王 瑩,賈志勇，趙燕穎

(1.內(nèi)蒙古弘慈醫(yī)療集團包鋼三醫(yī)院 婦產(chǎn)科，內(nèi)蒙古 包頭014010;2.內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 普外二科；3.吉林大學第四醫(yī)院)

卵巢癌(OC)是女性生殖系統(tǒng)常見3大惡性腫瘤之一，患者病死率居婦科惡性腫瘤首位，嚴重威脅女性的健康與生命,卵巢癌惡性程度高,侵襲性強,術后復發(fā)率高,病人預后不良。鼠雙微粒體-2基因(MDM2)是近年發(fā)現(xiàn)的一種癌基因，MDM2作為一個癌基因,主要是抑制野生型p53的激活轉(zhuǎn)錄功能和抗腫瘤活性。經(jīng)研究證實，MDM2因子過度表達可使同期表達的p53下調(diào)，進而引發(fā)腫瘤[1]。相關研究結果顯示，在肺癌、骨肉瘤、膠質(zhì)瘤以及膀胱癌等疾病中，均可發(fā)現(xiàn)MDM2過度表達現(xiàn)象[2]。本研究完成了MDM2因子特異性siRNA的體外合成，對后者抑制MDM2的作用展開分析，并探究其抑制人卵巢癌SKOV-3細胞的生長增殖功能，為OC的基因治療開啟了一個新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

胎牛血清(四季青生物制品公司);LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(購自Invitrogen);IMDM培養(yǎng)基(購自Gibco);MTT(Sigma公司);SilencerTMsiRNA (Ambion公司);引物由上海生工生物技術公司合成;人卵巢癌細胞株 SKOV-3 (中國科學院上海生物化學與細胞生物學細胞所)。

1.2 siRNA 的設計和合成

參照已知Genebank所示MDM2 mRNA序列以及siRNA 的設計要求[3],借助Ambion公司的在線設計，對靶序列加以確定，同時開展同源序列搜索,以將同EST或其他編碼序列同源的那些序列排除掉。通過silencerTMsiRNA construction kit完成si-MDM2-1、si-MDM2-2的體外合成,陰性對照control siRNA為Ambion公司產(chǎn)品,同其他所有的編碼序列均不存在同源性。同時合成熒光 GFP 標記的 si-MDM2-1，si-MDM2-2及 Ctrl-siRNA。

1.3 siRNAMDM2的構建與轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人卵巢癌細胞株SKOV-3由中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所提供。在含 10%小牛血清的 IMDM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，于 5%CO2和 37℃條件下培養(yǎng)。取已達對數(shù)生長期的 SKOV3細胞，先對其實施胰酶(0.25 %)消化處理，再進行單細胞懸液的制備，借助細胞記數(shù)板對細胞量進行統(tǒng)計。將細胞按照每孔1×104細胞密度接種到 96孔板中，培養(yǎng)瓶接種 1×106,待細胞密度達到80%左右后，更換無血清的培養(yǎng)基，在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，SKOV-3細胞采用脂質(zhì)體 Lipo-fectamineTM2000 進行轉(zhuǎn)染。于轉(zhuǎn)染前1 d，挑取呈良好長勢的SKOV-3細胞接種至6孔板內(nèi)，接種密度為1×106/孔。實驗安排：對照組、未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染組、隨機亂碼組、siRNAMDM2 組，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書所示實施轉(zhuǎn)染。

1.4 Real-time PCR檢測mRNA表達

收集轉(zhuǎn)染2 d后各組細胞,分別提取總RNA，紫外分光光度計定量。引物序列如下:上游:5′-ACCTTCCAAGTGCTGGTGCT-3′,下 游： 5′-TGTCTACCATGTAGCCAGCTTTCA- 3′；β-actin，上游:5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′ 下游：5′-GGGCCGGACTCGTGATAC-3′。RNA樣品經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA,在ABI7300b熒光定量PCR儀上進行檢測。反應條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)，用2-ΔΔCt法[5]計算基因相對表達水平。實驗重復3次。

1.5 MTT檢測細胞增殖抑制率

取已達對數(shù)生長期的SKOV3細胞接種至96孔板內(nèi)，接種密度為5×103/孔,待見貼壁細胞，進行si-MDM2-1、si-MDM2-2以及controlsiRNA的轉(zhuǎn)染操作，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的終濃度為50 nmol/L,待完成1 d、2 d、3 d轉(zhuǎn)染處理,將5 mg/ml的MTT添加至各孔，各孔添加量均為15 μl，均接受4 h培養(yǎng),之后向各孔內(nèi)逐一添加DMSO，添加量均為0.15 ml,行10 min振蕩處理,借助酶標儀對570 nm下吸光度值(即A值)進行檢測。通過下述公式：細胞增殖抑制率(%)=[(1-處理組吸光度A值)/未處理組吸光度A值]×100，計算出抑制率。各組都安排4個平行孔，均進行3次重復操作。

