與斜面上菌的編號一一對應(yīng)。37 ℃培養(yǎng)24 h，記錄抑菌圈的大小，然后選取較大抑菌圈的菌株，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 復(fù)篩 從初篩結(jié)果中挑取抑菌圈較大較優(yōu)良的菌株進(jìn)行復(fù)篩。將挑選出的菌株轉(zhuǎn)接到NA培養(yǎng)基斜面上，置于37 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24 h活化菌株。將活化后的菌株轉(zhuǎn)接到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)18～24 h，獲得發(fā)酵液，用UV法測定其OD值。在病原菌平板上打孔，加入80 μL菌懸液，每個菌樣有3個平行，置于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h，觀察、記錄抑菌圈直徑。

1.2.3 芽孢菌D-4-1菌株的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 將分離得到的D-4-1菌株進(jìn)行菌落形態(tài)、菌體觀察，革蘭氏染色、芽孢染色等參考《微生物學(xué)實驗》進(jìn)行[10]。

1.2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 取抑菌圈最大的D-4-1菌株對數(shù)生長期發(fā)酵液(搖床培養(yǎng)12 h)750 μL至EP管中，4 ℃，8 500 r/min離心7 min，重復(fù)3次。用無菌水洗滌沉淀2次，除去殘留的發(fā)酵液，4 ℃、8 500 r/min離心7 min。據(jù)參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行菌株DNA提取及PCR反應(yīng)，以細(xì)菌的16S rDNA通用引物27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R(TACGGYTACCTGTTACGACTT)引物進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增[11]。PCR產(chǎn)物送到北京生工生物技術(shù)進(jìn)行測序，測序結(jié)果通過NCBI中的BLAST功能進(jìn)行同源性分析，選取同源性較高的菌株序列，利用MEGA.7軟件進(jìn)行多序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3.3 生理生化試驗 據(jù)16S rDNA的分析結(jié)果，依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[9]，對照芽孢桿菌分類學(xué)[9]，對芽孢菌株進(jìn)行生理生化試驗，并記錄結(jié)果。

1.2.4 芽孢桿菌D-4-1菌株耐受試驗

1.2.4.1 膽酸鹽耐受試驗 將D-4-1菌株接種到牛膽鹽濃度分別為0.0%、0.1%、0.2%、0.3%的NB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后梯度稀釋，取10-4梯度刮板計數(shù)。取0.1 mL涂平板，平板計數(shù)存活情況。

1.2.4.2 人工胃液耐受 將活化好的芽孢桿菌按1.0%的接種量接入到上述人工胃液中，稀釋到10-6，取100 μL加入到平板上，涂布后在37 ℃培養(yǎng)箱中陪養(yǎng)24 h，進(jìn)行活菌平板菌落計數(shù)。

1.2.4.3 人工腸液耐受 將活化好的芽孢桿菌按1.0%的接種量接入到上述人工腸液，37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)，在0 h、2 h、4 h、6 h進(jìn)行活菌平板菌落計數(shù)。稀釋到10-6，取100 μL加入到平板上。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)EXCEL處理后用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩

圖1為部分菌株初篩結(jié)果。經(jīng)病原菌拮抗試驗，從羊腸道中初篩得到180株菌，其中抑菌圈大于9 mm的有120株。

圖1 初篩抑菌圈Fig.1 Initial screening zone

2.2 復(fù)篩

圖2為部分菌株復(fù)篩結(jié)果。從180株初篩菌株中選取80株不同形態(tài)的活性較高的菌株進(jìn)行復(fù)篩，共分離得到具有較高拮抗作用的菌株6株，其抑菌圈直徑均大于13 mm。其中L-2-11菌株和D-4-1菌株抑菌圈直徑分別為18.0 mm和18.7 mm，抑菌效果顯著高于其他菌株(P<0.05)(表1)。

