盧桂蓉，王應(yīng)軍，范子奇

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，成都 611130

銅綠微囊藻是引起我國(guó)湖泊藍(lán)藻水華的優(yōu)勢(shì)藻種之一，其大量增殖會(huì)釋放危害人體健康的藻毒素[1]，并破壞自然生態(tài)系統(tǒng)[2]。氮、磷是易限制藻類(lèi)生長(zhǎng)的元素[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在貧營(yíng)養(yǎng)湖泊中，少量的稀土能作為藍(lán)藻細(xì)胞的一種營(yíng)養(yǎng)元素被利用與儲(chǔ)存，并對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)和生理活性產(chǎn)生影響，稀土的輸入是引起低營(yíng)養(yǎng)水體發(fā)生“水華”現(xiàn)象的原因之一[4-5]，因此，有研究開(kāi)始關(guān)注稀土元素能否取代氮、磷，進(jìn)而引發(fā)貧營(yíng)養(yǎng)水體向富營(yíng)養(yǎng)方向發(fā)展[6]。

如今，稀土元素的優(yōu)質(zhì)功能不斷被挖掘，導(dǎo)致市場(chǎng)需求量急劇增加，稀土礦山挖采過(guò)程中產(chǎn)生的廢水會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染。在詹鴻峰等[7]對(duì)某地區(qū)離子型稀土礦礦山廢水的調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，該礦山廢水中含有較多的鑭(La)、釹、鐠和釔等稀土元素，其含量分別可達(dá)0.70、0.15、0.25和0.14 mg·L-1。而La作為稀土中含量第二豐富的元素，因其獨(dú)特的物化性質(zhì)被廣泛應(yīng)用，使得大量的La從原礦區(qū)逐漸轉(zhuǎn)移至其他區(qū)域環(huán)境，以枯水期長(zhǎng)江部分流域?yàn)槔?，其含量達(dá)到0.1 mg·L-1[8]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)世界淡水中含量的平均水平，且含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，因此，在自然水體中存在高濃度La的可能性也逐漸增加。

但是，目前關(guān)于稀土對(duì)水生植物影響的研究較少，已有實(shí)驗(yàn)表明La3+能提高植物葉綠素含量、促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收、刺激幼苗的萌發(fā)生長(zhǎng)[9]，增強(qiáng)植物在逆境下的抗逆性[10-11]。根據(jù)物化性質(zhì)可把稀土元素分為輕、重2種稀土。其中，杜金戈等[12]研究證明重稀土釔對(duì)缺N或P脅迫影響下的銅綠微囊藻有明顯的“Hormesis”效應(yīng)[13]，而La作為一種輕稀土，在營(yíng)養(yǎng)元素限制的條件下，對(duì)銅綠微囊藻是否有類(lèi)似的影響機(jī)制，目前尚無(wú)清楚的認(rèn)知。因此，本實(shí)驗(yàn)以缺N、缺P(pán)脅迫的實(shí)驗(yàn)條件模擬貧營(yíng)養(yǎng)水體，測(cè)定不同濃度La3+對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)量及抗氧化酶活性等生理指標(biāo)的影響，進(jìn)一步研究輕稀土元素La對(duì)貧營(yíng)養(yǎng)水體發(fā)生富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象的影響及作用機(jī)制，并為潛在的稀土污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)及預(yù)測(cè)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 受試藻種與鑭貯備液的配制1.1.1 受試藻種

本實(shí)驗(yàn)所使用的藻種是銅綠微囊藻FACHB912，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所藻種庫(kù)(FACHB)，此株系從太湖中經(jīng)過(guò)分離、純化后獲得。在藻種購(gòu)得后，用BG-11培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)培，并將培養(yǎng)的光照度設(shè)置為2 000～2 500 lx，溫度為(25±0.5) ℃，光暗比為12 h∶12 h。

