王玉成, 宋 偉, 艾連中, 吳 靜

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

乙醛酸（glyoxylic acid）是一種重要的化工原料，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)口服青霉素[1]、香蘭素[2]、乙基香蘭素和尿囊素等重要化學(xué)品。同時，乙醛酸能與苯酚縮合生成4-羥基扁桃酸，與氨反應(yīng)生成羥基苯甘氨酸，是藥物阿莫西林的重要前體[3]。

乙醛酸工業(yè)生產(chǎn)方法主要包括草酸電解法（草酸水溶液經(jīng)電解還原，生成乙醛酸稀溶液）和乙二醛氧化法（乙二醛經(jīng)貴金屬催化生成乙醛酸）[4]。但是上述生產(chǎn)方法面臨工藝復(fù)雜、能耗高、產(chǎn)品純化困難等問題。另一方面，化學(xué)生產(chǎn)會造成環(huán)境污染。

生物技術(shù)法具有綠色節(jié)能、可持續(xù)性及副產(chǎn)物少等特點[5]，如乙醇酸經(jīng)乙醇酸氧化酶生成乙醛酸，也有以木糖為底物采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙醛酸[6]。然而，生物法生產(chǎn)乙醛酸面臨產(chǎn)量低、反應(yīng)時間長等缺點，限制了其工業(yè)化應(yīng)用，如圖1 所示，在KEGG 數(shù)據(jù)庫中甘氨酸能經(jīng)甘氨酸氧化酶（glycine oxidase, ThiO, EC 1.4.3.19）的催化，生產(chǎn)乙醛酸[7]。這一反應(yīng)表明，若能以廉價易得的甘氨酸作為底物，生物催化生產(chǎn)乙醛酸，不僅能有效地縮減乙醛酸工業(yè)化固定資產(chǎn)，還能有效地消耗甘氨酸過剩的產(chǎn)能，帶來良好的經(jīng)濟效益和產(chǎn)業(yè)價值。但是，目前尚無利用ThiO 催化生產(chǎn)乙醛酸的研究報道[8-9]，其產(chǎn)業(yè)瓶頸在于ThiO 的表達是以包涵體的形式存在[10]。

圖1 甘氨酸氧化酶催化甘氨酸生成乙醛酸Fig.1 Glycine oxidase catalyzes glycine to glyoxylic acid

針對上述問題，本研究以實現(xiàn)ThiO 的可溶性表達[11-12]為目標，使用不同表達宿主和表達載體[13-15]，構(gòu)建表達ThiO 的重組菌株。檢測了重組菌體作為生物全細胞催化劑制備乙醛酸的潛力。并探究全細胞催化劑的最優(yōu)反應(yīng)條件及外源物添加對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響，通過放大轉(zhuǎn)化體系考察其應(yīng)用性。為全細胞法催化甘氨酸生產(chǎn)乙醛酸的工業(yè)化提供理論依據(jù)和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

ThiO 基因來源菌株為Bacillus subtilis168，GenBank 中基因信息（NCBI 基因ID：939377；NCBI蛋白ID：NP_389049）?？寺∷拗鱁.coliJM109、表達宿主E.coliBL2l（DE3）和Bacillus subtilis168 購買自中國普通微生物菌種保藏中心CGMCC 和中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心ACCC。E.coli表達載體pET-28a（+）（T7 啟動子，Kanar）、pGEX-6P-1（含有N-GST 標簽，Tac 啟動子，Ampr）、pCOLDI（CSPA冷啟動子，Ampr）和Bacillus subtilis168 表達載體pP43NMK（P43 啟動子，Kanar）為本實驗室保藏。同源引物合成及基因序列測序工作均委托蘇州金唯智生物工程有限公司。本研究使用引物見表1。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.2 試劑與培養(yǎng)基

Ex Taq DNA 聚合酶、限制內(nèi)切酶、連接酶和過氧化氫酶購自Takara（大連）有限公司；細菌基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司；甘氨酸、乙醛酸、通透劑CTAB、曲拉通（X-100）和吐溫-80 購自美國Sigma-Aldrich 公司。

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基成分：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L。固體培養(yǎng)基另加2%的瓊脂粉。TB 培養(yǎng)基成分：酵母粉24 g/L，胰蛋白胨12 g/L，甘油4 g/L，KH2PO42.31 g/L，K2HPO412.54 g/L。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

