王兵兵,楊 爽

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院1.普外科；2.神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130021)

甲狀腺腫瘤是目前最為常見的一種內(nèi)分泌腫瘤，其中甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌中最常見的亞型，其死亡率大約為(0.2-0.6)/10萬(wàn)[1]。目前診斷甲狀腺癌的主要方法為細(xì)針抽吸細(xì)胞學(xué)檢查，此項(xiàng)檢查主要用于結(jié)節(jié)性甲狀腺疾病的鑒別診斷，成功率大約在70%左右[2]。但是此種檢查方法有創(chuàng)并且價(jià)格昂貴，雖然已廣泛應(yīng)用于臨床，但是非侵襲性的、簡(jiǎn)單、快捷、安全的診斷方法仍需要不斷的被探索。非編碼RNA目前已被大量研究證實(shí)具備診斷許多疾病的價(jià)值，環(huán)狀RNA(circRNA)被認(rèn)為最有可能成為新一代血清學(xué)診斷標(biāo)志物[3]。其閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其較普通的線性RNA能夠抵抗RNA酶的降解，更加穩(wěn)定的存在于組織和體液中，尤其是其能在血液中廣泛的存在給血清學(xué)診斷創(chuàng)造了基礎(chǔ)[4-5]。因此，本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證環(huán)狀RNA 100395在甲狀腺乳頭狀癌組織中低表達(dá)，并且circRNA100395能夠抑制TPC-1細(xì)胞的增殖和遷移，有可能成為甲狀腺乳頭狀癌新的血清學(xué)診療標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染甲狀腺癌細(xì)胞系TPC-1培養(yǎng)在含有10%血清濃度的1640培養(yǎng)基中。CircRNA100395質(zhì)粒及干擾物質(zhì)由吉瑪有限公司(上海，中國(guó))合成。將2 μl質(zhì)粒或干擾物質(zhì)連同2 μl Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑共同轉(zhuǎn)染入TPC-1細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染5小時(shí)后，更換新的1640培養(yǎng)基。48小時(shí)后獲取細(xì)胞RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證或供后續(xù)細(xì)胞增殖以及遷移實(shí)驗(yàn)使用。其中轉(zhuǎn)染circRNA100395質(zhì)粒的TPC-1命名為ov-TPC-1組，轉(zhuǎn)染circRNA100395干擾物的TPC-1命名為RNAi-TPC-1組，另將未處理的TPC-1細(xì)胞命名為control組。

1.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)大約3×103細(xì)胞鋪板于96孔培養(yǎng)板。24小時(shí)后將Cell Counting Kit 8(CCK8)試劑加入到ov-TPC-1組、RNAi-TPC-1組以及control組的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)。分別在1，2，3，4小時(shí)檢測(cè)細(xì)胞450 nm的吸光度。

1.3 平板克隆實(shí)驗(yàn)將3組細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化使之成為單細(xì)胞并將細(xì)胞密度調(diào)整至細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/mL，按照500-1000 個(gè)細(xì)胞/孔鋪種 6孔培養(yǎng)板中，每隔 3 天進(jìn)行更換培養(yǎng)液并觀察細(xì)胞狀態(tài)，顯微鏡下觀察克隆大小。當(dāng)六孔板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)終止培養(yǎng)，4%多聚甲醛固定，計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4 細(xì)胞器遷移實(shí)驗(yàn)(transwell)取24孔康寧transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)板。將20 μl基質(zhì)凝膠涂覆于透孔室，并在37℃下孵育45-60 min。將3組細(xì)胞按照每孔105個(gè)細(xì)胞鋪于上腔，同時(shí)將含20%FBS的1640培養(yǎng)基注入下腔。最終對(duì)下孔進(jìn)行蘇木精染色并計(jì)數(shù)。

1.5 MMP2及MMP9檢測(cè)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)三組細(xì)胞中MMP2及MMP9的差異表達(dá)倍數(shù)。引物序列詳見表1。

1.6 circRNA100395對(duì)甲狀腺癌診斷價(jià)值預(yù)測(cè)隨機(jī)選取10例甲狀腺癌組織以及10例癌旁正常組織手術(shù)標(biāo)本，手術(shù)切除后立即置入液氮中保存。應(yīng)用TRIzol法對(duì)液氮保存的組織進(jìn)行RNA提取，經(jīng)濃度和純度的檢測(cè)并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以及實(shí)時(shí)定量聚合酶反應(yīng)(qRT-PCR)，每個(gè)樣本重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)吉林大學(xué)倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)，全部患者簽署知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證首先對(duì)3組細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，其中ov-TPC-1組circRNA100395表達(dá)量明顯增加，是對(duì)照組表達(dá)量的2.37倍，而RNAi-TPC-1組表達(dá)量明顯下降，是對(duì)照組表達(dá)量的0.025倍(圖1A)，轉(zhuǎn)染效率良好。

2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)CCK8實(shí)驗(yàn)顯示，3組細(xì)胞的增殖程度在不同的時(shí)間段呈現(xiàn)出差異表達(dá)(P<0.05)。其中ov-TPC-1組細(xì)胞增殖程度較對(duì)照組在第2，3，4小時(shí)明顯減低而RNAi-TPC-1組細(xì)胞增殖程度明顯增加(圖1B)。平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示RNAi-TPC-1組克隆形成率(30.2±4.4)明顯較對(duì)照組(20.2±4.4)增加，而ov-TPC-1組(10.3±4.2)克隆形成率明顯較對(duì)照組下降(圖1C)。

