宋曉東,朱學濤,朱立梅,李 偉
妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是指妊娠期間首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的糖代謝異常,可能引起孕婦發(fā)生流產(chǎn)、圍生期酮癥酸中毒、產(chǎn)后出血等多種合并癥,對胎兒也構成極大威脅,可能造成胎兒窘迫、早產(chǎn)、畸形等,孕期行口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test,OGTT)篩查并及時進行干預,可改善妊娠結(jié)局。GDM機制復雜,一般認為與胰島素抵抗(insulin resistance,IR)有關,盡早發(fā)現(xiàn)IR,并采取相關措施進行控制,對于降低GDM發(fā)病風險有重要意義[1-2]。哺乳動物基因組中98%轉(zhuǎn)錄序列不具備蛋白質(zhì)編碼功能,屬于非編碼RNA,其中長度在200個核苷酸以上的為長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA),母系表達基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)、H19均屬于LncRNA。MEG3基因定位于人染色體14q32.3,具高度保守性,已有研究表明其在人胰島β細胞中為高表達,可促進胰島素分泌[3-4]。H19定位于人染色體11p15.5,包含5個外顯子,4個內(nèi)含子,具父系印記特性,選擇性表達母源性等位基因,是最早被鑒定的印跡基因之一,已被報道與IR密切相關[5]。本研究通過探討血漿MEG3、H19水平與GDM患者IR的關系,以期為GDM的發(fā)病機制及臨床防治工作提供參考依據(jù)。
1.1 一般資料選取2016年1月至2019年1月孕24~28周在我院行OGTT并確診為GDM的孕婦65例為GDM組,年齡22~37歲。參照文獻[6]的診斷標準:將75 g葡萄糖溶于250~300 mL水中,受試者在5 min內(nèi)口服完畢,分別采集服用后1 h、2 h靜脈血,檢測血糖水平,滿足以下任何一項即可診斷為GDM:空腹血糖(fasting plasma glucose,F(xiàn)PG)≥5.1 mmol/L,服糖1 h血糖≥10.0 mmol/L,服糖2 h血糖≥8.5 mmol/L。納入標準:①經(jīng)OGTT確診為GDM;②首次、單胎妊娠。排除標準:①曾被診斷為糖尿病者;②多胎妊娠者;③有糖尿病家族史者;④肝、腎等重要器官功能障礙者;⑤臨床資料不完整者。另外選取同期80例孕周為24~28周正常妊娠孕婦為對照組,年齡23~38歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(批號:201511003),所有受試者均自愿簽署知情同意書。
1.2 方法受試者均于清晨抽取5 mL空腹靜脈血。FPG水平采用日立7600型生化分析儀測定,糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin,HbA1c)采用Arkray HA-8180型全自動分析儀(日本)檢測;采用放射免疫法檢測空腹胰島素(fasting insulin,F(xiàn)INS)水平,試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司;采用穩(wěn)態(tài)評估模型評估胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR),HOMA-IR≥2.69即判為IR[7]。計算公式:
HOMA-IR=FPG(mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5
采用qRT-PCR檢測血漿中MEG3、H19水平,儀器為Roche LightCycler 480Ⅱ型熒光定量PCR儀。采用Trizol法提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進行PCR擴增反應。以GAPDH為內(nèi)參基因,MEG3正向引物:5′-ATCATCCGTCCACCTCCTTGTCTTC-3′,反向引物:5′-GTATGAGCATAGCAAAGGTCAGGGC-3′,反應條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40個循環(huán)。H19正向引物:5′-ACAGGAGAGAGACTTCCA-3′,反向引物:5′-ATGTCCTGCTTGTCACGTCC-3′,反應條件:95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán),引物及試劑盒均購于上海生工生物工程有限公司,操作嚴格按照說明書進行,采用2-ΔΔCt法計算MEG3、H19水平。
2.1 一般資料比較2組年齡、BMI比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。GDM組FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均顯著高于對照組(P<0.01)。見表1。
表1 入組孕婦一般資料比較
2.2 血漿MEG3、H19水平比較GDM組血漿MEG3水平顯著低于對照組(P<0.01),H19水平顯著高于對照組(P<0.01),見表2。
表2 入組孕婦血漿MEG3、H19水平比較
2.3 GDM組血漿MEG3、H19水平與FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR相關性分析Spearman相關分析結(jié)果顯示,GDM組血漿MEG3水平與FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均呈負相關(P<0.01),血漿H19水平與FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均呈正相關(P<0.01),見表3。