按照細菌基因組提取試劑盒的操作步驟從Bacillus subtilis168 菌體中提取基因組。以基因組為模板，使用設(shè)計的不同載體對應(yīng)的同源引物進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增和膠回收。按照質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。pET-28a（+）質(zhì)粒選擇SalI 和XhoI 位點酶切；pGEX-6P-1 質(zhì)粒選擇EcoRI 和XhoI 位點酶切；pCOLDI 質(zhì)粒選擇XhoI 和EcoRI 位點酶切；pP43NMK 質(zhì)粒選擇KpnI 和SmaI 位點酶切。酶切過后的質(zhì)粒片段與擴增片段使用連接酶進行連接，連接產(chǎn)物導(dǎo)入E.coliJM109 感受態(tài)細胞后涂布平板。通過抗性篩選、挑取陽性克隆子菌落PCR驗證及基因序列測序完成驗證。

1.4 發(fā)酵產(chǎn)酶

以E.coliBL2l（DE3）為表達宿主、pET-28a（+）為表達載體的重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶過程為：先在LB 固體平板上劃線，37 ℃過夜培養(yǎng)；然后挑取平板上單菌落接種于含有卡那抗性的LB 液體培養(yǎng)基（終濃度為0.4 mmol/L）中，在37 ℃、200 rpm 恒溫搖床上震蕩培養(yǎng)12 h；再將上述種子菌液按照2%接種量接種于卡那抗性的TB 培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 rpm 恒溫搖床上震蕩培養(yǎng)2 h 左右，待菌液OD600達到0.6，再添加誘導(dǎo)劑IPTG 置于25 ℃、200 rpm 恒溫搖床上誘導(dǎo)12 h。

以E.coliBL2l（DE3）為表達宿主、pGEX-6P-1為表達載體的重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶操作與pET-28a（+）為表達載體的重組菌基本相同，但使用的選擇抗性為Amp 抗性。

以E.coliBL2l（DE3）為表達宿主、pCOLDI 為表達載體的重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶過程：種子活化至誘導(dǎo)前操作與pGEX-6P-1 為表達載體的重組菌相同，pCOLDI 表達載體的啟動子為CSPA 冷啟動子，低溫15 ℃誘導(dǎo)，不需添加誘導(dǎo)劑IPTG。

以Bacillus subtilis168 為表達宿主、pP43NMK為表達載體的重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶過程：載體啟動子為組成型P43 啟動子，不需要其他因子的誘導(dǎo)即可穩(wěn)定地表達，待發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體生長至穩(wěn)定期即可停止發(fā)酵。

1.5 分析方法

1.5.1 ThiO 可溶性表達的鑒定

對發(fā)酵誘導(dǎo)的菌液12 000 r/min 離心20 min，保留沉淀棄上清，使用pH 值8.0 的20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液洗滌1 次，離心棄上清。再加入磷酸緩沖液重懸，對懸浮液進行超聲破碎，離心后分離上清與沉淀，沉淀用等量磷酸緩沖液重懸。重懸過后的沉淀懸浮液與分離上清分別與SDS 緩沖液進行混合，沸水浴10 min 進行蛋白變性處理。通過SDS-PAGE 電泳檢測上清樣品與沉淀樣品中蛋白的可溶性表達情況。

1.5.2 乙醛酸含量的測定

采用高效液相色譜法（HPLC）來檢測反應(yīng)液中產(chǎn)物乙醛酸的含量。本研究使用Waters 高效液相色譜儀，Bio-Rad Aminex HPX-87H 色譜柱（300 mm×7.8 mm，9 μm），流動相是超聲脫氣過膜處理后的50 mmol/L 稀硫酸。全細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)液經(jīng)過12 000 r/min 離心5 min 后保留上清液，使用0.22 μm孔徑的濾頭過濾，得到濾液為待測樣品。檢測條件設(shè)置為：進樣量10 μL，流速0.6 mL/min，柱溫35 ℃，紫外檢測波長為210 nm，樣品的進樣時間設(shè)置為25 min。

