王晶瑩,劉 洋,劉啟迪

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科;b.呼吸內(nèi)科,吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)院 放射線科)

人組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(TGM2)是一種具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)(TGase)、G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和激酶活性的多功能酶，被認(rèn)為在多種疾病中起作用。TGM2的mRNA通過選擇性剪接進(jìn)行調(diào)控，產(chǎn)生C端截短形式的TGM2，被預(yù)測具有獨(dú)特的生化特性和生物學(xué)功能。本研究將生物信息學(xué)手段聯(lián)合臨床分析，基于Western blot方法及免疫組化法驗(yàn)證并觀察蛋白TGM2在肺癌中的表達(dá)及診斷意義。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集就診于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院同時臨床確診為肺癌患者的腫瘤組織及癌旁組織(男性22例，女性28例)，取少量新鮮組織標(biāo)本，快速、低溫條件下，PBS洗滌組織標(biāo)本，以手術(shù)消毒剪刀將組織分為較小塊狀，置于凍存管中。液氮保存，備用。

1.2 方法

1.2.1蛋白提取 取組織，在液氮中研磨，加入組織蛋白裂解液，低溫震蕩，冰敷，此步驟重復(fù)三次。低溫超速離心機(jī)離心(Tempreture:4℃,speed:12 000 rpm/min,time:1 h),將上清取少量用于蛋白濃度測定，其余大部分上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，-80℃保存，備用。

1.2.2Western blot 微量加樣器取經(jīng)預(yù)處理的蛋白樣品，注入凝膠內(nèi)，電壓110 V。將凝膠電泳分離的蛋白進(jìn)行切割，留取目的蛋白所在凝膠片段，置于已經(jīng)完成活化的膜上，電流 90 mA，1 h，5%脫脂奶粉封閉。稀釋TGM2抗體，4℃，孵育過夜。PBS-吐溫洗膜。脫脂奶粉稀釋二抗，室溫孵育2 h；洗膜?；瘜W(xué)發(fā)光法曝光。

1.2.3生物信息數(shù)據(jù)庫分析 登錄TCGA數(shù)據(jù)庫，檢索肺癌組織中差異表達(dá)的基因，并根據(jù)表達(dá)的差異水平，對差異基因進(jìn)行篩選。

1.2.4免疫組化 將肺癌的病理切片進(jìn)行脫蠟，再經(jīng)酶滅活、抗原修復(fù)、冷卻、PBS沖洗等一系列的預(yù)處理，將稀釋的一抗滴加至組織切片上，低溫孵育過夜；常溫孵育二抗，4小時。顯色，復(fù)染，分化，返藍(lán)，封片。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0分析，組間差異采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫檢索

TGM2在肺癌中的基因表達(dá)水平，通過檢索TCGA數(shù)據(jù)庫，結(jié)果如圖1所示，肺癌組織中的TGM2基因顯著低于癌旁組織。

圖1 差異表達(dá)基因TGM2在TCGA數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果

2.2 Western blot分析TGM2的表達(dá)水平

Western blot分析肺癌組織及癌旁組織中蛋白TGM2的表達(dá)，結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)TGM2在肺癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織。

圖2 TGM2在肺癌及癌旁組織中的表達(dá)

2.3 TGM2的表達(dá)與臨床分析

免疫組化實(shí)驗(yàn)中，對組織切片進(jìn)行染色，結(jié)果如圖3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，如表1，發(fā)現(xiàn)TGM2蛋白在肺癌組織中有更顯著的低表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖3 TGM2在肺癌及癌旁正常組織中的表達(dá)(×200)

表1 肺癌與癌旁組織中TGM2蛋白表達(dá)情況對比

3 討論

TGM2是谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶家族中最復(fù)雜和最普遍的成員，它通過引入高度穩(wěn)定的ε-(γ-谷氨酰胺基)賴氨酸異肽鍵或在Ca2+存在下在選定的肽結(jié)合谷氨酰胺殘基上結(jié)合多胺來催化蛋白質(zhì)的翻譯后修飾[1]。此外，TGM2還可以水解核苷酸三磷酸鳥嘌呤(GTP)，并作為蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、激酶[1-2]。在生理學(xué)上，TGM2被認(rèn)為是細(xì)胞或組織防御機(jī)制的一個組成部分；它的表達(dá)經(jīng)常被上調(diào)，以應(yīng)對細(xì)胞損傷或其他應(yīng)激源，以保護(hù)細(xì)胞免受內(nèi)源性和環(huán)境壓力的影響，并在以后修復(fù)組織以實(shí)現(xiàn)持續(xù)的體內(nèi)平衡。

最近的一些研究認(rèn)為TGM2在多種癌癥中的表達(dá)異常[3-7]。重要的是，TGM2表達(dá)的增加通常與耐藥性有關(guān)[4-7]。對區(qū)域特異性DNA甲基化的詳細(xì)分析表明，TGM2是參與的基因之一，其表達(dá)水平因耐藥癌細(xì)胞的甲基化的狀態(tài)而改變[8]。在后來的一項(xiàng)研究中，科研人員[9]觀察到TGM2基因是耐藥癌細(xì)胞表觀遺傳沉默的一個有希望的靶點(diǎn)，其甲基化狀態(tài)可以作為化療敏感性腫瘤的標(biāo)記物。同樣，TGM2在腫瘤標(biāo)本中的表達(dá)與患者的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散和不良的疾病預(yù)后相關(guān)[5,7]。利用功能喪失和獲得的方法，一些研究者報(bào)告了TGM2的異常表達(dá)促進(jìn)了對化療藥物的抵抗和癌細(xì)胞的侵襲性[4-9]。TGM2也與表皮生長因子受體介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生有關(guān)[10]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α、Akt和黏著斑激酶(FAK)的激活以及腫瘤抑制因子PTEN(第10號染色體上缺失的磷酸酶和張力素同源物)的下調(diào)是TGM2表達(dá)的常見反應(yīng)途徑。最近，TGM2在絲氨酸216處的磷酸化被認(rèn)為是誘導(dǎo)NF-κB和Akt激活和PTEN下調(diào)的關(guān)鍵[11]。本研究通過對TGM2在肺癌中的表達(dá)水平的研究，認(rèn)為TGM2可作為肺癌潛在的腫瘤標(biāo)志物。