1.1.2 鑭貯備液

稱(chēng)取0.5888 g La2O3(AR，成都恒瑞新材料有限公司)，再加入少量的超純水以及濃鹽酸(AR)并進(jìn)行加熱溶解，當(dāng)鹽酸充分揮發(fā)后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶用超純水定容至刻度線(xiàn)，再移取1 mL定容后的溶液至1 000 mL容量瓶中用超純水定容，得到濃度為5 mg·L-1的La3+溶液，將貯備液經(jīng)蒸汽高壓滅菌后備用。

1.2 藻類(lèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)與指標(biāo)測(cè)定1.2.1 藻類(lèi)培養(yǎng)

當(dāng)銅綠微囊藻處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，取一定量的藻液，經(jīng)5 000 r·min-1離心10 min后收集藻細(xì)胞，分別用不含P、不含N以及不含N、P的BG-11培養(yǎng)基洗滌4次后，重新接種到新的缺P(pán)、缺N以及同時(shí)缺N、P的BG-11培養(yǎng)基中；再取適量藻液重新接種到含有N、P元素的BG-11培養(yǎng)基中(對(duì)照組),將所有組的藻密度均調(diào)為1.2×106cells·mL-1。在無(wú)菌環(huán)境下，分別向錐形瓶中加入500 mL含藻的缺P(pán)的BG-11培養(yǎng)基、缺N的BG-11培養(yǎng)基、缺N、P的BG-11培養(yǎng)基、正常BG-11培養(yǎng)基，再分別加入0、2.5、5、12.5和25 mL La3+儲(chǔ)備液，使各錐形瓶中La3+濃度分別為0、0.10、0.20、0.50和1.00 mg·L-1，并分別設(shè)置3個(gè)平行。將接種后的培養(yǎng)基均置于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16 d，培養(yǎng)條件與擴(kuò)培條件相同。在同時(shí)缺N、P組中，銅綠微囊藻不能正常生長(zhǎng)，后續(xù)指標(biāo)均未測(cè)量。

1.2.2 藻密度測(cè)定

采用分光光度法測(cè)定銅綠微囊藻數(shù)量，每天定時(shí)取3 mL藻液，在波長(zhǎng)為680 nm處測(cè)定其吸光度，再通過(guò)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)換算出培養(yǎng)液中藻細(xì)胞的濃度[14]。

1.2.3 葉綠素a含量的測(cè)定

采用丙酮萃取法[15]。在實(shí)驗(yàn)的第4、8、12和16天，從培養(yǎng)基中取10 mL藻液，經(jīng)5 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，再加入5 mL 90%丙酮，搖勻后在溫度為4 ℃下避光萃取24 h，再經(jīng)5 000 r·min-1離心10 min，取上清液，用90%的丙酮作參照，分別在波長(zhǎng)630、645、663和750 nm處測(cè)定其吸光度，并按以下公式計(jì)算葉綠素a含量[16]。

式中：V1為提取液體積(mL)；V2為藻液體積(mL)；ρ為藻細(xì)胞密度(cells·mL-1)；Chla為葉綠素a含量(μg·(108cells)-1)。

1.2.4 粗酶液的提取

在實(shí)驗(yàn)的第4、8、12和16天取10 mL藻液，10 000 r·min-1離心10 min，收集藻細(xì)胞，加0.05 mg·L-1、pH為7.8的磷酸緩沖液1.5 mL，并于液氮內(nèi)反復(fù)凍融5次后用勻漿器研磨5 min，然后在4 ℃下40 000 r·min-1離心10 min，所得上清液即為粗酶液。

1.2.5 可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性、丙二醛含量和可溶性糖的測(cè)定

取由實(shí)驗(yàn)1.2.4所提取的粗酶液，以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白含量[17]，以愈創(chuàng)木酚法[18]測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)活性，以鉬酸銨比色法[19]測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)活性，以硫代巴比妥酸TBA比色法[20]測(cè)定丙二醛(MDA)含量，以蒽酮硫酸比色法[21]測(cè)定可溶性糖含量。以上指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所測(cè)試盒測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果采用Origin2019軟件進(jìn)行處理和繪圖，同時(shí)，使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析及檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05差異顯著。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 La3+對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)量的影響