表3 GDM組血漿MEG3、H19水平與FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR相關性分析
2.4 影響IR發(fā)生的多因素Logistic回歸分析以是否發(fā)生IR為因變量,以MEG3、H19水平為自變量進行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果表明,MEG3是IR發(fā)生的保護因素(P<0.01),H19是危險因素(P<0.01),見表4。
表4 影響胰島素抵抗(IR)發(fā)生的多因素Logistic回歸分析結(jié)果
GDM是妊娠期常見糖代謝異常疾病,是日后患2型糖尿病的高危人群,隨著飲食結(jié)構變化、肥胖及高齡產(chǎn)婦的增加,近年發(fā)生率呈逐漸升高趨勢,我國發(fā)生率約為1%~5%[8]。GDM發(fā)病機制目前尚未闡明,研究發(fā)現(xiàn)發(fā)病原因可能是妊娠期雌激素、生乳素等由胎盤分泌的激素釋放進入母體循環(huán)使全身水平升高,增強了對胰島素的拮抗作用,隨孕周增加胰島素敏感性下降,胰島素分泌受限的孕婦則發(fā)展為GDM[9-11]。胰島β細胞合成分泌的胰島素是機體內(nèi)唯一具有降低血糖功能的蛋白質(zhì)類激素,在維持血糖水平上起決定性作用[4]。IR是指胰島素促進機體攝取及利用葡萄糖能力下降,正常妊娠女性隨著體內(nèi)激素水平變化可表現(xiàn)出生理性、暫時性IR狀態(tài),通常在孕周24~28周表現(xiàn)顯著,于34~36周達到峰值,在分娩后逐漸消失,GDM患者生理性、病理性IR并存[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組比較,GDM組FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均較高,提示GDM患者存在不同程度IR,與上述研究結(jié)果一致。
LncRNA可在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達,參與細胞信號傳導、細胞增殖分化、免疫應答等多種生理活動過程,與腫瘤、代謝性疾病等關系密切,正常生理狀態(tài)下,MEG3在機體組織中為高表達,在腫瘤組織中表達降低或缺失,發(fā)揮抑癌基因作用[13]。近年來LncRNA與IR的關系引起諸多研究者的興趣,LncRNA的作用發(fā)揮具組織特異性,同一種LncRNA在不同組織中對血糖可能發(fā)揮相反調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn),小鼠胰腺組織中MEG3與心、肝、脾等組織相比為高表達,具有組織特異性,抑制MEG3表達后,胰島素分泌量減少,胰島β細胞凋亡增加,與此同時,葡萄糖耐受能力受損,MEG3可能通過參與胰島素的合成及分泌,在維持成年小鼠胰島功能中發(fā)揮重要作用[3-4]。本研究發(fā)現(xiàn),GDM組血漿MEG3水平顯著低于對照組,提示MEG3可能參與GDM患者IR的發(fā)生。分析原因是低水平的MEG3可能通過對胰十二指腸同源盒因子-1肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物A基因表達產(chǎn)生抑制作用,進而使胰島素合成、分泌減少[14]。另有研究表明,MEG3與肝糖異生關系密切,MEG3可通過激活叉頭框蛋白1,增加葡萄糖6磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶表達,從而促進糖異生,減少糖原合成[5]。
H19在胚胎發(fā)育中呈現(xiàn)高表達并在出生后顯著下降,僅在成年人骨骼肌及心肌中觀察到持續(xù)表達,在腫瘤等細胞大量分化疾病中呈現(xiàn)高表達[15]。H19在不同的腫瘤中表達情況各異,在胃癌、宮頸癌、胰腺癌等腫瘤中呈現(xiàn)高表達,發(fā)揮促癌基因作用,在前列腺癌、肝癌等腫瘤中呈現(xiàn)低表達,發(fā)揮抑癌基因特性,H19在不同腫瘤中可能發(fā)揮不同作用,甚至在同一腫瘤中發(fā)揮促癌及抑癌基因的雙重作用[16]。H19與IR的研究越來越受到關注,研究表明,H19在高脂飲食小鼠肝臟中高表達,高水平的H19可促進肝臟產(chǎn)生葡萄糖,進而增加高血糖、IR發(fā)生風險,全身敲除H19可使胰島素抑制肝臟糖異生的作用增強,但也有研究表明,下調(diào)肝臟中H19表達,可使小鼠血糖水平升高,糖耐量受損,糖異生基因表達上調(diào),上述結(jié)論提示H19在肝糖異生中發(fā)揮的作用目前尚不明確[5,17-18]。本研究發(fā)現(xiàn),GDM組血漿H19水平顯著高于對照組,提示H19與IR關系密切。Spearman相關分析結(jié)果顯示,GDM組血漿MEG3、H19水平與FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均具相關性,提示MEG3、H19可能用于評估GDM患者IR嚴重程度。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,MEG3是IR發(fā)生的保護因素,H19是危險因素,可能從危險因素方面防治IR,降低不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。
綜上所述,GDM患者血漿MEG3呈低表達,H19為高表達,且與HOMA-IR具相關性,或可為GDM的靶向治療提供新思路,本研究也存在不足之處,樣本量較少,可能造成結(jié)果偏差,尚需大樣本研究對結(jié)果進行佐證,這將成為今后的工作重點。