李 源，黨海舟

(1.漢中市三二0一醫(yī)院呼吸科，陜西 漢中 723000； 2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸腔外科，西安 710000)

目前，肺癌是最常見的癌癥，也是全球癌癥死亡的主要原因[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)是指除小細胞肺癌(SCLC)外的肺癌，約占所有肺癌病例的85%，其5年總生存率僅為15%[2],已成為嚴重危害人類健康和患者生命質(zhì)量的疾病。因此，探索其發(fā)病機制和影響因素，加強預(yù)防和干預(yù)成為目前急待解決的關(guān)鍵問題。NSCLC的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后與DNA修復(fù)突變相關(guān)基因[3]、DNA甲基化[4]等表觀遺傳修飾水平異常有關(guān)。而DNA甲基化會導(dǎo)致DNA、染色質(zhì)以及DNA和蛋白質(zhì)相互作用的變化，從而引起基因表達發(fā)生改變[5]。

GATA4屬于轉(zhuǎn)錄因子GATA家族，GATA4是調(diào)控一些組織特異性表達的關(guān)鍵因子[6]，此外，GATA4可能驅(qū)動內(nèi)胚層特異性分化[7]。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子GATA4基因功能的喪失與肺癌[8]、漿液性卵巢癌[9]、胃癌[10]、結(jié)直腸細胞系和原發(fā)性結(jié)腸癌[11]等惡性腫瘤密切相關(guān)，其可能是肺癌功能喪失的靶點，且GATA4啟動子甲基化參與其中[12]。研究發(fā)現(xiàn)過表達GATA4會抑制結(jié)腸癌細胞的增殖[13]，而GATA4的缺失使惡性膠質(zhì)瘤細胞的細胞增殖加速，患者生存率大大降低[14]。本文采用人NSCLC細胞系A(chǔ)549細胞研究其GATA4啟動子的甲基化和GATA4 mRNA的水平，并加入DNA甲基化抑制劑5-Aza-2′deoxycytidine，觀察其GATA4的mRNA水平和細胞的增殖及凋亡情況，以期為臨床NSCLC治療提供可能的靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑

人正常肺上皮細胞系BEAS-2B和人NSCLC細胞系A(chǔ)549(均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心)。Genomic DNA試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)，DNA重亞硫酸鹽處理試劑盒(天根生化科技有限公司)，基因甲基化特異性PCR擴增(MSP)試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)，焦磷酸測序試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)，PCR引物(上海生工生物工程有限公司)，總RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，SYBR Green PCR試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)，CCK-8檢測試劑盒(博士德生物工程有限公司)，anti-PCNA抗體(CST公司)、anti-cleaved-caspase 3和anti-caspase 3(abcam公司)、β-actin(abcam公司)，ANNEXIN V-FITC/PI凋亡試劑盒(博士德生物工程有限公司)。

1.2 細胞的分組與處理

以人正常肺上皮細胞系BEAS-2B為對照組，人NSCLC細胞系A(chǔ)549為NSCLC組進行甲基化檢測。之后在A549細胞中加入2 μmol·L-1的甲基化抑制劑5-Aza-2′deoxycytidine，分為NSCLC組和NSCLC+5-Aza-2′deoxycytidine組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h之后進行實驗。

1.3 甲基化特異性PCR(MSP)法檢測NSCLC GATA4啟動子甲基化水平

選取對數(shù)生長期的BEAS-2B和A549細胞，待其生長匯聚至80%，胰蛋白酶消化細胞，1000 r·min-1離心5 min，收集細胞，按照試劑盒說明提取基因組DNA，采用超微量分光光度計測定提取DNA的濃度和純度。DNA亞硫酸氫鈉修飾，采用25 μL的反應(yīng)體系進行PCR擴增。甲基化GATA4引物序列為：上游5′-GTATAGTTTCGTAGTTTGCGTTTAGC-3′，下游5′-AACTCGCGACTCG-AATCCCCG-3′；非甲基化GATA4引物序列為：上游5′-TTTGTATAGTTTTGTAGTTTGTGTTT-TT-3′，下游5′-CCCAACTCACAACTCAA-ATCCCCA-3′。瓊脂糖凝膠電泳，120 V、5 min進行電泳，溴化乙錠(EB)染色，成像并拍照記錄。

1.4 Real-time PCR檢測GATA4的mRNA水平

選取對數(shù)生長期的BEAS-2B和A549細胞，待其生長匯聚至80%，胰蛋白酶消化細胞，1000 r·min-1離心5 min，收集細胞。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，每次反應(yīng)使用5 μg的總RNA。之后進行PCR擴增檢測GATA4 mRNA的表達水平。GATA4引物：上游5′-CTGGCCTGTCATCTCACTACG-3′，下游5′-GGTCCGTGCAGGAATTTGA-GG-3′。PCR擴增采用25 μL反應(yīng)體系，95 ℃、30 s預(yù)變性，95 ℃、5 s變性，60 ℃、30 s退火。最后按2-ΔΔCt檢測GATA4的mRNA表達水平。

