杜 波,李 賀,羅周正,馬玉霞,劉文新,趙 地,吳 瑩,郭 勇,田曉東
HIV-1為反轉錄病毒屬正鏈RNA病毒,由于病毒復制過程缺少校對功能,具有高度變異性。HIV-1除少數為N組和O組外,大部分屬于M組,而M組又可分為9個亞型和102個重組亞型[1-2]。隨著基因測序技術的進步,越來越多的HIV基因組得到測序,這為分析HIV亞型、流行趨勢、分子溯源提供基礎數據,也對制定有效的艾滋病防治措施提供科學依據[3-5]。HIV-1亞型中,G亞型主要分布于西非和歐洲,其感染者只占全球感染者的4.6%;但G亞型出現時間較長,隨著病毒的變異和重組,G亞型與HIV-1其他亞型重組產生的重組亞型廣泛流行。例如,重組亞型CRF02_AG就是由HIV-1 A亞型和G亞型重組而成,CRF02_AG重組亞型感染者占全球感染者的7.7%[6]。
阜新地區(qū)流行的HIV-1毒株亞型呈現復雜趨勢。2009年以前,主要以B亞型感染為主;2009年以后,以CRF01_AE亞型感染居多,亞型種類包括B亞型、CRF07_BC亞型和CRF65_cpx亞型,但之前本地區(qū)未發(fā)現過G亞型。在2019年的艾滋病監(jiān)測中,首次監(jiān)測到本地區(qū)有1例輸入性HIV-1 G亞型感染者,本文對其體內的HIV-1基因組進行序列測定和進化分析,為本病例病毒溯源提供依據,也為本地區(qū)HIV-1流行趨勢提供預測。現報道如下。
1.1 對象 本病例來自阜新市衛(wèi)生健康服務中心(阜新市疾病預防控制中心)艾滋病監(jiān)測人群,為艾滋病WHO臨床分期I期的尼日利亞來華人員,血清樣本編號FX2019042,經ELISA、膠體金篩查和免疫印跡確證試驗確認為HIV-1抗體陽性。在確?;颊咧橥獾那疤嵯?,采集患者血清2 ml,凍存于-70 ℃冰箱備用。
1.2 HIV-1 RNA提取 采用RNA病毒提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN公司,貨號52904)提取血清樣品中的HIV-1 RNA,具體操作嚴格按照說明書進行。提取的RNA凍存于-70 ℃冰箱備用。
1.3 HIV-1 RT-PCR擴增 由于樣本珍貴,先將病毒RNA反轉錄為cDNA,再以cDNA為模板,進行兩輪PCR,最后進行測序。反轉錄反應按照試劑盒說明書進行。反應過程簡述如下。RT-PCR反應體系總體積50 μl,體系成分包括:1 μl反轉錄酶(0.5 U/μl)、25 μl 2× 緩沖溶液,10 μl模板RNA,5 μl隨機引物及 2 μl dNTP,用水補足至50 μl。反轉錄反應條件為 50 ℃溫育50 min,85 ℃5 min終止反應。用2×Taq PCR Master Mix試劑盒(日本TaKaRa公司)進行第一輪PCR擴增,其PCR產物為近似全長基因組,上游引物為UFA,下游引物為URB。PCR反應體系總體積50 μl,體系成分包括:25 μl 2×Taq PCR Master Mix混合液、2 μl cDNA 模板、2 μl上下游引物(10 μmol/L),用水補足至 50 μl。PCR反應條件如下:95 ℃ 10 min;95 ℃ 60 s,55 ℃ 60 s,70 ℃ 10 min,進行 40 個循環(huán);終延伸72 ℃ 10 min。用2×Taq PCR Master Mix試劑盒(日本TaKaRa公司)進行第二輪巢式PCR擴增,反應體系和條件同第一輪PCR反應。所有引物序列見表1。
表1 RT-PCR 引物序列表Table 1 Sequence of RT-PCR primers
1.4 PCR產物的純化和測序 PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,對目的條帶切膠回收,使用QIAGEN公司(德國)QIAquick Gel Extraction Kit對切膠產物進行純化,純化后的產物委托Invitrigen公司進行DNA測序。
