蔣超男 ，李燦嬰 ，李伊涵 ，寇程程 ，葛永紅 ，*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121013；2.生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

蘋果（Malus domestica Borkh）屬薔薇科蘋果屬，是世界四大水果之一，在我國具有悠久的栽培歷史，蘋果種類繁多，富含多種抗氧化物質(zhì)，營養(yǎng)價值很高[1]。隨著我國蘋果栽培面積和產(chǎn)量的大幅度增長，加上冷鏈系統(tǒng)的缺乏，采后腐爛損失也越來越大[2]。其中，由擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）侵染引起的青霉病不僅嚴(yán)重影響果實的外觀和品質(zhì)，其次級代謝產(chǎn)物展青霉素還會對人體健康造成危害[3]?；瘜W(xué)殺菌劑是控制果實采后病害的傳統(tǒng)有效方法，但長期使用會誘導(dǎo)病原微生物產(chǎn)生抗藥性，同時會造成環(huán)境污染及果實中的殘留，從而使其應(yīng)用逐漸受到限制[4]。因此，采用安全、有效、綠色的誘抗劑處理激發(fā)果實的自身抗性成為了新的控制技術(shù)之一[5]。

核黃素（Riboflavin）是一種水溶性B 族維生素（VB2），在人體內(nèi)與多種蛋白質(zhì)結(jié)合形成黃素蛋白，參與機(jī)體的能量代謝和多種生物氧化反應(yīng)[6]。核黃素對熱穩(wěn)定，可促進(jìn)作物生長和提高產(chǎn)量、增強(qiáng)作物抗逆能力以及誘導(dǎo)果實抗病性[7]。核黃素處理不僅能提高番茄[8]、煙草[9]、水稻[10]等植物的抗病性，還能夠誘導(dǎo)厚皮甜瓜、葡萄、梨、楊梅等果實的采后抗病性[11-14]。采后核黃素處理可誘導(dǎo)厚皮甜瓜果實苯丙烷代謝途徑增強(qiáng)，提高相關(guān)酶活性并促進(jìn)抗性物質(zhì)的積累，從而強(qiáng)化細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)抵抗病原物的侵染[12]。Boubakri等[13]研究發(fā)現(xiàn)，采后核黃素處理葡萄可誘導(dǎo)過氧化氫的產(chǎn)生。Li 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，核黃素對梨黑斑病的抑制與其對病原菌的直接作用及對果實活性氧和苯丙烷代謝途徑的誘導(dǎo)有關(guān)。但是有關(guān)采后核黃素處理對蘋果侵染性病害控制及其機(jī)制的研究還鮮見報道。

本研究以蘋果為試材，研究采后不同濃度核黃素處理對蘋果果實青霉病的抑制效果，同時探討其對果實活性氧及苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活性和產(chǎn)物積累的影響，以期為核黃素在果蔬貯藏保鮮中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

“金冠”蘋果果實采自錦州市蘋果園，選取大小、果色和成熟度一致、無病蟲害、無機(jī)械損傷的果實，紙箱包裝后運回實驗室進(jìn)行處理。P.expansum 分離自自然發(fā)病的蘋果果實，分離純化并鑒定后于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上保存于采后貯藏保鮮實驗室。妙潔保鮮膜：材質(zhì)為聚乙烯，厚度為0.02 mm。

核黃素，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司產(chǎn)品；交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），天津博迪化工股份有限公司產(chǎn)品；苯丙氨酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；β-巰基乙醇、愈創(chuàng)木酚，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；聚乙二醇，天津市福晨化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。乙二胺四乙酸（EDTA）、四氯化鈦、二硫蘇糖醇、抗壞血酸、氧化型谷胱甘肽、還原性輔酶Ⅱ（NADPH），索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Centrifuge 5424R 型冷凍離心機(jī)，德國艾本德公司；UV-1801 型紫外分光光度計，北京北分瑞利分析儀器（集團(tuán)）有限公司；A 11 型研磨機(jī)，德國IKA 集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 處理方法

蘋果用自來水清洗干凈，挑選無機(jī)械傷、無病蟲害，大小和果色一致的果實，然后將果實分別在核黃素溶液（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L（含 0.01%吐溫20））中浸泡處理10 min，晾干后在相對濕度（RH）55%±5%，溫度(22±1)℃條件下貯藏待用，每處理用果實30 個。