1.6 流式細胞術檢測凋亡

取已達對數(shù)生長期的細胞接種至培養(yǎng)瓶內(nèi)，接種密度為7.5×105/瓶,分別完成2組siRNAMDM2以及controlsiRNA的轉(zhuǎn)染操作。經(jīng)3 d培養(yǎng)使收集細胞消化充分,由低溫PBS進行兩次洗滌，完成單細胞懸液的配制,由低溫乙醇(70%)固定過夜，再實施碘化丙啶染色處理，最后借助流式細胞儀對凋亡率進行測定。

1.7 Western blot檢測蛋白表達

待完成細胞轉(zhuǎn)染操作，再行3 d培養(yǎng)，培養(yǎng)結束，由PBS進行洗滌，再加入已預冷的裂解液行裂解處理，將以上各組細胞收集起來，用 100 μl 細胞裂解液(10 mM Tris-Cl,pH8.0,1 mM EDTA,2%SDS,7.5 mM DTT,10 mM PMSF)裂解,Bafford 法測定蛋白質(zhì)濃度,在 10%的 SDS-PAGE 凝膠上按每孔 50 μg 進行上樣,110 V 電壓下電泳,Bio-Rad 半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜后,依次經(jīng)過 5%脫脂牛奶封閉過夜后，由TBTS進行洗滌，于37℃下通過已行1∶200 稀釋處理的兔抗人MDM2以及β-actin單克隆抗體行120 min振蕩處理,再由TBST洗滌,接著于37℃下通過已行1∶1 000稀釋處理的山羊抗兔二抗實施60 min反應,再由TBST洗滌,最后DAB顯色 。同時選擇 β-actin 做內(nèi)參,所有結果掃描后,用圖像分析系統(tǒng)測定各條帶灰度值，來反映蛋白的表達變化。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 siRNAMDM2轉(zhuǎn)染 SKOV-3 細胞效率的結果觀察

逐一用50 nmol/L、80 nmol/L與100 nmol/L濃度進行SKOV-3細胞轉(zhuǎn)染操作，待轉(zhuǎn)染完成，借助熒光倒置顯微鏡，發(fā)現(xiàn)細胞中見綠色熒光，可判定轉(zhuǎn)染有效(圖1)。經(jīng)過1 d，于100×鏡下經(jīng)隨機方式確定出5個視野，對視野內(nèi)總細胞、熒光細胞的數(shù)量進行分別統(tǒng)計，對轉(zhuǎn)染效率進行求解。此次試驗實現(xiàn)了80%的轉(zhuǎn)染效率，結果表明，濃度為80 nmol/L時可獲得最大的轉(zhuǎn)染效率，故而，此次實驗確定siRNA的轉(zhuǎn)染濃度為80 nmol/L。

A:未轉(zhuǎn)染 siRNAMDM2時SKOV-3細胞圖 B:有效轉(zhuǎn)染 si-MDM2-1 后 SKOV-3 細胞圖 C:有效轉(zhuǎn)染 si-MDM2-2后 SKOV-3 細胞圖

2.2 siRNA轉(zhuǎn)染后對SKOV-3細胞 MDM2基因表達的影響

為檢測siRNA對SKOV-3細胞中MDM2基因mRNA表達的影響，收集各組獲得的細胞株以及未轉(zhuǎn)染對照細胞，采用熒光定量PCR檢測各組細胞中MDM2基因mRNA表達水平變化，結果如圖2所示，在MDM2-mRNA 表達量方面，相比對照組，轉(zhuǎn)染 si-MDM2-1下調(diào)到48.41%，si-MDM2-2則下調(diào)到46.51%，表達水平均顯著下調(diào)(P<0.05)，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義。說明siRNA MDM2靶向序列具有較高的沉默效率，基因干擾實驗mRNA水平驗證符合預期。

圖2 siRNA對卵巢癌SKOV-3細胞MDM2mRNA表達的影響

2.3 MTT 法檢測細胞增殖抑制

經(jīng)MTT 法測定發(fā)現(xiàn)，結果如圖3所示，轉(zhuǎn)染 si-MDM2后，不管是細胞的分裂指數(shù)，還是其增殖速度，均受到了大幅抑制；比空白對照組和陰性對照組減低(P<0.05);隨著轉(zhuǎn)染時間的延長細胞生長的抑制率逐漸增高。在增殖抑制率方面，相較空白對照組，si-MDM2-1組和 si-MDM2-2 組均表現(xiàn)出顯著不同(P<0.05);同時，在1 d、2 d、3 d這3個時間節(jié)點上，細胞增殖抑制率與陰性對照組和空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以上實驗說明，MDM2 具有促進細胞增殖的能力。