圖2 復(fù)篩抑菌圈Fig.2 Rescreening inhibition zone

2.3 形態(tài)學(xué)觀察

由圖3可知，D-4-1菌株為類透明色大菌落，橢球形，邊緣光滑，不凸起，濕潤。菌體呈桿狀，革蘭氏染色陽性(G+)，菌體長約1.4 μm，寬約0.5 μm，散在或成對排列。由圖4可知，D-4-1菌株產(chǎn)芽孢，且芽孢中生，呈橢圓形，長約0.6 μm，寬約0.3 μm。

表1 復(fù)篩抑菌試驗結(jié)果Table 1 The results of secondary screening bacteriostasis test

圖3 D-4-1菌體形態(tài)Fig.3 Mycelium morphology of D-4-1 strain

圖4 D-4-1菌株芽孢染色Fig.4 Spore dyeing of D-4-1 strain

2.4 芽孢菌株D-4-1分子生物學(xué)鑒定

據(jù)測序結(jié)果，將菌株D-4-1的16SrDNA序列在NCBI上與芽孢菌株的標(biāo)準(zhǔn)菌株序列進(jìn)行BLAST比對，對相似性較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株，利用MEGA.7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示菌株D-4-1與短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)處于同一分支，親緣關(guān)系最近(圖5)。初步鑒定菌株D-4-1是短小芽孢桿菌。

2.5 生理生化鑒定

據(jù)菌株D-4-1形態(tài)學(xué)特征及16 S rDNA結(jié)果進(jìn)行針對性生理生化測定，結(jié)果見表2。由表2可知D-4-1接觸酶、糖發(fā)酵試驗等結(jié)果一致，通過對照相關(guān)文獻(xiàn)，菌體、菌落形態(tài)及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]，判斷D-4-1為芽孢桿菌屬與短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)生理生化特征基本一致。

2.6 芽孢桿菌D-4-1菌株的耐受試驗

2.6.1 膽酸鹽耐受試驗 由表3可知，D-4-1在0.1%膽酸鹽濃度下10-4梯度有大于300個菌落，隨著膽酸鹽濃度的增加，菌落數(shù)與0%膽酸鹽濃度相比極顯著下降(P<0.01)，但在0.3%濃度下仍然有60個菌落，表明D-4-1菌株能耐受一定濃度的膽酸鹽。

2.6.2 人工胃液耐受試驗 低pH的胃液是益生菌進(jìn)入腸道的首要關(guān)口。通常胃酸的pH在2.0～3.0。由表4可知，在10-6稀釋度下，pH 2.0的環(huán)境下有11.67個菌落存活，隨著pH增加，菌落數(shù)呈波動增加，且在pH 4.0條件下達(dá)到124個菌落，極顯著高于pH 2.0(P<0.01)和pH 3.0(P<0.01)，表明益生菌可通過與食糜混合后，穿越胃環(huán)境到達(dá)腸道發(fā)揮作用。

2.6.3 人工腸液耐受試驗 腸道pH大約在6.0～7.0，益生菌進(jìn)入動物腸道后隨著時間的延長菌落數(shù)逐漸增加，在進(jìn)食6 h后，10-6稀釋度下，菌落數(shù)大于300個，呈極顯著增加(P<0.01)，表明在動物腸道中菌株D-4-1能夠很好的存活，進(jìn)而發(fā)揮益生作用。

圖5 菌株D-4-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain D-4-1

表2 生理生化鑒定試驗結(jié)果Table 2 The results of physiological and biochemical experiments

表3 膽酸鹽濃度對菌株D-4-1生長的影響Table 3 The growth of strain D-4-1 in different concentrations of bile salt

表4 菌株D-4-1在不同pH的人工胃液中存活情況Table 4 The growth of strain D-4-1 in different pH of gastric juice

表5 菌株D-4-1 在人工腸液不同時間的存活情況Table 5 The growth of strain D-4-1 in different time of artificial intestinal fluid

