戴雅琴，杜崇民，謝惠平

(1. 江漢大學(xué)附屬湖北省第三人民醫(yī)院，湖北 武漢 430033；2. 青島市即墨區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島 266200)

急性濕疹又稱為特應(yīng)性皮炎，是臨床多發(fā)、常見(jiàn)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)炎性皮膚疾病，表現(xiàn)為皮膚瘙癢、紅斑、丘疹、水皰等，發(fā)病機(jī)制尚未明確，內(nèi)、外致病因素共同致病[1-2]。目前西醫(yī)主要應(yīng)用類(lèi)固醇激素或免疫調(diào)節(jié)劑治療，短期效果較好，但停藥易復(fù)發(fā)，長(zhǎng)期反復(fù)應(yīng)用易引起皮膚萎縮、色素沉著等不良反應(yīng)，甚至出現(xiàn)內(nèi)分泌代謝紊亂、誘發(fā)及加重感染等[3]。濕疹屬中醫(yī)“濕瘡”范疇，多因機(jī)體較弱、衛(wèi)外不固、營(yíng)衛(wèi)失和、陰陽(yáng)失調(diào)、七情內(nèi)傷，導(dǎo)致耗傷氣血，陰血虛少，血虛而生風(fēng)，風(fēng)邪趁機(jī)侵襲而發(fā)病[4]。黃柏膠囊主要成分為中藥黃柏，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡功效，治療濕疹療效較好，且無(wú)明顯不良反應(yīng)，但其作用機(jī)制尚不明確[5]。鹽酸奧洛他定是肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑及相對(duì)選擇性組胺H1受體拮抗劑，主要用于濕疹、多形性滲出性紅斑的治療。本研究探討了黃柏膠囊聯(lián)合鹽酸奧洛他定對(duì)急性濕疹模型大鼠的干預(yù)作用及抗過(guò)敏機(jī)制，旨在為臨床應(yīng)用提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡清潔級(jí)SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量(200±20)g，湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK-(鄂)2017-0011]，室溫飼養(yǎng)，自由飲水。

1.1.2藥品與試劑 黃柏膠囊(淄博華洋制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20063055，生產(chǎn)批號(hào)：20190314，規(guī)格：每粒0.39 g)；鹽酸奧洛他定(北京四環(huán)科寶制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20143415，生產(chǎn)批號(hào)：20190409，規(guī)格：5 mg/片)；2,4-二硝基氯苯(DNCB,化學(xué)純，成都科龍化工試劑廠，生產(chǎn)批號(hào)：20190117)；蘇木精-伊紅染色液(武漢華美生物工程有限公司)；兔抗鼠干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)多克隆抗體一抗試劑盒(碧云天生物科技有限公司)和二抗試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)抗體試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為bs-4617R和bs-0920R)；BCA試劑盒和DAB顯色液(碧云天生物科技有限公司，批號(hào)分別為201903171和201903115)；PVDF 膜(Millipore公司，批號(hào)：K5EA5859N)，山羊抗兔IgG(Abcam公司，批號(hào)：150077)，Trizol提取試劑盒(Takara公司，批號(hào)：AKA5101)，qPCR反應(yīng)試劑盒(BIO-RAD公司，批號(hào)：L001751 A)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司，批號(hào)：AK4102)，ICAM-1和VCAM-1引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 手術(shù)器械(蘇州六六視覺(jué)醫(yī)療設(shè)備公司)；LDZ-2 型低速離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)；BX60顯微鏡(日本Olympus Optical公司)；ELx800酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)；B-013003勻漿器(上海壘固儀器有限公司)；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀[伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)]；SIM凝膠成像儀[美國(guó)西盟(國(guó)際)生命技術(shù)有限公司]；RT-PCR擴(kuò)增分析系統(tǒng)(美國(guó)羅氏公司)。

1.2分組、造模及給藥 將50雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、黃柏膠囊組、鹽酸奧洛他定組和聯(lián)合組，每組10只。除對(duì)照組外，其余組均參照文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行急性濕疹造模：采用5%水合氯醛麻醉大鼠，電剃須刀或電推剪去除大鼠右側(cè)背部被毛，面積約為2 cm×3 cm，將1滴5% DNCB涂于右側(cè)背部以致敏，然后本別于第3天、第6天和第9天將1滴2% DNCB涂于右側(cè)背部，以右側(cè)背部出現(xiàn)明顯的滲出、糜爛、丘疹、水腫、紅斑等為造模成功。 于造模后第10天，對(duì)照組和模型組給予生理鹽水灌胃，黃柏膠囊組給予0.2 g/mL黃柏膠囊溶液灌胃，鹽酸奧洛他定組給予0.65 mg/mL鹽酸奧洛他定溶液灌胃，聯(lián)合組給予0.2 g/mL黃柏膠囊溶液和0.65 mg/mL鹽酸奧洛他定溶液灌胃，劑量均為5 mL/kg，每天1次，連續(xù)10 d。