由圖1可知，在對(duì)照組中，培養(yǎng)初期藻細(xì)胞處于適應(yīng)階段，生長(zhǎng)差異不明顯，第10天藻細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。藻的生長(zhǎng)量總體高于缺N和缺P(pán)這2組，可知N、P元素的缺乏會(huì)對(duì)藻類(lèi)的正常生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響[22]。當(dāng)La3+濃度在0～1.00 mg·L-1范圍內(nèi)，銅綠微囊藻生長(zhǎng)量隨La3+濃度增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，均表現(xiàn)為促進(jìn)作用。在La3+濃度為0.50 mg·L-1時(shí)，La3+對(duì)銅綠微囊藻的刺激作用達(dá)到最大，藻細(xì)胞的增長(zhǎng)幅度明顯高于不加稀土La3+的空白組(P<0.01)，在第16天達(dá)到最大生物量1.77×105cells·mL-1，比空白組(0 mg·L-1La3+)生物量增加了43.59%。

在缺P(pán)組中，藻細(xì)胞增長(zhǎng)較為緩慢，當(dāng)La3+濃度為0.10～0.20 mg·L-1時(shí)，藻細(xì)胞的生長(zhǎng)幅度顯著高于單一缺P(pán)組(P<0.01)，且La3+濃度為0.20 mg·L-1時(shí)，促進(jìn)作用達(dá)到最大，在第16天達(dá)到最大生物量6.59×106cells·mL-1，比單一缺P(pán)組增加了7.32%；隨著La3+濃度的增加(0.50～1.00 mg·L-1)，銅綠微囊藻的生長(zhǎng)受到抑制，其藻細(xì)胞的生長(zhǎng)幅度低于空白組(P<0.01)，且濃度越大，抑制作用越強(qiáng)。

在缺N組中，在La3+濃度為0 mg·L-1時(shí)，藻可以維持11 d的緩慢生長(zhǎng)，其細(xì)胞密度最大為2.71×106cells·mL-1，而La3+濃度為0.10～1.00 mg·L-1時(shí)，藻細(xì)胞量在7 d緩慢增加后迅速減少，且藻細(xì)胞在整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)的生長(zhǎng)量均低于單一缺N組，說(shuō)明La3+在缺N脅迫下，對(duì)銅綠微囊藻表現(xiàn)為迫害作用。銅綠微囊藻在缺N培養(yǎng)基中細(xì)胞的生物量明顯低于缺P(pán)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)，銅綠微囊藻對(duì)P缺乏的耐受能力高于對(duì)N缺乏的耐受能力(P<0.01)。銅綠微囊藻在適應(yīng)期結(jié)束后未迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而出現(xiàn)停止生長(zhǎng)甚至下降的趨勢(shì)，因此，測(cè)定藻細(xì)胞內(nèi)各生理指標(biāo)意義不大，后續(xù)分析中不考慮缺N組。

由此可見(jiàn)，缺乏N、P營(yíng)養(yǎng)元素不利于銅綠微囊藻的生長(zhǎng)，而適量的La能促進(jìn)藻類(lèi)的生長(zhǎng)。缺P(pán)會(huì)降低銅綠微囊藻對(duì)稀土La3+濃度的耐受能力，可能是因?yàn)樵寮?xì)胞對(duì)稀土的富集能力與磷元素有關(guān)。崔宜淳[23]的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，少量稀土元素能夠改變?cè)孱?lèi)細(xì)胞器的某些結(jié)構(gòu)及相應(yīng)的功能，此外，稀土可以與某些特定的酶結(jié)合，并激活酶的活性，進(jìn)而加快藻細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，促進(jìn)藻類(lèi)生長(zhǎng)，這一結(jié)論與呂赟等[24]對(duì)水華魚(yú)腥藻的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似；而在高濃度稀土的培養(yǎng)下，藻類(lèi)的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究也證明，過(guò)量的稀土元素會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合活性中心，抑制多種與藻類(lèi)生長(zhǎng)相關(guān)酶的活性，導(dǎo)致藻類(lèi)的生長(zhǎng)受到抑制[25]。銅綠微囊藻對(duì)P缺乏的耐受力高于對(duì)N缺乏的耐受力，適宜濃度的稀土La3+能短時(shí)間抵抗由于缺P(pán)造成的損害，維持銅綠微囊藻的正常生長(zhǎng)；但在缺N脅迫下，稀土La3+不能減少缺N脅迫的損害，反而與缺N共同對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)造成了負(fù)面影響。