1.2.2 孢子懸浮液的配制

參照鄧惠文等[15]方法，調(diào)整P. expansum 孢子懸浮液使其終濃度為1×105個孢子/mL。

1.2.3 損傷接種

參照Bi 等[16]方法并修改。先用75%乙醇對處理后2 h 的果實表面進(jìn)行消毒，然后在每個果實中部等距離刺4 mm×3 mm 孔4 個，晾干后接種10 μL P.expansum 孢子懸浮液。自然干燥后裝入紙箱并覆蓋聚乙烯薄膜在RH 55%±5%、(22±1)℃條件下貯藏，接種后第3 天觀察果實發(fā)病率，準(zhǔn)確測定病斑直徑。根據(jù)果實接種病斑直徑大小篩選出核黃素處理最佳濃度，用于后續(xù)試驗。

1.2.4 取樣

參照Bi 等[16]方法并修改。采用上述方法分別用0、1.0 mmol/L 的核黃素溶液浸泡處理蘋果果實90個，在處理后 0、2、4、6、8、10、12 d 取蘋果果肉組織（果實中部皮下3~8 mm 處），用液氮迅速冷凍，然后置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.2.5 活性氧和苯丙烷代謝途徑相關(guān)指標(biāo)的測定

1.2.5.1 過氧化氫（H2O2）含量

參照Prochazkova 等[17]的方法并修改。準(zhǔn)確稱取冷凍果肉組織3.0 g，用液氮研磨成粉狀后加入3.0 mL丙酮繼續(xù)研磨成勻漿，然后轉(zhuǎn)入5 mL 離心管低溫離心15 min（9 000 r/min），收集上清液。取上清液2.0 mL，加入50 μL 濃氨水和40 μL 20%四氯化鈦溶液，靜置5 min，待充分反應(yīng)后同等條件下再次離心10 min，用冷丙酮洗滌沉淀物3 次，再將沉淀物溶解于3.0 mL硫酸溶液（1.0 mol/L），在波長410 nm 處測定混合液的吸光值。采用同樣的方法制作H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線，以nmol H2O2/g FW（鮮重）表示H2O2含量。

1.2.5.2 過氧化氫酶（CAT）活性

參照Wang 等[18]的方法并修改。準(zhǔn)確稱取2.0 g 冷凍蘋果果肉組織，用液氮研磨成粉狀后加入2.0 mL 0.1mol/L 磷酸緩沖液（pH7.5，15.0g/LPVPP 和 5.0mmol/L二硫蘇糖醇）繼續(xù)研成勻漿，轉(zhuǎn)入5 mL 離心管然后在9 000 r/min 條件下（4 ℃）離心 20 min。反應(yīng)體系包括3.0 mL H2O2（10 mmol/L）和0.1 mL 粗酶液，反應(yīng)完成后測定240 nm 處吸光值。以每分鐘吸光度變化0.01為1 U，用U/g FW 表示CAT 活性。

1.2.5.3 抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性

參照Ren 等[19]的方法并修改。取冷凍蘋果果肉組織3.0 g，冰浴條件下加入3.0 mL 含1.0 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）的磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.5）研成勻漿，然后轉(zhuǎn)入5 mL 離心管低溫離心20 min（9 000 r/min），留上清液備用。取0.2 mL 粗酶液，加入0.5 mmol/L H2O20.5 mL、3.0 mmol/L 抗壞血酸 0.8 mL、0.1 mol/L 磷酸緩沖液2.0 mL。充分反應(yīng)后測定混合液在290 nm 處的吸光值。用每分鐘OD 值變化0.01為1 U，APX 活性表示為U/g FW。

1.2.5.4 谷胱甘肽還原酶（GR）活性

參照Ren 等[19]的方法并修改。冰浴下取0.1 mol/L pH 7.5 含1.0 mmol/L EDTA 預(yù)冷的磷酸緩沖液4.0 mL加入3.0 g 冷凍蘋果果肉組織后充分研磨成勻漿，然后離心 20 min 得到上清液（9 000 r/min，4 ℃）。取0.2 mL 粗酶液，加入50 mmol/L 氧化型谷胱甘肽（GSSG）100 μL、pH 7.5 的 0.1 mol/L 磷酸緩沖液 3.0 mL、0.03 mol/L 還原性輔酶Ⅱ（NADPH）30 μL，反應(yīng) 15 s后連續(xù)測定2 min 在340 nm 處的吸光度值。以每分鐘OD 值變化0.01 為1 U，GR 活性表示為U/g FW。