1.3檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1濕疹度評(píng)分和皮膚腫脹度 于造模第20天，觀察各組大鼠的抓痕、滲出、糜爛、丘疹、紅斑、水腫等情況，根據(jù)癥狀輕重進(jìn)行濕疹度評(píng)分[6]：癥狀無(wú)、輕、中、重分別計(jì)分0，1，2，3分，最高18分，評(píng)分越高，濕疹越嚴(yán)重。采用直徑6 mm的圓形打孔器取健康區(qū)域和濕疹區(qū)域皮膚，計(jì)算皮膚腫脹度，皮膚腫脹度=濕疹皮膚質(zhì)量-健康皮膚質(zhì)量。

1.3.2組織HE染色病理觀察 于造模第20天，處死各組大鼠，分離實(shí)驗(yàn)所需皮膚組織，4%多聚甲醛固定24 h，自來(lái)水沖洗，不同濃度的乙醇脫水，二甲苯透明固定，石蠟包埋，切片，厚度為5 μm，烤片，二甲苯脫蠟，乙醇水化，蘇木精染色，1%鹽酸乙醇溶液分化，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，浸入伊紅染液，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠進(jìn)行封片，顯微鏡下觀察。

1.3.3炎癥因子水平 處死各組大鼠前，心臟取血，離心，取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定各組大鼠血清IFN-γ、IL-4和TNF-α水平，按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.4ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)量 采用Western blot法檢測(cè)：取100 mg皮膚組織標(biāo)本，PBS緩沖液沖3次，加入含1 mmol/L PMSF的RIPA低溫研磨，離心取上清，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，562 nm測(cè)定OD值，計(jì)算蛋白濃度，將膠板安裝于電泳槽中，倒入電泳液，按40 μg蛋白上樣，電泳條件為電壓80 V、30 min，樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)節(jié)電壓至120 V，電泳結(jié)束后，取出玻璃板，切去濃縮膠及分離膠，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，PVDF膜使用前浸于適量甲醇中活化，設(shè)置轉(zhuǎn)膜條件(80 V、120 min)，冰浴，取出PVDF膜，37 ℃恒溫?fù)u床封閉2 h，將PVDF膜裁成長(zhǎng)條，置于ICAM-1和VCAM-1一抗(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)，4 ℃恒溫?fù)u床孵育過(guò)夜，1×TBST 洗PVDF膜3次，夾取PVDF膜置入二抗(辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，1∶5 000)1 h，1×TBST 洗PVDF膜3次，DAB顯色，凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)條帶灰度，計(jì)算ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)量。

1.3.5ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達(dá)量 取皮膚組織標(biāo)本100 mg，Trizol法提取總RNA，取1 μL提取的RNA，采用微量分光光度計(jì)于A260和A280檢測(cè)提取的RNA純度，去除DNA后以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行c DNA合成，采用RT-PCR和相關(guān)軟件檢測(cè)ICAM-1和VCAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量，40個(gè)循環(huán)，預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 5 min。引物序列：ICAM-1上游為5’-TCCAATGGCTTCAACCCGTG-3’,下游為5’-CTTCTGTGGGATGGATGGAT-3’，長(zhǎng)度為110 bp；VCAM-1上游為5’-GAGACAAAACAGAAGTGGAAT-3’,下游為5’-AGCAACGTTGACATAAAGAGT-3’，長(zhǎng)度為635 bp；GAPDH上游為5’-TTCTAGAGACAGCCGCATCT-3’,下游為5’-TGGTAACCAGGTGTCCGATA-3’，長(zhǎng)度為278 bp。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠濕疹度評(píng)分和皮膚腫脹度比較 模型組大鼠濕疹度評(píng)分和皮膚腫脹度均顯著高于對(duì)照組(P均<0.05)。黃柏膠囊組、鹽酸奧洛他定組和聯(lián)合組大鼠濕疹度評(píng)分和皮膚腫脹度均顯著低于模型組(P均<0.05)，且聯(lián)合組均顯著低于黃柏膠囊組和鹽酸奧洛他定組(P均<0.05)，黃柏膠囊組和鹽酸奧洛他定組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組大鼠皮膚組織HE染色表現(xiàn) 對(duì)照組大鼠皮膚組織正常；模型組大鼠表皮突延長(zhǎng)、棘層肥厚，角化過(guò)度，細(xì)胞間水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；黃柏膠囊組、鹽酸奧洛他定組和聯(lián)合組可見(jiàn)部分棘細(xì)胞腫脹，表皮突稍長(zhǎng)，角質(zhì)層變薄，少量細(xì)胞間水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

2.3各組大鼠血清炎癥因子水平比較 模型組大鼠血清IFN-γ、IL-4和TNF-α水平均顯著高于對(duì)照組(P均<0.05)。黃柏膠囊組、鹽酸奧洛他定組和聯(lián)合組大鼠血清IFN-γ、IL-4和TNF-α水平均顯著低于模型組(P均<0.05)，且聯(lián)合組均顯著低于黃柏膠囊組和鹽酸奧洛他定組(P均<0.05)，黃柏膠囊組和鹽酸奧洛他定組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠濕疹度評(píng)分和皮膚腫脹度比較