2.2 La3+對(duì)Chl a含量的影響

大多數(shù)藻細(xì)胞通常需要通過(guò)光合作用才能合成維持其自身正常生命代謝活動(dòng)所需要的有機(jī)物，而Chla作為一種重要的光合色素，具有吸收并轉(zhuǎn)化光能的功能，其轉(zhuǎn)換效率即光合作用效率能夠直接反映藻細(xì)胞將光能轉(zhuǎn)化為自身所需化學(xué)能的能力，是光合作用的重要指標(biāo)之一[26]。因此，Chla可以作為評(píng)估植物或藻類(lèi)生長(zhǎng)狀況的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

如圖2所示，在對(duì)照組中，Chla含量在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，隨著藻進(jìn)入對(duì)數(shù)期，Chla增長(zhǎng)幅度增加，且增加量隨著La3+濃度的升高呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。在La3+濃度為0.50 mg·L-1時(shí)Chla含量達(dá)到最大，在第4、8、12和16天的生長(zhǎng)量分別比空白組藻Chla的含量提高了22.81%、45.68%、71.00%和80.95%(P<0.01)。即適宜濃度的稀土La3+能提高銅綠微囊藻的光合效率，促進(jìn)葉綠素的合成。

在缺P(pán)組中，低濃度的La3+(0.10～0.20 mg·L-1)對(duì)Chla表現(xiàn)為刺激作用(P<0.01)，濃度為0.20 mgL-1時(shí)促進(jìn)作用達(dá)到最大，其Chla含量在第12天為0.89 mg·L-1，比單一缺P(pán)組(0 mg·L-1La3+)中銅綠微囊藻中Chla含量提高了31.75%，而高濃度的La3+(0.50～1.00 mg·L-1)表現(xiàn)為抑制作用，在La3+濃度為1.00 mg·L-1抑制作用達(dá)到最大，第16天的Chla含量為0.57 mg·L-1，比單一缺P(pán)組降低了15.48%。在相同La3+濃度下，缺P(pán)組藻細(xì)胞內(nèi)Chla含量低于對(duì)照組，即缺P(pán)會(huì)影響藻細(xì)胞內(nèi)Chla的合成，這一結(jié)果與張杰等[9]研究La對(duì)水稻幼苗影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似。本研究表明，適宜La3+濃度能夠刺激細(xì)胞內(nèi)Chla的合成從而提高光合效率，有利于銅綠微囊藻細(xì)胞合成大量有機(jī)物。已有的研究表明，適宜的稀土元素可以作為一種中間物質(zhì)與K+、Na+和Ca2+等離子發(fā)生相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)某些營(yíng)養(yǎng)元素的吸收效率，進(jìn)而增加細(xì)胞內(nèi)葉綠素的合成量，而高濃度La3+對(duì)細(xì)胞的活化作用低于Mg2+，使細(xì)胞內(nèi)葉綠素的合成受到較強(qiáng)的抑制作用[27]。

圖1 在不同生長(zhǎng)環(huán)境下不同濃度La3+對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)量的影響注：(a)對(duì)照組；(b)缺磷組；(c)缺氮組。Fig. 1 Effects of La3+ with different concentration on the growth of Microcystis aeruginosa under different growth environmentsNote:(a) Control group; (b) Phosphorus deficiency group; (c) Nitrogen deficiency group.

圖2 不同濃度La3+處理下對(duì)葉綠素a (Chl a)的影響注：(a)對(duì)照組；(b)缺磷組。Fig. 2 Chlorophyla (Chl a) content under different La3+ treatmentsNote: (a) Control group; (b) Phosphorus deficiency group.