1.2.5.5 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性

參考Assis 等[20]的方法并修改。冰浴條件下用3.0 mL、0.1 mol/L 硼酸緩沖液（pH 8.8，內(nèi)含 10.0 g/L PVPP，50 mmol/L β-巰基乙醇和 1.0 mmol/L EDTA）充分研磨2.0g 冷凍果肉組織。離心勻漿12min（11000r/min，4 ℃）得上清液。取 500 μL 粗酶液，加入 3 mL 蒸餾水和0.5 mL 0.02 mol/L 苯丙氨酸充分反應(yīng)后，測定290 nm 處吸光度值。同樣反應(yīng)體系于30 ℃水浴保溫條件下反應(yīng)30 min，然后再次測定290 nm 處吸光度值。PAL 活性表示為U/g FW，U 表示每小時吸光度變化0.01。

1.2.5.6 過氧化物酶（POD）活性

參考葛永紅等[21]的方法測定。以每分鐘OD 值變化0.01 為1 U，POD 的活性表示為U/g FW。

1.2.5.7 總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量

參考Ge 等[22]的方法測定?？偡雍皖慄S酮含量分別用OD280/g FW 和OD325/g FW 表示，木質(zhì)素含量用OD280/g FW 表示。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

所有指標(biāo)測定進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，全部數(shù)據(jù)平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤差用Microsoft Excel 2007 計算并作圖，采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核黃素處理對損傷接種蘋果果實病斑直徑的影響

由圖1 可知，接種P.expansum 后第3 天，對照和核黃素處理果實全部發(fā)病，且不同濃度核黃素處理均顯著降低了果實病斑直徑，但并未表現(xiàn)出濃度依賴性，其中以1.0 mmol/L 核黃素處理蘋果果實的病斑直徑最小。因此，選擇1.0 mmol/L 核黃素處理果實用于后續(xù)生理生化指標(biāo)分析。

圖1 采后不同濃度核黃素處理對損傷接種P.expansum 蘋果果實病斑直徑的影響Fig.1 Effects of postharvest riboflavin treatments with different concentrations on lesion diameter of apple fruits inoculated with P.expansum

2.2 核黃素處理對蘋果果實H2O2 含量的影響

H2O2含量增加可直接抵御病原物的侵染，也可作為信號分子觸發(fā)果實防御反應(yīng)，增強(qiáng)果實抗病性。由圖2 可見，對照和核黃素處理蘋果果實中H2O2含量貯藏0~12 d 呈先升高后下降的趨勢，二者均在4 d和8 d 出現(xiàn)峰值，但對照果實H2O2含量在貯藏2~10 d顯著低于核黃素處理果實（P＜0.05），且二者H2O2的含量在貯藏第8 天差異最大，核黃素處理果實H2O2含量為對照果實的1.17 倍。

圖2 采后核黃素處理對蘋果果實H2O2 含量的影響Fig.2 Effects of postharvest riboflavin treatment on H2O2 contents in apple fruits

2.3 核黃素處理對蘋果果實CAT 活性的影響

CAT 能夠分解 H2O2為 H2O 和 O2，有效降低過量積累的H2O2對細(xì)胞的傷害。由圖3 可知，貯藏0~8 d對照蘋果果實CAT 活性變化不大，貯藏8~12 d 略有下降，而在貯藏0~12 d 核黃素處理果實CAT 活性呈雙峰變化趨勢，且在貯藏2~12 d 核黃素處理果實CAT 活性顯著高于對照（P＜0.05）。

圖3 采后核黃素處理對蘋果果實CAT 活性的影響Fig.3 Effects of postharvest riboflavin treatment on CAT activities in apple fruits

2.4 核黃素處理對蘋果果實APX 活性的影響

APX 主要通過抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)清除貯藏后期大量產(chǎn)生的H2O2，以此降低H2O2對寄主細(xì)胞的傷害。由圖4 可見，核黃素處理和對照蘋果果實APX 活性在貯藏0~12 d 整體呈先上升后下降的趨勢，核黃素處理果實APX 活性在貯藏第6 天出現(xiàn)峰值，而對照峰值在第8 天出現(xiàn)，且核黃素處理果實中APX 活性在貯藏4~12 d 顯著高于對照（P＜0.05）。

圖4 采后核黃素處理對蘋果果實APX 活性的影響Fig.4 Effects of postharvest riboflavin treatment on APX activities in apple fruits

2.5 核黃素處理對蘋果果實GR 活性的影響

GR 活性的增強(qiáng)有利于維持AsA-GSH 循環(huán)中GSH 的平衡，從而維持寄主體內(nèi)的活性氧代謝平衡。由圖5 可以看出，核黃素處理蘋果果實GR 活性在貯藏0~12 d 呈現(xiàn)出較為明顯的雙峰變化趨勢，但對照果實僅出現(xiàn)一個活性高峰，核黃素處理果實GR 活性在貯藏第2 天和8~12 d 顯著高于對照（P＜0.05）。核黃素處理和對照果實GR 活性差異最大值出現(xiàn)在貯藏第10 天，核黃素處理果實GR 活性為對照果實的1.50 倍。