2.3 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RNAi-TPC-1組細(xì)胞數(shù)(287.1±10.4)較control組(187.3±10.3)細(xì)胞數(shù)量顯著增加，ov-TPC-1組的TPC細(xì)胞(132.3±11.1)較對(duì)照組的TPC細(xì)胞數(shù)量顯著降低(圖2A)。MMP2和MMP9是被用來(lái)評(píng)估細(xì)胞遷移能力的2種基因表型標(biāo)志物，其高表達(dá)通常提示細(xì)胞遷移能力增加。qRT-PCR顯示MMP2(0.23±0.11)和MMP9(0.21±0.13)在ov-TPC-1組的TPC細(xì)胞較對(duì)照組表達(dá)降低，而在RNAi-TPC-1組MMP2(4.33±1.05)和MMP9(4.72±1.21)表達(dá)升高(圖2B)。

2.4 circRNA100395對(duì)甲狀腺癌診斷價(jià)值預(yù)測(cè)10例甲狀腺癌患者circRNA100395表達(dá)量明顯降低(2.34±0.32)，較癌旁正常組織表達(dá)低4.86倍，診斷陽(yáng)性率為100%。

表1 引物的具體序列

圖1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌約占全部甲狀腺惡性腫瘤的80%左右，是一種起自甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的惡性腫瘤[6]。既往在甲狀腺癌分子發(fā)病機(jī)制方面的研究主要圍繞蛋白質(zhì)組學(xué)分析來(lái)尋找發(fā)病過(guò)程中呈現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。而新近研究逐漸開始關(guān)注基因組學(xué)在發(fā)病機(jī)制中的研究，其中miRNA是研究最早的一種非編碼RNA，如miR-220,miR-221和miR-222已被證實(shí)和甲狀腺癌有關(guān)并可以作為血清學(xué)診斷的標(biāo)志物[7]。但是miRNA較容易降解，在體液中表達(dá)并不穩(wěn)定，因此更加穩(wěn)定存在于血清中的非編碼RNA仍在被探索。環(huán)狀RNA的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是血清學(xué)快速診斷疾病的新希望。CircRNA具有獨(dú)特的閉環(huán)式結(jié)構(gòu)，其能穩(wěn)定的存在于人體的體液中包括血液、尿液、腦脊液等[4]。因此檢驗(yàn)體液中circRNA含量的改變能夠?qū)σ恍┘膊∑鸬皆\斷性作用。故本文試圖通過(guò)檢測(cè)circRNA100395在甲狀腺癌組織中的表達(dá)量，并研究其具體作用機(jī)制以及潛在的診斷價(jià)值。

圖2 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

通過(guò)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌組織和癌旁正常組織進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，circRNA100395呈現(xiàn)差異性低表達(dá)。在既往的研究中，circRNA100395被認(rèn)為是一種抑癌基因參與到許多腫瘤的發(fā)病過(guò)程中。最早報(bào)道其在肺癌組織中呈現(xiàn)出差異性低表達(dá)，并且和肺癌細(xì)胞的表型改變也有密切關(guān)系[8]。隨后Chen等人[9]也發(fā)現(xiàn)circRNA100395在肝癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，并且能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。Li等人[10]發(fā)現(xiàn)circRNA100395在卵巢癌中呈現(xiàn)低表達(dá)，其可以通過(guò)miR-1228/p53/上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化軸來(lái)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移。但是circRNA100395是否也在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病過(guò)程中起到抑癌基因的作用目前報(bào)道較少。

通過(guò)對(duì)甲狀腺癌組織circRNA100395實(shí)時(shí)定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，circRNA100395呈現(xiàn)差異性低表達(dá)，差異表達(dá)倍數(shù)為4.86倍。為了進(jìn)一步研究circRNA100395在甲狀腺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制，本研究構(gòu)建了circRNA100395的質(zhì)粒以及干擾物質(zhì)。通過(guò)轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)circRNA100395的TPC-1細(xì)胞獲得更高的增殖能力，同時(shí)TPC-1細(xì)胞的克隆能力也得到了增強(qiáng)。相反在高表達(dá)circRNA100395的TPC-1細(xì)胞表現(xiàn)出了較低的增殖能力，說(shuō)明circRNA100395能夠抑制TPC-1細(xì)胞的增殖。而遷移實(shí)驗(yàn)證明低表達(dá)circRNA100395的TPC-1細(xì)胞能夠更多的通過(guò)transwell上腔最終遷移到下腔，表明遷移能力獲得了提升。對(duì)MMP2和MMP9的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)低表達(dá)circRNA100395的TPC-1細(xì)胞表達(dá)更多的MMP2和MMP9，側(cè)面說(shuō)明TPC-1細(xì)胞遷移能力獲得了提升，說(shuō)明circRNA100395能夠抑制TPC-1細(xì)胞的遷移。

綜上，circRNA100395作為腫瘤細(xì)胞中的抑癌基因，可以抑制TPC-1細(xì)胞的增殖和遷移，有望成為甲狀腺乳頭狀癌新的靶向治療手段。而其在甲狀腺乳頭狀癌患者中呈現(xiàn)特異性低表達(dá)有望成為甲狀腺乳頭狀癌新的血清學(xué)診療標(biāo)志物。