2.3 La3+對(duì)可溶性糖含量的影響

可溶性糖在植物的整個(gè)生命周期中具有十分重要的作用。已有的研究表明，可溶性糖可作為植物生長(zhǎng)發(fā)育和有關(guān)基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子之一，也是維持藻細(xì)胞正常滲透壓的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，能表示藻類(lèi)細(xì)胞的抗逆性大小，其含量在一定的程度上能夠定性地反映藻類(lèi)細(xì)胞抵御外界不良環(huán)境的能力[28]。同時(shí)，可溶性糖作為植物光合作用的主要產(chǎn)物，是儲(chǔ)存、積累及運(yùn)輸有機(jī)物的主要形式[29]。

如圖3所示，對(duì)照組中，在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不同La3+濃度處理下的藻細(xì)胞內(nèi)可溶性糖的含量均逐漸減少。在La3+濃度為0.10～0.50 mg·L-1時(shí)，可溶性糖含量低于空白組，且隨La3+濃度增加可溶性糖含量減少。在前半個(gè)周期中，當(dāng)La3+濃度為1.00 mg·L-1時(shí)，可溶性糖含量明顯高于空白組(P<0.01)。在第4、12和16天中，La3+濃度為0.50 mg·L-1時(shí)，可溶性糖含量分別達(dá)到同一時(shí)間測(cè)定的最低量，分別為425.89、195.32和114.73 mg·L-1。

缺P(pán)脅迫下，La3+濃度在0.10～0.02 mg·L-1范圍內(nèi)可溶性糖含量減少，在La3+濃度為0.10 mg·L-1時(shí)，可溶性糖含量最低，其在第4、8、12和16天含量分別為554.34、421.02、305.93和224.74 mg·L-1，分別比單一缺P(pán)脅迫下的銅綠微囊藻中可溶性糖含量降低了11.91%、26.13%、33.40%和28.89%。當(dāng)稀土La3+的濃度大于0.20 mg·L-1時(shí)，可溶性糖的含量隨稀土La3+濃度增加而增多。

不同濃度的稀土La3+對(duì)缺P(pán)組和對(duì)照組的藻有不同的影響機(jī)制，缺P(pán)組中藻內(nèi)可溶性糖的含量整體高于對(duì)照組，且在可溶性糖含量最低時(shí)對(duì)應(yīng)的稀土La3+濃度存在差異。在輕度脅迫下，可溶性糖可作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，維持著細(xì)胞內(nèi)滲透壓平衡[30]；有研究表明，重金屬脅迫下，細(xì)胞內(nèi)的可溶性糖會(huì)出現(xiàn)幾種不同的變化趨勢(shì)[30-33]。在本實(shí)驗(yàn)中，可溶性糖的含量隨著稀土La3+濃度增加呈現(xiàn)先減后增的趨勢(shì)，這與王瓊等[30]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，可知對(duì)照組中可溶性糖含量的變化趨勢(shì)主要是由于滲透壓引起。在缺P(pán)組中，低濃度的La3+可能通過(guò)改變細(xì)胞器結(jié)構(gòu)功能，促進(jìn)細(xì)胞利用糖類(lèi)作為能量供給來(lái)加快藻類(lèi)細(xì)胞的代謝；而高濃度的La3+可能使細(xì)胞外滲透壓增大，藻細(xì)胞破滅導(dǎo)致可溶性糖流出，測(cè)定出的可溶性糖含量增加。同時(shí)，在高濃度La3+的脅迫下，藻細(xì)胞的結(jié)構(gòu)受損，而P元素是細(xì)胞內(nèi)能量直接來(lái)源ATP合成的必要元素，缺P(pán)會(huì)導(dǎo)致ATP含量減少，使可溶性糖的利用量大大降低，可溶性糖在細(xì)胞內(nèi)的積累量增加，造成其含量明顯高于對(duì)照組中的含量。

圖3 不同濃度La3+處理下可溶性糖含量變化注：(a)對(duì)照組；(b)缺磷組。Fig. 3 Soluble sugar content under different La3+ treatmentsNote: (a) Control group; (b) Phosphorus deficiency group.