1.5 序列分析 用Chromas軟件查看測序序列峰圖,序列編輯使用Sequencher 4.0軟件,最后用BioEdit 6.1軟件對序列進行拼接,基因位置的繪圖和分析采用HIV Sequence Locator軟件。從HIV Database (https://www.hiv.lanl.gov)下載HIV-1各亞型參考毒株基因組序列,使用MEGA 6.0軟件構建Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹,計算參數設定為Bootstrap值500次。在GenBank中下載所有G亞型基因組序列,利用NCBI BLAST在線比對G亞型各基因與本研究毒株各基因相似度。對獲得的基因組序列,使用RIP 3.0軟件進行基因重組分析,并將序列中env基因C2V3區(qū)序列應用Gene Cutter軟件搜索并翻譯為氨基酸序列。所得到的氨基酸序列使用Geno2pheno軟件進行輔助受體預測,輔助受體判定標準:假陽性率<5%判定為病毒使用趨化性細胞因子受體4(chemokine cysteine-X-cysteine motif receptor 4,CXCR4)為輔助受體;5%~15%判定為趨化性細胞因子受體5(chemokine cysteinecysteine motif receptor 5,CCR5)/CXCR4雙嗜性輔助受體;>15%判定為CCR5為輔助受體。
1.6 統(tǒng)計學處理 采用EpiData 3.1 軟件錄入數據,采用SPSS 23.0 軟件對數據進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示。
2.1 近似全長基因組分析 經過測序,所獲得的7個片段經拼接后,序列全長為8695 bp?;蚪M中,4種堿基分別為:3199A、1491C、2071G、1934T,嘌呤(A+G)占 60.6%(5270/8695),毒株符合反轉錄病毒基因組堿基組成特征,將此毒株編號為FX2019042。經HIV Sequence Locator軟件分析,FX2019042 從 5′-3′分 別 為 gag、pol、vif、vpr、tat、vpu、env、rev和 nef共 9個基因,參照HIV-1標準毒株HXB2,FX2019042毒株的序列位置見圖1。
圖1 FX2019042毒株基因序列位置圖Figure 1 FX2019042 strain gene sequence location map
2.2 系統(tǒng)進化分析 在HIV Database中下載A~D、F~H、J~K各亞型及其常見重組亞型的參考株全長序列,使用Kimura2-parameter模型,繪制Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹(見圖2)。FX2019042毒株與G亞型參考株G.KE.1993.HH8793基因離散率為9.96%,并與其他G亞型參考株親緣關系相近,Bootstrap值為98%,提示該毒株為G亞型毒株。
圖2 FX2019042毒株與各亞型參考株全長序列進化分析★.FX2019042毒株Figure 2 Full-length sequence phylogenetic tree of FX2019042 and reference strains of each subtype
為了在分子生物學上進一步確定FX2019042毒株的來源,將GenBank中6株國內G亞型毒株和17株國外G亞型毒株與FX2019042一起繪制進化樹。結果顯示,我國的G亞型呈散在分布,FX2019042毒株與尼日利亞流行株G.NG.1995.NG1937.AF069937親緣關系最近,基因離散率為8.95%(見圖3)。GenBank中G亞型HIV基因組序列共142條,將FX2019042毒株的3個結構基因和6個非結構基因序列分別與G亞型HIV基因組中各基因比對,獲得相似度分值,基因序列相似度比較結果見表2。結果顯示,FX2019042毒株發(fā)生變異最大的主要基因為結構基因env和非結構基因tat。
圖3 FX2019042毒株與G亞型參考株進化分析★.FX2019042毒株;●.與FX2019042毒株親緣關系最近的G亞型毒株;△.國外G亞型毒株;▲.國內G亞型毒株Figure 3 Phylogenetic tree of FX2019042 strain and subtype G reference strain
表2 FX2019042毒株各基因與G亞型各基因序列相似度比較Table 2 Comparison of sequence similarity between each gene of FX2019042 strain and each gene of G subtype
