潘怡惟，鄧雪陽，馬世平，傅強(qiáng)

(中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，江蘇 南京 211198)

哮喘，又稱支氣管哮喘，是一種異質(zhì)性疾病。哮喘常以慢性氣道炎癥為特征，并與氣道高反應(yīng)性相關(guān)，導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作的喘息、氣急、胸悶、咳嗽。特別是在夜間或清晨發(fā)作或加劇，這些發(fā)作通常與肺內(nèi)氣流阻塞相關(guān)，通常可以自發(fā)地或通過治療逆轉(zhuǎn)[1]。以哮喘為代表的慢性呼吸系統(tǒng)疾病具有發(fā)病率高，病程長(zhǎng)，治療費(fèi)用高等特點(diǎn)[2]。對(duì)患者、家庭、社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。臨床對(duì)于哮喘的治療，主要使用的西藥有：糖皮質(zhì)激素、茶堿類、抗IgE抗體、白三烯調(diào)節(jié)劑等藥物[1,3]。

麻芩消咳顆粒來源于安徽省老中醫(yī)的臨床經(jīng)驗(yàn)方，以“麻杏石甘湯” 為基礎(chǔ)加減而得，由麻黃(密炙)、桑白皮、金銀花、黃芩等多種中藥組成，具有清肺化痰、止咳平喘的功效。臨床上常用于痰熱所致之咳嗽、喘息、痰黃稠厚等癥。為驗(yàn)證麻芩消咳顆粒對(duì)大鼠哮喘模型的藥效作用，本研究建立了卵蛋白致敏的大鼠哮喘模型，探究麻芩消咳顆粒的平喘抗炎作用及其機(jī)制，為該產(chǎn)品臨床擴(kuò)大適用癥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重180～200 g，購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(浙)2019-0002。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(蘇)2018-0019。自由攝食和飲水，室溫(25±2)℃，相對(duì)濕度50%～60%，晝夜12 h交替。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及試劑 麻芩消咳顆粒(億帆制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z20040092，批號(hào)：190602)；肺寧顆粒(修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：180365)；卵蛋白(Sigma公司，貨號(hào)：A5253)；大鼠 IL-6 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號(hào)：E-EL-R0015c)；大鼠 IL-17 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號(hào)：E-EL-R0566c)；大鼠IgE ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號(hào)：E-EL-R0517c)；大鼠 IL-4 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號(hào)：E-EL-R0014c)；PI3K一抗(Cell Signaling Technology，批號(hào)：4255)；P-PI3K一抗(Affinity Biosciences，批號(hào)：AF3241)；AKT一抗(Cell Signaling Technology，批號(hào)：4691)；P-AKT一抗(Cell Signaling Technology，批號(hào)：4060)；兔二抗(Bioworld公司，批號(hào)：AA01201)。

1.3 儀器 超聲霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司，型號(hào)：402B)；-80 ℃超低溫冰箱(美國(guó)Thermo公司)；SN3001全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠/化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；EPS 600電泳儀(上海天能科技有限公司)。

1.4 動(dòng)物分組給藥 大鼠根據(jù)體重隨機(jī)分為6組，分別為肺寧顆粒2.5 g·kg-1組、麻芩消咳顆粒1、2、4 g·kg-1組、模型組和溶劑對(duì)照組。

1.5 模型制備 分別于第0、7天，模型組及各給藥組大鼠皮下多點(diǎn)注射卵蛋白混懸液致敏?？瞻捉M皮下注射等體積生理鹽水作為對(duì)照。第15天開始，模型組及各給藥組用1%的OVA生理鹽水溶液霧化激發(fā)哮喘。從激發(fā)第一天開始給藥，共計(jì)給藥4周，空白和模型組給予等體積生理鹽水。末次激發(fā)后處死大鼠，收集組織樣本，于-80 ℃冰箱保存。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 ELISA測(cè)定肺泡灌洗液中炎癥因子 每組取8只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，分離頸部肌肉進(jìn)行氣管插管，用PBS盥洗肺組織，共盥洗3次。合并肺泡盥洗液(BALF)，取盥洗液1 mL，3 000 r·min-1離心5 min，取上清。按ELISA試劑盒說明書，測(cè)定其中IL-6、IL-17含量。

1.6.2 ELISA測(cè)定血清中IgE、IL-4含量 每組取8只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血。靜置30 min后，3 000 r·min-1離心15 min，取上清。按ELISA試劑盒說明書操作，測(cè)定其中IgE、IL-4含量。

1.6.3 肺組織的病理學(xué)觀察-HE染色 固定大鼠肺組織，制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色。顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，觀察肺泡上皮細(xì)胞的損傷程度以及氣管壁增厚程度。

1.6.4 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 收集大鼠肺組織，-80 ℃保存。 肺組織按重量體積比(1∶50)加入含有1% PMSF的RIPA Buffer。于冰上研磨勻漿，裂解30 min。 4 ℃，12 000 r·min-1，離心30 min。吸上清加入體積為1/4的5× SDS-PAGE Loading Buffer 混勻，煮沸10 min。于-20 ℃冰箱保存，Western blot檢測(cè)肺組織中PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 麻芩消咳顆粒對(duì)過敏性哮喘大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子表達(dá)的影響 與空白組相比，模型組大鼠BALF中IL-6、IL-17顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，肺寧顆粒組能夠降低IL-6水平，但不具有顯著性差異，顯著降低IL-17水平(P<0.05)。麻芩消咳顆粒低、中、高劑量組能降低BALF中IL-6、IL-17水平(P<0.05、P<0.01)。麻芩消咳顆粒各劑量組與肺寧顆粒組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果見表1。