2.4 La3+對(duì)可溶性蛋白含量的影響

藻細(xì)胞中的大部分可溶性蛋白質(zhì)是參與藻類(lèi)各種代謝有關(guān)的酶類(lèi)，因此，可溶性蛋白含量可以作為衡量藻類(lèi)或植物的生理生化反應(yīng)及總代謝的重要指標(biāo)之一。

由圖4可知，對(duì)照組中，濃度為0.10～1.00 mg·L-1的稀土La3+能顯著提高銅綠微囊藻的蛋白質(zhì)含量(P<0.01)，在濃度為0.50 mg·L-1時(shí)，藻類(lèi)蛋白質(zhì)含量達(dá)到最大，在第8、12和16天的含量分別為0.70、1.45和1.91 mg·L-1，分別比空白組中銅綠微囊藻的蛋白質(zhì)含量提高了22.81%、46.46%和0.24%。蛋白質(zhì)的含量與光合作用密切相關(guān)，在此濃度范圍內(nèi)，稀土La3+促進(jìn)Chla的合成，提高了藻細(xì)胞的光合速率，使光合作用制造的蛋白質(zhì)明顯增多。

缺P(pán)組中，在La3+濃度為0.10～0.20 mg·L-1時(shí)，蛋白質(zhì)含量高于單一缺P(pán)組，表現(xiàn)為促進(jìn)作用，且在濃度為0.2 mg·L-1時(shí)促進(jìn)作用最明顯，在第12天的蛋白質(zhì)含量提高量最大(P<0.01)，為34.54%；隨著培養(yǎng)液中La3+濃度增加(La3+濃度>0.2 mg·L-1)，藻細(xì)胞內(nèi)的可溶性蛋白的含量呈下降趨勢(shì)。

缺P(pán)組中，蛋白質(zhì)含量及增長(zhǎng)速度均低于相同濃度La3+處理下的對(duì)照組，對(duì)照組中的蛋白質(zhì)含量在第16天最高達(dá)到1.906 mg·L-1，比缺P(pán)組中最高含量0.844 mg·L-1提高55.7%。因此，缺P(pán)會(huì)影響藻細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而影響藻類(lèi)的正常代謝。低濃度的La3+均能增加可溶性蛋白質(zhì)的含量，已有的研究結(jié)果表明，適量的稀土能通過(guò)某種機(jī)制將信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)鈣調(diào)蛋白(CaM)基因表達(dá)，激活依賴(lài)于CaM的各種酶活性，引起蛋白質(zhì)含量升高[34]；而高濃度的La3+則抑制CaM基因表達(dá)[35-36]，使合成的蛋白質(zhì)等有機(jī)物量減少。

圖4 不同濃度La3+處理下蛋白質(zhì)含量變化注：(a)對(duì)照組；(b)缺磷組。Fig. 4 Protein content under different La3+ treatmentsNote: (a) Controll group; (b) Phosphorus deficiency group.

2.5 La3+對(duì)CAT、POD活性的影響

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中需要吸收、利用氧氣來(lái)維持自身的正常生長(zhǎng)代謝，在此過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)會(huì)生成一定量的有害物質(zhì)活性氧(ROS)[37]?；钚匝踝鳛樽匀簧磉^(guò)程中產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物，具有氧化植物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，以及破壞植物細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和生理功能的危害作用[38-39]。在植物正常的生長(zhǎng)過(guò)程中，植物體內(nèi)的ROS會(huì)保持一種動(dòng)態(tài)平衡，即植物體內(nèi)產(chǎn)生的ROS與體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)清除ROS的物質(zhì)存在一定關(guān)系[40]。但是，當(dāng)植物細(xì)胞受到嚴(yán)重脅迫時(shí)，細(xì)胞體內(nèi)產(chǎn)生的ROS將無(wú)法及時(shí)被抗氧化系統(tǒng)消除，進(jìn)而大量累積，抑制了抗氧化酶活性[41]。