1.5 CCK-8檢測細胞的增殖率

取對數(shù)期細胞使用細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，用完全培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)整為105·mL-1，在96孔板中接種細胞懸液，培養(yǎng)24 h，分別加入0.2、0.5、2.0和5.0 μmol·L-1的甲基化抑制劑5-Aza-2′deoxycytidine，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，避光加入CCK-8液，孵育2 h后酶標儀檢測吸光度值并計算增殖率。

1.6 Western blot檢測PCNA、cleaved-caspase 3和caspase 3的蛋白表達

待細胞匯聚至80%左右時，胰蛋白酶消化細胞，4000 r·min-1、10 min離心，棄上清留細胞沉淀。加入100 μL裂解液和1 μL蛋白酶抑制劑(PMSF)，超聲破碎細胞。12 000 r·min-1、15 min離心，取上清，BCA法測蛋白濃度。80 V電泳至marker分開，換120 V電泳。轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉。孵一抗4 ℃過夜、孵二抗2 h，曝光機上曝光并拍照。分析灰度值，以β-actin為內(nèi)參。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

將細胞接種于六孔板內(nèi)，待細胞生長至70%，胰蛋白酶消化細胞，加入4 mL PBS，800 r·min-1、5 min離心，棄上清。輕輕吹打細胞使細胞懸液均勻，加入Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細胞，再加入Annexin V-FITC液重懸細胞，避光孵育10 min，相繼加入Annexin V-FITC結(jié)合液和碘化丙啶染色液，上機。根據(jù)所得數(shù)據(jù)進行結(jié)果分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 A549細胞GATA4啟動子甲基化頻率的變化

用甲基化特異性PCR(MSP)法對BEAS-2B細胞和人NSCLC細胞系A(chǔ)549的GATA4啟動子DNA甲基化水平進行檢測發(fā)現(xiàn)，與BEAS-2B相比，A549細胞的GATA4啟動子的DNA甲基化水平顯著升高[(3.383±0.614)%比(35.53±1.89)%,t=16.14,P<0.01],見圖1。提示GATA4啟動子的甲基化可能與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

**P<0.01與BEAS-2B比較，n=6。圖1 A549細胞中GATA4啟動子甲基化頻率顯著升高

2.2 A549細胞中GATA4 mRNA水平的變化

用Real-time PCR檢測BEAS-2B細胞和A549細胞的mRNA表達水平，結(jié)果顯示，與對照組相比，NSCLC組細胞的GATA4 mRNA水平顯著降低(1.000±0.000比0.358±0.027，t=23.98,P<0.01)，見圖2。提示NSCLC細胞GATA4啟動子甲基化水平的升高會導(dǎo)致GATA4 mRNA表達水平的降低。

**P<0.01與BEAS-2B比較，n=6。圖2 A549細胞中GATA4 mRNA水平明顯降低

2.3 抑制GATA4啟動子甲基化對NSCLC細胞的GATA4 mRNA水平的影響

在A549細胞中加入2 μmol·L-1的甲基化抑制劑5-Aza-2′deoxycytidine，用Real-time PCR檢測A549細胞的mRNA表達水平，結(jié)果顯示，與NSCLC組相比，NSCLC+5-Aza-2′deoxycytidine組細胞的GATA4 mRNA水平顯著升高(1.000±0.000比3.100±0.188，t=11.17,P<0.01)，見圖3。提示加入2 μmol·L-1的甲基化抑制劑5-Aza-2′deoxycytidine后，NSCLCGATA4啟動子甲基化水平受到抑制，導(dǎo)致GATA4的mRNA水平升高。

**P<0.01與NSCLC比較，n=6。圖3 抑制GATA4啟動子甲基化對NSCLC細胞GATA4 mRNA水平的影響

2.4 抑制GATA4啟動子甲基化對NSCLC細胞增殖的影響

除Control組外，其余分別加入0.2、0.5、2.0和5.0 μmol·L-1的甲基化抑制劑5-Aza-2′deoxycytidine，CCK-8結(jié)果顯示，隨著抑制劑濃度的升高，NSCLC細胞的增殖率逐漸降低(F=18.95,P<0.01)，見圖4A；用Western blot檢測細胞中增殖相關(guān)指標PCNA的蛋白表達，發(fā)現(xiàn)與NSCLC組相比，NSCLC+5-Aza-2′deoxycytidine組PCNA的蛋白表達水平降低(0.998±0.003比0.721±0.020,t=13.74，P<0.01)，見圖4B。提示GATA4啟動子甲基化能增加NSCLC細胞的增殖。

A：CCK-8檢測細胞的存活率，**P<0.01與Control比較，n=5；B：Western blot檢測PCNA的表達，**P<0.01與NSCLC比較，n=6。