2.4各組大鼠皮膚組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA表達(dá)量比較 模型組大鼠皮膚組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P均<0.05)。黃柏膠囊組、鹽酸奧洛他定組和聯(lián)合組大鼠皮膚組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA表達(dá)量均顯著低于模型組(P均<0.05)，且聯(lián)合組均顯著低于黃柏膠囊組和鹽酸奧洛他定組(P均<0.05)，黃柏膠囊組和鹽酸奧洛他定組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖2和表3。

圖1 各組大鼠皮膚組織病理學(xué)HE染色表現(xiàn)(×400)

表2 各組大鼠血清IFN-γ、IL-4和TNF-α水平比較

圖2 各組大鼠ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)條帶情況

3 討 論

急性濕疹發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前尚無(wú)特效治療藥物。西藥鹽酸奧洛他定屬于二苯驕氧草類(lèi)衍生物，能夠抑制變應(yīng)原誘發(fā)的血管通透性增高，減少滲出，可抑制肥大細(xì)胞游走，穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜，抑制嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，降低炎癥細(xì)胞活性[7-8]，用于治療濕疹近期效果明顯，且不良反應(yīng)相對(duì)較少。中成藥黃柏膠囊主要成分為黃柏，黃柏中黃柏堿和木蘭堿成分對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)期皆有抑制作用，可抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng)，提高機(jī)體免疫力，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)病情恢復(fù)[9]；小檗堿成分具有抗菌、收斂和消炎作用，可降低血清炎癥因子水平[10]。故本研究選擇此兩種藥物進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)探討。

濕疹是由內(nèi)外致敏因子引起的疾病，致敏T細(xì)胞激活Th2免疫反應(yīng)，釋放IFN-γ、IL-4等炎性因子，造成組織損傷，單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等浸潤(rùn)，故炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)異常與急性濕疹發(fā)病過(guò)程和發(fā)展預(yù)后密切相關(guān)[11-12]。IFN-γ可促進(jìn)Th1細(xì)胞成熟，抑制Th2 細(xì)胞增殖，同時(shí)可刺激TNF-α等細(xì)胞因子的上調(diào)[13]。IL-4能調(diào)節(jié)T、B淋巴細(xì)胞，促進(jìn)免疫應(yīng)答反應(yīng)過(guò)程，可通過(guò)抑制體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞釋放TNF-α而發(fā)揮抗炎效應(yīng)，但其過(guò)量表達(dá)有促炎作用[14]。TNF-α適量水平可增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答，抑制炎癥反應(yīng)，但過(guò)量表達(dá)可引起炎癥區(qū)域組織損傷，加重炎癥反應(yīng)，促進(jìn)IFN-γ、IL-4水平升高，加重急性濕疹造成的皮膚損害[15]。促炎因子和抗炎因子在炎癥反應(yīng)過(guò)程中具有相互拮抗和相輔相成的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃柏膠囊組、鹽酸奧洛他定組和聯(lián)合組的濕疹度評(píng)分、皮膚腫脹度及血清IFN-γ、IL-4、TNF-α水平均顯著低于模型組，且聯(lián)合組各指標(biāo)及病理形態(tài)改善更顯著，提示黃柏膠囊與鹽酸奧洛他定聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抗炎作用。

表3 各組大鼠ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

細(xì)胞黏附分子介導(dǎo)免疫細(xì)胞間的互動(dòng)與活化，參與免疫應(yīng)答、炎癥損傷等。皮膚炎癥反應(yīng)過(guò)程中肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌的炎癥因子激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞大量表達(dá)ICAM-1和VCAM-1，引起同種細(xì)胞間聚集并加重炎癥[16]。ICAM-1表達(dá)于活化T細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞等，可穩(wěn)定細(xì)胞和促進(jìn)白細(xì)胞游走，正常組織中弱表達(dá)，炎癥組織中高表達(dá)，影響T細(xì)胞的分化，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[17]。VCAM-1表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚樹(shù)突狀細(xì)胞等，與眾多蛋白結(jié)合形成信號(hào)復(fù)合體，為炎癥細(xì)胞的激活提供關(guān)鍵的共刺激信號(hào)，可介導(dǎo)黏附淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞，VCAM-1與其受體結(jié)合是淋巴細(xì)胞活化的重要步驟，在皮膚炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃柏膠囊組、鹽酸奧洛他定組和聯(lián)合組ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著低于模型組，且聯(lián)合組明顯低于黃柏膠囊組和鹽酸奧洛他定組，提示黃柏膠囊與鹽酸奧洛他定聯(lián)合應(yīng)用可能通過(guò)下調(diào)細(xì)胞黏附分子表達(dá)而減輕急性濕疹的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，黃柏膠囊聯(lián)合鹽酸奧洛他定治療急性濕疹可更明顯減輕病情和改善組織病理形態(tài)，可能與下調(diào)炎癥因子和ICAM-1、VCAM-1蛋白及mRNA表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。