圖5 采后核黃素處理對蘋果果實GR 活性的影響Fig.5 Effects of postharvest riboflavin treatment on GR activities in apple fruits

2.6 核黃素處理對蘋果果實PAL 和POD 活性的影響

果實抗病能力的強(qiáng)弱與PAL 和POD 活性高低有緊密聯(lián)系，PAL 和POD 能夠調(diào)控類黃酮、酚類、木質(zhì)素等一些植物抗菌性物質(zhì)的積累。如圖6 所示，核黃素處理和對照蘋果果實PAL 和POD 活性貯藏0~12 d 整體呈先上升后下降的變化趨勢。貯藏4~10 d核黃素處理果實PAL 活性顯著高于對照（P＜0.05），且在貯藏第4 天二者PAL 活性均出現(xiàn)峰值，核黃素處理為對照的1.24 倍。貯藏第8 天核黃素處理果實POD 活性出現(xiàn)高峰，而對照果實POD 活性高峰在貯藏第10 天出現(xiàn)，在貯藏第2 天和6~12 d 核黃素處理POD 活性顯著高于對照果實（P＜0.05）。

圖6 采后核黃素處理對蘋果果實PAL（A）和POD（B）活性的影響Fig.6 Effects of postharvest riboflavin treatment on PAL(A)and POD(B)activities in apple fruits

2.7 核黃素處理對蘋果果實總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量的影響

酚類物質(zhì)和類黃酮具有直接的抑菌作用，而木質(zhì)素含量的提升能有效增強(qiáng)細(xì)胞壁厚度進(jìn)而提高抵抗病原物的能力。由圖7A 可見，核黃素處理和對照蘋果果實中總酚含量在貯藏0~12 d 整體呈先升高后緩慢降低趨勢，核黃素處理果實總酚含量在貯藏6~12 d顯著高于對照果實（P＜0.05），二者總酚含量均在貯藏第8 天達(dá)到最高，此時核黃素處理果實總酚含量是對照果實的1.19 倍。由圖7B 可見，核黃素處理和對照蘋果果實類黃酮含量變化趨勢與總酚含量變化趨勢相類似，核黃素處理果實類黃酮含量貯藏6~12 d顯著高于對照（P＜0.05），分別是對照果實的1.32、1.38、1.50 和1.44 倍。由圖7C 可見，對照蘋果果實木質(zhì)素含量在貯藏期間整體變化不大，但核黃素處理果實木質(zhì)素含量在貯藏2~12 d 顯著高于對照（P＜0.05），且在貯藏第8天出現(xiàn)峰值，是對照果實的1.34 倍。

3 討論與結(jié)論

圖7 采后核黃素處理對蘋果果實總酚（A）、類黃酮（B）和木質(zhì)素（C）含量的影響Fig.7 Effects of postharvest riboflavin treatment on the contents of total phenols(A)，flavonoids(B)and lignins(C)in apple fruits

本研究發(fā)現(xiàn)，0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L 核黃素處理能夠有效抑制損傷接種P. expansum 蘋果果實病斑擴(kuò)展，但并未表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，其中以1.0 mmol/L 核黃素處理的蘋果果實抑制效果最為明顯，說明核黃素處理抑制病斑直徑不是濃度依賴性，而是達(dá)到一定濃度可有效增強(qiáng)果實抗病性。李燦嬰等[12]研究發(fā)現(xiàn)，核黃素處理可增強(qiáng)厚皮甜瓜果實對粉霉病和黑斑病的抗性，并且未表現(xiàn)出濃度依賴性。Li等[14]研究也發(fā)現(xiàn)1.0 mmol/L 核黃素處理可顯著提高梨果實對黑斑病的抗性，也未表現(xiàn)出濃度依賴性。由此表明，用一定濃度的核黃素處理具有誘導(dǎo)果實抗病性的作用，更高濃度并沒有明顯的增強(qiáng)作用。