2.3 基因重組分析 為了檢測FX2019042毒株基因組是否存在重組片段,我們使用在線軟件RIP3.0對FX2019042毒株進行重組分析,參數設置:windowsize=400,confidence threshold=90%,gapoption=3,multistate characters=yes。FX2019042毒株基因組序列重組分析結果見圖4。結果顯示,未發(fā)現FX2019042毒株基因組序列與HIV-1的A~D、F~H、J~K的9個亞型發(fā)生重組,提示該毒株為純粹的HIV-1 G亞型毒株。
圖4 FX2019042毒株基因重組分析X軸表示序列在移動的窗口中心的位置;Y軸表示與參考毒株相似程度Figure 4 Analysis of FX2019042 strain gene recombination
2.4 糖蛋白GP120分析 GP120的糖基化過程對于蛋白質的折疊至關重要,在HIV感染人體T淋巴細胞過程中,GP120通過糖基化使病毒吸附于T淋巴細胞,而且HIV可以利用糖基來阻塞抗體表位而逃避人體免疫系統(tǒng)。含511個氨基酸的GP120中,V1~V5為可變區(qū),C1~C5為恒定區(qū)。對FX2019042毒株的GP120的可變區(qū)和糖基化程度進行分析,結果顯示FX2019042毒株V3區(qū)有1個氨基酸缺失,在GP120區(qū)域共有25個糖基化位點,但其中8個位點因多糖空洞而導致糖基化位點缺失(見圖5)。在輔助受體方面,對V3區(qū)關鍵氨基酸的分析顯示,FX2019042毒株V3區(qū)氨基酸序列為CVRPNNNTRRSIHFGPGQA IYTTGIIGDIRQAHC,預測此毒株利用 CCR5作為輔助受體。
圖5 FX2019042毒株GP120糖基化位點預測黃色部分代表缺失的糖基化位點Figure 5 Prediction of GP120 glycosylation sites of FX2019042 strain
HIV-1 G亞型為古老的HIV-1亞型,在全球的流行分布極不平衡,主要集中在西非的尼日利亞和喀麥隆等地區(qū)。而G亞型與其他亞型重組形成的重組亞型則廣泛分布[6-7],在我國常見的為CRF02_AG流行重組型,在世界范圍內,雖然G亞型感染者只占全部HIV-1感染者的5.0%,但CRF02_AG感染者占全部HIV-1感染者的7.7%。在G亞型的發(fā)源地西非地區(qū),67%的HIV-1感染者中能檢測到G亞型基因片段[7],可見G亞型毒株極易與其他毒株發(fā)生重組并獲得傳播優(yōu)勢,需要加強對本地區(qū)的HIV流行株嚴密監(jiān)測,防止新型重組毒株的出現及流行。
我國發(fā)現的HIV-1 G亞型毒株較少,僅重慶、上海和廣西有相關報道[3,8-9]。我國在重慶市首次檢測到G亞型毒株[8],根據HIV傳統(tǒng)分型基因env,鑒定為G亞型,但是由于只測序了env基因的686 bp,無法排除此毒株為CRF02_AG重組亞型的可能[3,9]。在2019年的艾滋病監(jiān)測中,本課題組發(fā)現了1例HIV-1 G亞型毒株,對其進行基因組測序,RIP 3.0軟件分析顯示FX2019042為純G亞型,構建的系統(tǒng)進化樹顯示FX2019042毒株與尼日利亞毒株親緣關系最近,與在廣西等地發(fā)現的G亞型毒株親緣關系較近[3,10],但與上海分離株sh52親緣關系較遠,推測FX2019042毒株為境外輸入型毒株。
HIV-1感染人體細胞除了需要與CD4+T淋巴細胞受體結合外,還需要env基因編碼的輔助受體CCR5和CXCR4[1,11-12]。這兩種受體為HIV-1進入人體細胞的主要輔助受體,在艾滋病不同時期HIV-1使用的輔助受體不同,在HIV-1感染早期,體內病毒準種常以CCR5為輔助受體,隨著病情進展,病毒利用的輔助受體向CXCR4過渡,在感染晚期則利用CXCR4輔助受體[1,3-15]。由于GP120的糖基化過程對于HIV-1感染細胞至關重要,而且HIV可以利用糖基來阻塞抗體表位而逃避機體免疫功能[12,15],所以本研究在基因序列分析基礎上,對FX2019042毒株的GP120可變區(qū)和糖基化程度進行分析,結果顯示,FX2019042毒株準種進入CD4+T淋巴細胞時利用的輔助受體為CCR5,這與該患者病程為艾滋病發(fā)病早期相符。
綜上,本研究對艾滋病監(jiān)測獲得的HIV-1 G亞型近似全長基因組序列進行研究,從分子流行病學角度證實該毒株為境外輸入型毒株,這與該感染者流行病學史相符。此毒株序列的測定和分析對于本地區(qū)HIV流行趨勢和HIV毒株多樣性研究均具有重要意義,提示我們需加強艾滋病監(jiān)測,防止境外毒株與本地毒株發(fā)生重組和流行。