3 討 論

腸道致病菌引起臨床疾病的機(jī)制有產(chǎn)生毒素和入侵腸粘膜[13]。致病菌會產(chǎn)生多種毒素，破壞腸道上皮細(xì)胞，從而導(dǎo)致炎癥性腹瀉。與腸道致病菌進(jìn)行對峙生長試驗是篩選目的益生菌等微生態(tài)制劑的有效途徑。本研究利用腸道病原菌為指示菌，從羊腸道中篩選出具有抑菌活性的D-4-1菌株，經(jīng)代謝產(chǎn)物復(fù)篩得出，該菌代謝產(chǎn)物中含有抑菌活性物質(zhì)，能發(fā)揮很好的抑菌效果。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化、16 S rDNA序列分析，得出拮抗細(xì)菌D-4-1為短小芽孢桿菌。劉噶等[14]由犢牛創(chuàng)口分離到一株短小芽孢桿菌，對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用，且上清液的抑菌作用明顯。產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC)為幼畜嚴(yán)重腹瀉的重要致病菌[15]，是一種重要的能夠在全球范圍內(nèi)引起疾病的病原，其毒力因子是黏附素、腸毒素、內(nèi)毒素等，破壞腸道黏膜屏障，造成黏膜損傷，引發(fā)幼畜腹瀉[16]。研究表明，益生菌代謝產(chǎn)物包括SCFAs(丁酸鹽、乙酸鹽和丙酸鹽等)、吲哚、細(xì)菌素和維生素等[17]。其中丁酸及其鹽類等可參與維持腸道良好形態(tài)、干預(yù)腸道細(xì)胞增殖分化，調(diào)節(jié)腸道上皮緊密連接的合成，從而促進(jìn)腸道修復(fù)應(yīng)激損傷和成熟[18]。丙酸能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH來抑制沙門氏菌的增殖[19]。細(xì)菌素主要由革蘭氏陽性菌產(chǎn)生，屬核糖體合成的多肽發(fā)揮抗菌性能的一類物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，降低沙門氏菌的含量[20]。芽孢細(xì)菌是腸道內(nèi)固有存在的一類嚴(yán)格好氧性菌或者兼性厭氧菌，它能在腸道定殖且產(chǎn)生多種營養(yǎng)物質(zhì)和活性因子如分泌抗菌肽、乳酸等，有著良好的飼用價值，因而，被廣泛應(yīng)用于動物生產(chǎn)中尤其對幼畜腹瀉具有顯著的防治效果[21]。

胃腸道是動物的消化吸收的主要部位，腸道微生物區(qū)系的平衡對動物機(jī)體健康具有重要作用。益生菌必須耐受胃環(huán)境后再能順利抵達(dá)腸道發(fā)揮其益生功能。眾多研究表明，益生菌能夠耐受一定濃度的膽酸鹽和pH。張振宇等[22]通過篩選得到的益生菌在pH3.0的人工胃液中存活率為119.53%，在0.3%膽鹽中生長率達(dá)到41.64%。賀珊珊等[23]由5株具有降解膽固醇的益生菌中篩選得到1株植物乳酸桿菌LP-C能夠長時間耐受pH2.5的高酸性環(huán)境和0.5%的膽鹽濃度。劉之園等[24]從9株益生菌中篩選得到了一株菌株，在pH1.0條件下存活率為93.69%，0.3%膽鹽濃度下存活率達(dá)到88.56%。郭云霞等[11]從羊腸道篩選出一株地衣芽孢桿菌，在人工胃液、不同pH值環(huán)境及膽鹽濃度下均能很好的生存。正常情況下，動物胃酸的pH在2～3之間，腸道內(nèi)膽酸鹽濃度0.03%～0.3%[11]。本研究體外試驗證實，D-4-1菌株在0.3%的膽酸鹽及pH2.0的人工胃液環(huán)境存活率較高，表明該菌可耐受胃腸道環(huán)境，在小腸發(fā)揮益生作用。

然而，動物源性益生菌的應(yīng)用菌種較少且研究結(jié)果不一，但是其作為抗生素的替代品在提高家畜生產(chǎn)性能，提高養(yǎng)殖效益，促進(jìn)家畜健康方面逐步得到人們的認(rèn)可，這為微生態(tài)制劑在畜牧生產(chǎn)上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

從羊腸道中篩選得到D-4-1益生芽孢菌株為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)，且在人工胃腸道環(huán)境中耐受性良好。