表1 麻芩消咳顆粒對(duì)大鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-17含量的影響

2.2 麻芩消咳顆粒對(duì)過敏性哮喘大鼠血清中IgE、IL-4含量的影響 與空白組相比，模型組大鼠血清中IgE、IL-4顯著升高(P<0.01、P<0.05)。與模型組相比，肺寧顆粒組能夠顯著降低IgE、IL-4水平(P<0.01、P<0.05)。麻芩消咳顆粒中、高劑量組能夠顯著降低血清中IgE、IL-4水平(P<0.01、P<0.05)。麻芩消咳顆粒各劑量組與肺寧顆粒組之間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果見表2。

表2 麻芩消咳顆粒對(duì)大鼠血清中IgE、IL-4含量的影響

2.3 肺組織的病理學(xué)觀察-蘇木精-伊紅染色 空白組大鼠肺組織支氣管壁、肺泡結(jié)構(gòu)完整且清晰，未見明顯炎性浸潤(rùn)現(xiàn)象。相比于空白組，模型組大鼠支氣管壁明顯增厚，可見大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)破壞。肺寧顆粒給藥干預(yù)后，相比于模型支氣管壁厚度降低，炎性細(xì)胞數(shù)量降低。麻芩消咳顆粒低、中、高均能明顯改善卵蛋白誘導(dǎo)的大鼠肺部組織支氣管壁增厚，炎性浸潤(rùn)現(xiàn)象，結(jié)果見圖1。

2.4 對(duì)肺組織PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 模型組大鼠肺部組織p-PI3K/ PI3K水平相比于空白組大鼠顯著升高(P<0.01)，肺寧顆粒及麻芩消咳顆粒中劑量給藥后，可顯著降低p-PI3K/PI3K水平(P<0.05、P<0.01)。麻芩消咳顆粒各劑量組與肺寧顆粒組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果見圖2。

圖1 肺組織HE染色(×200,n=3)

圖2 麻芩消咳顆粒對(duì)大鼠肺組織中p-PI3K/ PI3K表達(dá)水平的影響(n=3)注：與空白組相比，## P<0.01；與模型組相比，*P<0.05,**P<0.01

模型組大鼠肺部組織p-AKT/AKT水平相比于空白組大鼠顯著升高(P<0.01)，肺寧顆粒及麻芩消咳顆粒中劑量給藥后，可顯著降低p-AKT/AKT水平(P<0.05、P<0.01)。麻芩消咳顆粒各劑量組與肺寧顆粒組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果見圖3。

圖3 麻芩消咳顆粒對(duì)大鼠肺組織中p-AKT/AKT表達(dá)水平的影響(n=3) 注：與空白組相比，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05,**P<0.01

3 討論

哮喘發(fā)病率逐年升高，其發(fā)病因素、機(jī)制復(fù)雜。發(fā)病因素包括遺傳因素，環(huán)境因素如病毒、細(xì)菌、粉塵、藥物、花粉、食物、寒冷、勞累等[4]。哮喘其發(fā)病與多種因素相關(guān)，目前機(jī)制尚不明確[5-6]。由此，防治哮喘藥物的開發(fā)顯得尤為重要。

炎癥在許多呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病中起著關(guān)鍵作用，例如哮喘、急性肺損傷和慢性阻塞性肺疾病等[7-8]。其中，氣道免疫-炎癥機(jī)制認(rèn)為由Th2細(xì)胞活化并產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-4，在哮喘發(fā)生過程中起到關(guān)鍵作用。IL-4對(duì)IgE的產(chǎn)生、誘導(dǎo)肥大細(xì)胞具有影響。IgE可結(jié)合嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞，與其表面的高親和力IgE受體結(jié)合，形成致敏狀態(tài)[9-11]。當(dāng)機(jī)體再次接觸到過敏原，肥大細(xì)胞內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)生脫顆粒并釋放大量炎性介質(zhì)，導(dǎo)致氣道平滑肌痙攣，發(fā)生過敏性哮喘的臨床癥狀。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)比空白組大鼠，哮喘模型組大鼠 血清中IL-4、IgE含量顯著升高。相比于模型組大鼠，麻芩消咳顆?？梢燥@著降低血清中IL-4、IgE水平，并能顯著降低BALF中IL-6、IL-17水平。提示麻芩消咳顆粒的平喘作用可能與其降低IL-4、IgE、IL-6、IL-17水平，抑制氣道免疫-炎癥反應(yīng)有關(guān)。

磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路在炎癥和腫瘤等病理狀態(tài)的產(chǎn)生、發(fā)展過程中均具有重要的影響作用[12]。其能夠通過多種渠道對(duì)炎癥的發(fā)生起到調(diào)控的作用，從而影響炎癥的發(fā)生和發(fā)展，并且參與到細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[13-14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠存在PI3K/AKT通路的異常激活，相比于模型組大鼠，麻芩消咳顆粒能夠顯著降低大鼠肺部PI3K及AKT磷酸化水平。提示麻芩消咳顆粒平喘抗炎的分子機(jī)制可能有其調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，本研究證實(shí)麻芩消咳顆粒對(duì)OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘大鼠具有顯著的平喘抗炎作用，能夠改善OVA誘導(dǎo)的大鼠肺部組織損傷，氣管腔狹小，炎性浸潤(rùn)。其作用機(jī)制可能與PI3K/AKT信號(hào)有關(guān)，為麻芩消咳顆粒臨床應(yīng)用拓展提供依據(jù)。本研究初步探究了麻芩消咳顆粒藥效及潛在機(jī)制。但哮喘發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，后續(xù)仍需進(jìn)一步的機(jī)制探究。