1.5.3 溫度對全細胞催化活性及穩(wěn)定性的影響

全細胞催化反應(yīng)分別在pH 值8.0、溫度15，20，25，30，35，40，45 ℃的條件下進行，以本次實驗所有樣品中最高活性作為相對酶活100%，比較得到全細胞催化的最適反應(yīng)溫度；菌體分別在25，30，35，40，45 ℃下保溫8 h，每隔1 h 取樣，在25 ℃、pH 值8.0 條件下測定殘余活性，其中定義全細胞催化原始活力為最高相對酶活100%。

1.5.4 pH 值對全細胞催化活性及穩(wěn)定性的影響

全細胞催化反應(yīng)分別在溫度25 ℃、pH 值6.0， 6.5， 7.0， 7.5， 7.8， 8.0， 8.3， 8.5， 9.0，9.5 的10 個不同緩沖液中進行。pH 值6.0～8.0 范圍內(nèi)使用50 mmol/L 磷酸緩沖液；pH 值8.0～9.5 范圍內(nèi)使用50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液。以本次實驗所有樣品中最高活性作為相對酶活100%，比較得到全細胞催化的最適反應(yīng)pH 值。菌體分別在pH 值7.0，7.5，8.3，8.5，9.0 下保溫8 h，每隔1 h 取樣，在25 ℃、pH 值8.0 條件下測定殘余活性，其中定義全細胞催化原始活力為最高相對酶活100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 ThiO 表達菌株的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醛酸

提取經(jīng)過ThiO 基因片段擴增、酶切連接和篩選驗證等分子操作構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒pET-28a（+）-ThiO 轉(zhuǎn)化入E.coliBL2l（DE3）感受態(tài)細胞，經(jīng)卡那霉素LB 平板篩選；將重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-ThiO、pCOLDI-ThiO 轉(zhuǎn)化入E.coliBL2l（DE3）感受態(tài)細胞，經(jīng)氨芐霉素LB 平板篩選；將重組質(zhì)粒pP43NMK-ThiO 轉(zhuǎn)化入Bacillus subtilis168 感受態(tài)細胞，經(jīng)卡那霉素LB 平板篩選，見表2。挑取陽性克隆子，經(jīng)過菌落PCR 驗證獲得包含ThiO 基因的4 株表達菌株：E.coliBL2l（pET-28a（+）-ThiO）、E.coliBL2l（pGEX-6P-1-ThiO） 、E.coliBL2l（ pCOLDI-ThiO） 及Bacillus subtilis168（pP43NMK-ThiO）。

表2 表達菌株的構(gòu)建Tab.2 Construction of expression strains

對菌株E.coliBL2l（pET-28a（+）-ThiO）、E.coliBL2l（pGEX-6P-1-ThiO）進行發(fā)酵培養(yǎng)，菌液OD600達到0.6 時，添加終濃度1%的誘導(dǎo)劑IPTG ，在25 ℃條件下進行誘導(dǎo)表達；對E.coliBL2l（pCOLDIThiO）進行發(fā)酵培養(yǎng)，在低溫15 ℃條件下進行誘導(dǎo)表達；對菌株Bacillus subtilis168（pP43NMK-ThiO）進行發(fā)酵培養(yǎng)。將上述4 株重組菌株菌液進行離心處理，并收集菌體，用PBS 緩沖液洗滌兩次后，保存起來作為全細胞催化劑。在pH 值8.0 的50 mmol/L 磷酸緩沖液中（20 mL 總體系）添加10 g/L 的底物甘氨酸以及20 g/L 的全細胞催化劑，在25 ℃、200 rpm 條件下反應(yīng)12 h，檢測4 株菌株全細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醛酸的效果，結(jié)果見圖2。發(fā)現(xiàn)菌株E.coliBL2l（pET-28a（+）-ThiO）、E.coliBL2l（pGEX-6P-1-ThiO）、E.coliBL2l（pCOLDI-ThiO）、Bacillus subtilis168（pP43NMK-ThiO）的乙醛酸產(chǎn)量分別為0.15±0.02，0.18±0.03，0.16 g±0.02，1.50±0.03 g/L，產(chǎn)量1.50±0.03 g/L 是目前生物法生產(chǎn)乙醛酸最高產(chǎn)量的2 倍[6]。

圖2 4 株表達菌株全細胞轉(zhuǎn)化生成乙醛酸的產(chǎn)量Fig.2 Production of glyoxylic acid by whole cell transformation of four expression strains