圖3 si-MDM2對細胞增殖的影響

2.4 si-MDM2轉(zhuǎn)染后對SKOV-3細胞凋亡的影響

待si-MDM2-1、2轉(zhuǎn)染完成后的3 d,經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡率依次是47.8%，38.2%，細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義。流式細胞儀檢測細胞周期結果顯示si-MDM2-1組和si-MDM2-2組細胞處在S期的占比依次是28.8%、30.1%,相較于對照組55.3%的占比明顯較低;在細胞處在G0/G1期的占比而言，相較于對照組，上述兩組則偏高，差異有統(tǒng)計學意義。

2.5 siRNAMDM2轉(zhuǎn)染后對SKOV-3細胞 MDM2蛋白表達的影響

Western blot結果顯示SKOV-3細胞轉(zhuǎn)染后各組β-actin蛋白表達量基本相同，陰性對照組和空白組的各目的蛋白表達量相似，si-MDM2-1和si-MDM2-2組的各目的蛋白表達量相似，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。和對照組比較，轉(zhuǎn)染2組siRNAMDM2的MDM2蛋白表達水平明顯降低，和空白組比較轉(zhuǎn)染2組si-MDM2的MDM2/β-actin平均下調(diào)51.30%，結果如圖4所示。

圖4 轉(zhuǎn)染后各組中SKOV-3 中MDM2mRNA蛋白的表達的變化

3 討論

卵巢癌是臨床上婦科腫瘤中最常見的一種。卵巢癌起病隱匿，目前尚缺乏有效的早期診療手段。近幾年，已認識到諸多促癌因子與抑癌因子異常表達可引發(fā)OC以及促進其發(fā)展[4]?；蛑委熞殉蔀槁殉舶┲委煹男峦緩?。尤其是MDM2基因的擴增或過表達與 p53 抑癌基因的失活在促進卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起著舉足輕重的作用。

抑癌基因p53誘導細胞凋亡和DNA修復,而MDM2能夠結合野生型p53蛋白而產(chǎn)生復合體，來負向調(diào)控p53,導致后者受抑或喪失全部活性,對于腫瘤形成起到關鍵性作用[5]。經(jīng)研究證實，抑癌因子p53的失活、原癌因子MDM2的活化，可對細胞異常增殖起到促進作用，由此引發(fā)腫瘤[6]。p53突變失活是發(fā)生率較高的其中一類遺傳學改變，MDM2同卵巢腫瘤的擴增、腫瘤復發(fā)與轉(zhuǎn)移存在一定聯(lián)系。 Gu J與Peres LC[7-8]等曾報道在卵巢癌中有MDM2因子過度表達現(xiàn)象。同時觀察到高度惡性的腫瘤細胞內(nèi)存在MDM2高表達現(xiàn)象;因此可判斷，MDM2同OC等腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移存在一定聯(lián)系。

siRNA能夠?qū)ο鄳虻膍RNA施以特異性降解作用,使此基因表達減弱。微量siRNA就能夠大幅降低其編碼致病因子的含量,實現(xiàn)剔除目的;此外,在抑制效應方面，siRNA表現(xiàn)出嚴格的序列特異性,具備良好的治療針對性，且不良反應弱，能夠?qū)Π┗?、癌癥相關因子等的高表達施以特異性抑制。故而，對于腫瘤基因治療，siRNA技術提供了一項新研究方法與新技術平臺。

此次實驗完成了針對MDM2的兩對干擾位點序列si-MDM2的人工設計與合成[3]。si-MDM2真核表達質(zhì)粒完成OC細胞SKOV-3有效轉(zhuǎn)染，開展基因水平與凋亡的測定。在干擾效果上，MDM2的兩個干擾位點均表現(xiàn)出高效性。經(jīng)Real-time PCR 測定發(fā)現(xiàn)，si-MDM2可對MDM2因子表達施以有效抑制,采用 MTT 法檢測 si-RNA對細胞生長的抑制作用，瞬時轉(zhuǎn)染si-MDM2-1和si-MDM2-2能有效抑制細胞增殖,與對照組和陰性轉(zhuǎn)染組相比，SKOV-3細胞生長抑制作用明顯，細胞倍增時間延長。流式細胞術檢測si-MDM2可誘發(fā)腫瘤細胞凋亡，并導致S期細胞量下降，G0/G1期細胞占比提高，其細胞阻滯效應可能是其能夠誘發(fā)細胞凋亡的其中一項機制。提示 siRNA基因能明顯抑制SKOV-3細胞的增殖性。

此次實驗在趙燕穎[9]等研究者探究si-MDM2影響肝癌細胞增殖的基礎上，進一步證實si-MDM2也可有效抑制卵巢癌細胞增殖以及有效誘導此類細胞凋亡。表明MDM2在OC治療方面發(fā)揮著關鍵性作用。通過上述分析可明確，將siRNA技術融入到基因療法中，可使OC細胞株 SKOV-3增殖明顯受抑，能夠有效抑制細胞生長，倍增時間延長，對MDM2表達施以特異性干擾具備作為治療OC新途徑的潛力。