2.5 抑制GATA4啟動子甲基化對NSCLC細胞凋亡的影響

Western blot結(jié)果顯示，與NSCLC組細胞相比，NSCLC+5-Aza-2′deoxycytidine組凋亡指標cleaved-caspase 3/caspase 3的比值增高(0.998±0.003比1.682±0.051,t=13.50,P<0.01)，見圖5A；流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)與NSCLC組細胞相比，NSCLC+5-Aza-2′deoxycytidine組的凋亡率增高[(6.222±0.399)%比(14.990±0.690)%,t=11.00,P<0.01]，見圖5B。提示GATA4啟動子甲基化能降低NSCLC細胞的凋亡。

A：Western blot檢測cleaved-caspase 3和caspase 3的表達，**P<0.01與NSCLC比較，n=6；B：流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，**P<0.01與NSCLC比較，n=6。

3 討論

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因[1]，其中絕大多數(shù)的肺癌屬于NSCLC[2]。有研究[3]發(fā)現(xiàn)，癌基因突變和DNA甲基化異常與NSCLC密切相關(guān)。作為機體內(nèi)的抑癌基因，轉(zhuǎn)錄因子GATA4可能是NSCLC功能喪失的靶點，且GATA4啟動子甲基化在其中起著關(guān)鍵的作用[12]。

本研究采用MSP法檢測對照細胞與NSCLC細胞中的GATA4啟動子DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)NSCLC細胞中GATA4啟動子甲基化率顯著升高；采用焦磷酸測序進一步檢測GATA4啟動子區(qū)CPG島的甲基化水平，NSCLC組細胞的GATA4啟動子各位點的DNA甲基化水平同樣顯著升高；采用Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)NSCLC細胞中GATA4 mRNA水平明顯降低，說明NSCLC細胞中GATA4啟動子的甲基化可能導(dǎo)致GATA4 mRNA表達降低。由此，推測GATA4啟動子的甲基化可能與NSCLC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

抑制腫瘤細胞的增殖是NSCLC控制和治療的方式之一。HELLEBREKERS等[13]發(fā)現(xiàn)，GATA4的過表達可以抑制一些腫瘤細胞的增殖。同樣，AGNIHOTRI等[14]在惡性膠質(zhì)瘤中的研究發(fā)現(xiàn)，GATA4的缺失使細胞增殖加速，患者病程加速。那么，GATA4是否可以對NSCLC細胞的增殖產(chǎn)生影響?而GATA4啟動子的DNA甲基化是否參與其中?為此，本研究在NSCLC細胞中加入2 μmol·L-1的甲基化抑制劑5-Aza-2′deoxycytidine，培養(yǎng)48 h后，檢測NSCLC細胞的GATA4 mRNA水平，發(fā)現(xiàn)細胞在加入甲基化抑制劑后GATA4的mRNA水平顯著升高；分別在NSCLC細胞中加入不同濃度的甲基化抑制劑5-Aza-2′deoxycytidine，培養(yǎng)24 h后，CCK-8檢測細胞增殖率，發(fā)現(xiàn)隨著抑制劑濃度的變化，細胞的增殖率逐漸降低；檢測細胞中增殖相關(guān)指標PCNA的蛋白表達，發(fā)現(xiàn)甲基化抑制后細胞的增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達水平降低。提示GATA4啟動子甲基化能增加NSCLC細胞的增殖。這與以往的研究[13-14]認為GATA4具有抑癌作用的結(jié)果一致。

NSCLC的控制和治療同樣依賴于NSCLC細胞的凋亡增加，推測在NSCLC中，GATA4啟動子甲基化有可能對肺癌細胞的凋亡產(chǎn)生影響。為了驗證這個假設(shè)，本研究采用Western blot檢測細胞中凋亡指標cleaved-caspase 3和caspase 3的表達，發(fā)現(xiàn)抑制GATA4啟動子甲基化后cleaved-caspase 3/caspase 3的比值增高；采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，同樣發(fā)現(xiàn)抑制GATA4啟動子甲基化后NSCLC細胞凋亡率增加。提示GATA4啟動子甲基化能降低NSCLC細胞的凋亡。GONG等[15]發(fā)現(xiàn)GATA4可以抑制胰腺導(dǎo)管癌增殖和分化，通過促進抑癌基因P53表達，并通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，GATA4調(diào)控基因部分富集在MAPK和JAK-STAT信號通路中。

綜上所述，在NSCLC中，GATA4啟動子DNA的甲基化水平升高，去甲基化減少，從而可能導(dǎo)致GATA4 mRNA表達降低，有可能誘導(dǎo)肺癌細胞的增殖，抑制肺癌細胞的凋亡，從而誘使NSCLC的發(fā)生并促進其發(fā)展。本研究為NSCLC的干預(yù)和治療提供了新的靶點；然而，本課題僅粗略的探究了NSCLC中GATA4啟動子DNA的甲基化與細胞增殖和凋亡的關(guān)系，并未深入探究其具體的機制，因此，將進一步研究GATA4啟動子DNA的甲基化是依靠哪些途徑來促進細胞增殖并抑制細胞凋亡的，從而為今后NSCLC的治療和干預(yù)提供更進一步的理論基礎(chǔ)。