植物體內(nèi)活性氧在正常生理狀態(tài)下保持一種動態(tài)平衡，當(dāng)受到外界病原物侵染或激發(fā)子處理時，活性氧在細(xì)胞內(nèi)被迅速大量積累，從而影響細(xì)胞的成分和功能[23]。H2O2是比較穩(wěn)定且具有重要功能的一種活性氧，不僅對病原生物有直接殺滅的作用，也是一種信號分子用來啟動寄主多種防衛(wèi)反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，采后1.0 mmol/L 核黃素處理顯著提高了蘋果果實H2O2含量。果實中H2O2的前期積累，有利于啟動防衛(wèi)反應(yīng)，同時也參與木質(zhì)素的生物合成過程。已有研究表明，核黃素處理厚皮甜瓜和梨果實均能提高果實H2O2含量，提高其抗病性[7，14]。由此說明，誘導(dǎo) H2O2的積累是核黃素誘導(dǎo)果實產(chǎn)生抗病性的機(jī)理之一。然而，過量產(chǎn)生的H2O2會破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和成分，從而導(dǎo)致功能紊亂。細(xì)胞通過自身的酶促或非酶促抗氧化系統(tǒng)維持活性氧的平衡，從而降低其對自身的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，1.0 mmol/L 核黃素處理提高了蘋果果實中CAT、APX 和GR 活性。CAT 是生物體內(nèi)一種關(guān)鍵的抗氧化酶，能夠?qū)2O2分解為H2O 和O2[24]。APX通過AsA-GSH 循環(huán)分解H2O2，清除細(xì)胞中產(chǎn)生的過量H2O2[23]，而GR 主要是保持AsA-GSH 循環(huán)中GSH的平衡，維持寄主體內(nèi)的活性氧代謝水平[25]。Li 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，采后核黃素處理誘導(dǎo)了梨果實中O2和H2O2的積累，且提高了CAT 活性。李燦嬰等[7]在厚皮甜瓜果實中的研究也表明，采后用核黃素可誘導(dǎo)果實CAT、APX 和GR 活性提高，從而提高果實對粉霉病和黑斑病的抗性。由此說明，核黃素處理蘋果可通過激活貯藏初期果實中H2O2的大量積累，而后期通過提高CAT 和AsA-GSH 循環(huán)中關(guān)鍵酶活性清除過量的H2O2，以此降低對寄主細(xì)胞的傷害。

苯丙烷代謝是植物次生代謝的主要途徑，通過該途徑產(chǎn)生的酚類、黃酮類、生物堿、木質(zhì)素等在抗病性過程中具有重要作用[26]。PAL 是苯丙烷代謝途徑的限速酶，能夠調(diào)控主要抗菌物質(zhì)的積累，因而常用作植物抗病性指標(biāo)[15，27]。POD 是苯丙烷代謝途徑的末端氧化酶，可通過催化酚酸類物質(zhì)的聚合以及木質(zhì)素的合成來加固細(xì)胞壁，從而增強(qiáng)對病原物侵染的抵抗能力[15]。此外，POD 可與CAT 協(xié)同作用，有效清除寄主體內(nèi)可對細(xì)胞產(chǎn)生毒害的過量活性氧，減少對果實的傷害[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，1.0 mmol/L 核黃素處理誘導(dǎo)了蘋果果實中PAL 和POD 活性，從而促進(jìn)酚類、類黃酮和木質(zhì)素的積累。果實中酚類化合物有直接抑制病原微生物孢子萌發(fā)和菌絲生長的作用，也是合成具有抗性作用木質(zhì)素等物質(zhì)的前體。類黃酮在一定程度上限制了進(jìn)入寄主體內(nèi)病原微生物的擴(kuò)展過程從而降低微生物活性。木質(zhì)素沉積在細(xì)胞壁上可提高組織的機(jī)械強(qiáng)度，是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的主要成分[29]。已有研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖復(fù)合多聚賴氨酸、茉莉酸甲酯、核黃素處理分別提高了蘋果[23]、厚皮甜瓜[12]、梨[14]果實 PAL 和POD 活性并增加總酚、類黃酮、木質(zhì)素的含量，從而增強(qiáng)果實抗病性。由此說明，采后核黃素處理激活了蘋果果實中苯丙烷代謝途徑，提高了關(guān)鍵酶的活性并促進(jìn)了抗菌產(chǎn)物的積累，從而提高果實的抗病性。

總之，采后核黃素處理對蘋果果實損傷接種P. expansum 病斑直徑的擴(kuò)展具有顯著抑制作用，并且提高了蘋果果實H2O2含量以及CAT、APX 和GR活性，此外，PAL 和POD 活性升高，總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量得到積累。由此說明，核黃素處理可通過激活活性氧代謝和苯丙烷代謝途徑來有效降低蘋果青霉病發(fā)生。