如圖5和圖6所示，缺P(pán)組中，CAT和POD的活性均隨La3+濃度的增加，表現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)。在第12天，La3+濃度達(dá)到0.20 mg·L-1時(shí)，CAT和POD活性均達(dá)到最高，分別為11.29 U·(108cells)-1和7.29 U·(108cells)-1，比單一缺P(pán)組分別提高了25.58%和30.65%(P<0.01)；而高濃度La3+下，CAT和POD活性下降，可能是因?yàn)楦邼舛鹊腖a3+破壞了藻細(xì)胞內(nèi)的抗氧化平衡，導(dǎo)致抗氧化酶活性降低。在第16天時(shí)，在長(zhǎng)時(shí)間的缺P(pán)和La3+的協(xié)同脅迫下，銅綠微囊藻受到抑制作用增強(qiáng)，葉綠素合成減少，蛋白質(zhì)含量下降，CAT活性也隨之下降。對(duì)照組中，CAT和POD的活性與缺P(pán)組表現(xiàn)出類(lèi)似的變化趨勢(shì)，但CAT(P<0.01)和POD在La3+濃度為0.5 mg·L-1時(shí)活性達(dá)到最大值。

對(duì)比2組實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，缺P(pán)組中CAT和POD活性高于對(duì)照組，而藻細(xì)胞對(duì)La3+的耐受能力低于于對(duì)照組，即營(yíng)養(yǎng)元素P的缺乏會(huì)加重銅綠微囊藻膜脂過(guò)氧化的程度。與杜金戈等[12]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似，即低濃度的稀土元素能促進(jìn)酶活性的增強(qiáng)，高濃度則抑制酶活性。

圖5 不同濃度La3+處理下過(guò)氧化氫酶(CAT)活性變化注：(a)對(duì)照組；(b)缺磷組。Fig. 5 The catalase (CAT) activity under different La3+ treatmentsNote: (a) Control group; (b) Phosphorus deficiency group.

圖6 不同濃度La3+處理下過(guò)氧化物酶(POD)活性變化注：(a)對(duì)照組；(b)缺磷組。Fig. 6 The peroxidase (POD) activity under different La3+ treatmentsNote: (a) Control group; (b) Phosphorus deficiency group.

2.6 La3+對(duì)MDA含量的影響

MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化過(guò)程中的一種重要產(chǎn)物，常作為反映植物衰老生理和抗性生理狀況的指標(biāo)，其含量可用來(lái)表達(dá)細(xì)胞膜膜脂過(guò)氧化的程度，間接確定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。因此，MDA的含量可以作為判斷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷程度以及藻體受脅迫程度的重要依據(jù)[46-47]。

如圖7所示，在對(duì)照組和缺P(pán)組中，不同La3+濃度對(duì)銅綠微囊藻中MDA含量變化有相似的影響，但在缺P(pán)和稀土La3+同時(shí)脅迫下，銅綠微囊藻MDA含量高于單一稀土La3+脅迫下的含量。

在缺P(pán)組中，MDA含量隨稀土La3+濃度的增加表現(xiàn)出先減少后增加的趨勢(shì)，且不同La3+濃度處理下MDA含量均隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在第16天，稀土La3+濃度為0.10～0.20 mg·L-1時(shí)，MDA含量低于單一缺P(pán)組(P<0.01)，在稀土La3+濃度為0.20 mg·L-1時(shí)，MDA達(dá)到最低含量2.25 mg·L-1，比單一缺P(pán)組中MDA含量降低6.25%，而La3+濃度>0.20 mg·L-1時(shí)，MDA含量上升，即適量的稀土元素La3+有利于銅綠微囊藻抵御缺P(pán)脅迫。

對(duì)比CAT、POD活性和MDA含量可知，低濃度的稀土La3+能增強(qiáng)細(xì)胞中抗氧化酶的活性，降低MDA含量，減少缺P(pán)脅迫對(duì)細(xì)胞的損害，維持藻細(xì)胞的正常生長(zhǎng)代謝；而高濃度的La3+嚴(yán)重阻礙抗氧化酶的合成，使藻類(lèi)細(xì)胞的抗氧化體系無(wú)法正常運(yùn)行，細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，干擾和破壞細(xì)胞的正常功能。同時(shí)，產(chǎn)生并積累的大量MDA反過(guò)來(lái)抑制抗氧化酶活性[48]，嚴(yán)重影響藻細(xì)胞的正常生命代謝水平。