進一步分析，以E.coliBL2l 為表達宿主的3 株表達菌株轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醛酸的產(chǎn)量較低，其原因是ThiO 的表達以包涵體的形式存在。帶有N-GST 促溶標簽[16]的菌株E.coliBL2l（pGEX-6P-1-ThiO）、帶有低溫誘導(dǎo)促進蛋白正確折疊的CSPA 冷啟動子的菌株E.coliBL2l（pCOLDI-ThiO）相比于帶有T7 啟動子的菌株E.coliBL2l（pET-28a（+）-ThiO）并沒有取得促進ThiO 的可溶性表達的效果；而菌株Bacillus subtilis168（pP43NMK-ThiO）則是可溶性表達。因此，菌株 Bacillus subtilis 168（pP43NMK-ThiO）轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醛酸的效率較高，Bacillussubtilis168更適合作為ThiO 的表達宿主，用于后續(xù)研究。

2.2 菌株Bacillus subtilis 168（pP43NMK-ThiO）的可溶性表達

全細胞裂解液SDS-PAGE 電泳檢測如圖3 所示。其中：M代表蛋白質(zhì)分子量標準；1 代表菌體破碎上清；2 代表菌體破碎沉淀。SDS-PAGE 電泳顯示，菌株Bacillus subtilis168（pP43NMK-ThiO）菌體破碎上清液中，分子量44 kDa 大小附近有明顯的蛋白亮條帶（圖3 中的條帶1），與文獻[7]中報道的ThiO 分子量大小一致；菌體破碎沉淀樣品中沒有蛋白亮條帶（圖3 中的條帶2），表明ThiO在菌株Bacillus subtilis168（pP43NMK-ThiO）中成功實現(xiàn)了胞內(nèi)可溶性表達。菌株Bacillus subtilis168（pP43NMK-ThiO）的菌體可作為轉(zhuǎn)化甘氨酸生產(chǎn)乙醛酸的全細胞催化劑。

圖3 SDS-PAGE 電泳檢測全細胞裂解液Fig.3 SDS-PAGE analysis of whole cell lysates

2.3 菌株Bacillus subtilis 168（pP43NMK-ThiO）的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件

溫度（15～45 ℃）對ThiO 酶活的影響如圖4（a）所示。隨著溫度從15 ℃增加至30 ℃，ThiO 酶活逐漸上升達到最高值100%；繼續(xù)增加溫度（≥30 ℃），酶活則逐漸降低；45 ℃時酶活為40%。不同溫度對全細胞催化劑熱穩(wěn)定性的影響如圖4（b）所示，在25 ℃和30 ℃下保溫8 h，全細胞催化劑基本不損失活性；而溫度增加至35，40，45 ℃，保溫8 h后，酶活僅為90%，75%，30%。這一結(jié)果表明，全細胞催化劑在35 ℃內(nèi)能保持較高的酶活和熱穩(wěn)定性，與ThiO 純化分離后溫度相關(guān)的活性研究相吻合[7]，適合工業(yè)化長時間催化。因此，Bacillus subtilis168（pP43NMK-ThiO）全細胞催化劑的最佳轉(zhuǎn)化為溫度30 ℃。

圖4 Bacillus subtilis 168（pP43NMK-ThiO）全細胞催化劑最適反應(yīng)條件及穩(wěn)定性Fig.4 Optimal reaction conditions and stability for whole cell catalyst of Bacillus subtilis 168（pP43NMK-ThiO）

反應(yīng)體系中pH 值直接影響與底物的結(jié)合，所以最適pH 值是全細胞催化劑重要的生物特性之一[18-20]。實驗探究了Bacillus subtilis168（pP43NMK-ThiO）全細胞催化劑在pH 值6.0～9.5范圍內(nèi)的酶活變化，如圖4（c）所示。在pH 值為6.0～6.5 時，全細胞催化劑殘留20%活性，基本喪失轉(zhuǎn)化能力；在pH 值為7.0～9.0 時，酶活先上升、后下降，保持60%以上活性；在pH 值為8.0～8.5 時，保持90%以上高活性；在pH 值為8.3 時，達到100%最高活性。本實驗同時在pH 值7.0～9.0 范圍內(nèi)考察了全細胞催化劑8 h 內(nèi)pH 值的穩(wěn)定性，得到隨時間變化的活性曲線，如圖4（d）所示。在pH 值8.3 的最佳條件下，1 h 后活性下降至75%；1 h～5 h 間活性迅速下降，殘留25%的活性；5 h 后活性隨時間緩慢下降至完全喪失。從整體分析，Bacillus subtilis168（pP43NMKThiO）全細胞催化劑的pH 值穩(wěn)定性不佳，在緩沖體系中會逐漸失活，最終完全喪失轉(zhuǎn)化能力。關(guān)于ThiO 的pH 值穩(wěn)定性研究中也存在3 h 后酶活僅殘留30%的報道[15]。相對而言，pH 值8.3 時全細胞催化劑的穩(wěn)定性最好，為最佳轉(zhuǎn)化pH 值。