2.7 生理毒理指標(biāo)相關(guān)性

此外，本研究對(duì)藻的生理毒理指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性分析。由表1可知，生物量、葉綠素a含量、可溶性蛋白含量、CAT活性、POD活性、MDA含量之間均呈顯著正相關(guān)(P<0.05或P<0.01)。其中，銅綠微囊藻的生物量與CAT活性、POD活性、MDA含量之間相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.90以上，呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(P<0.01)，說(shuō)明銅綠微囊藻的生長(zhǎng)狀況與酶活性存在一定的關(guān)聯(lián)；而CAT、POD作為藻細(xì)胞內(nèi)2種重要的抗氧化酶，在一定程度上，其活性對(duì)藻細(xì)胞受損程度有相似的反映；同時(shí)，銅綠微囊藻藻細(xì)胞密度對(duì)于葉綠素a和可溶性蛋白的合成有重要的影響，直接影響兩者的含量。但是，可溶性糖與其他6項(xiàng)生理毒理學(xué)指標(biāo)均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，即在實(shí)驗(yàn)測(cè)定時(shí)間內(nèi)，在一定濃度稀土La的影響下，銅綠微囊藻藻細(xì)胞中可溶性糖含量越低，藻細(xì)胞抗氧化酶活性越高，銅綠微囊藻生長(zhǎng)越好。

綜上所述，不管是正常水體還是在缺P(pán)的貧營(yíng)養(yǎng)水體中，輕稀土La3+對(duì)銅綠微囊藻的生態(tài)學(xué)效應(yīng)在細(xì)胞層次上均表現(xiàn)出典型“Hormesis”現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為：

(1)在對(duì)照組中，低濃度La3+(0.10～0.50 mg·L-1)對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用，高濃度(>0.50 mg·L-1)La3+對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)有一定抑制作用。

圖7 不同濃度La3+處理下丙二醛(MDA)含量變化注：(a)對(duì)照組；(b)缺磷組。Fig. 7 Malondialdehyde (MDA) content under different La3+ treatmentsNote: (a) Control group; (b) Phosphorus deficiency group.

表1 生理毒理指標(biāo)相關(guān)性Table 1 Correlation of physiological and toxicological indexes

(2)在缺P(pán)的脅迫下，低濃度La3+(0.10～0.20 mg·L-1)對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用，表現(xiàn)為藻密度、蛋白質(zhì)、葉綠素a和抗氧化酶活性的明顯增加，可溶性糖含量降低，銅綠微囊藻生長(zhǎng)狀態(tài)良好，稀土La3+對(duì)藻細(xì)胞的抗氧化體系表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用；高濃度La3+(0.50～1.00 mg·L-1)對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)有破壞作用，表現(xiàn)為藻密度、蛋白質(zhì)、葉綠素a和抗氧化酶活性的下降，可溶性糖含量增加，抗氧化平衡遭到破壞，膜脂過(guò)氧化嚴(yán)重，藻類(lèi)代謝處于較低水平。

(3)在缺N組中，不同濃度La3+對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)均表現(xiàn)為抑制作用，銅綠微囊藻不能正常生長(zhǎng)。

(4)在一定時(shí)間、適宜La3+濃度內(nèi)，P缺乏與否，稀土刺激生物效應(yīng)同樣存在，但缺P(pán)會(huì)降低銅綠微囊藻對(duì)La3+濃度和La3+處理時(shí)間的耐受能力。

本研究表明，在貧營(yíng)養(yǎng)水體中，La對(duì)銅綠微囊藻產(chǎn)生的“Hormesis”現(xiàn)象在實(shí)際工程中有重要的應(yīng)用意義。它可以為稀土在實(shí)際工程應(yīng)用上的使用量提供合理依據(jù)，并為由稀土元素引發(fā)的潛在環(huán)境事故提供一定理論依據(jù)；同時(shí)，也可據(jù)此推測(cè)稀土元素La3+的輸入可能引發(fā)貧營(yíng)養(yǎng)水體發(fā)生藻類(lèi)大量繁殖現(xiàn)象，但其更深層次的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。