2.4 外源物質(zhì)添加對乙醛酸轉(zhuǎn)化的影響

外源物（通透劑和過氧化氫酶）添加對乙醛酸轉(zhuǎn)化的影響結(jié)果如圖5 所示。其中：1 指優(yōu)化條件下空白對照組；2 指添加CTAB 組；3 指添加X-100 組；4 指添加吐溫-80 組；5 指添加過氧化氫酶組。在溫度為30 ℃、pH 值為8.3 的最佳轉(zhuǎn)化條件下，反應(yīng)初始時添加1%的CTAB，X-100 和吐溫-80 時，乙醛酸產(chǎn)量為1.52±0.03，1.45±0.02，1.51±0.03 g/L，均低于對照組（1.82±0.01 g/L）。而添加1%過氧化氫酶，則使乙醛酸產(chǎn)量提高到1.95±0.03 g/L，達到當前生物法生產(chǎn)乙醛酸最高產(chǎn)量的2.6 倍。其原因在于副產(chǎn)物過氧化氫對細胞有毒害作用，而添加過氧化氫酶消除了部分過氧化氫，使得乙醛酸的產(chǎn)量得到提高。

圖5 外源物添加對乙醛酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of additives on glyoxylic acid production

2.5 乙醛酸的規(guī)?；苽?/h3>

將全細胞轉(zhuǎn)化放大至3 L 發(fā)酵罐上進行乙醛酸的規(guī)?；苽?。轉(zhuǎn)化體系設(shè)置為50 g/L 的甘氨酸、20 g/L 的全細胞催化劑，控制反應(yīng)條件在溫度為30 ℃、pH 值8.3、通氣1 vvm、攪拌轉(zhuǎn)速500 rpm，反應(yīng)12 h。轉(zhuǎn)化過程曲線如圖6 所示。3 h 以內(nèi)，乙醛酸產(chǎn)量迅速積累至7 g/L；當轉(zhuǎn)化進行到11 h時，乙醛酸產(chǎn)量達到最大值9.75±0.13 g/L，轉(zhuǎn)化率為19.5%，轉(zhuǎn)化效率與搖瓶轉(zhuǎn)化結(jié)果一致，且到達最大產(chǎn)量的時間相比搖瓶減少了3 h，其原因是由于發(fā)酵罐具有良好的攪拌和溶氧性能；轉(zhuǎn)化進行到12 h 時，乙醛酸的產(chǎn)量總體保持穩(wěn)定。這有利于今后乙醛酸的工業(yè)化生產(chǎn)。

圖6 乙醛酸放大體系轉(zhuǎn)化生產(chǎn)過程Fig.6 Production process of glyoxylic acid conversion system

3 結(jié) 論

從表達宿主和表達載體角度出發(fā)，構(gòu)建了4 株甘氨酸氧化酶重組菌株。實驗轉(zhuǎn)化結(jié)果顯示Bacillus subtilis168 更適合作為ThiO 的表達宿主。菌株Bacillus subtilis168（pP43NMK-ThiO）實現(xiàn)了甘氨酸氧化酶胞內(nèi)可溶性表達。并首次報道利用菌體全細胞轉(zhuǎn)化甘氨酸制備乙醛酸，產(chǎn)量超越了當前生物法生產(chǎn)乙醛酸的最高產(chǎn)量。通過對反應(yīng)條件優(yōu)化及向反應(yīng)體系中添加過氧化氫酶，使得產(chǎn)量進一步提升。在3 L 罐上進行了放大體系實驗，顯示出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化效果，為全細胞法制備乙醛酸的工業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。