張匯征，李 桓，張 珍，李俊剛，王 靜，廖傳玉，周 剛，陳耀凱，嚴(yán)曉峰，羅 明*

(重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心 1.中心實(shí)驗(yàn)室；2.感染科；3.藥劑科；4.結(jié)核科，重慶400036)

結(jié)核病(TB)是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)引起的慢性傳染病。中國(guó)是30個(gè)結(jié)核高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，同時(shí)也是耐多藥結(jié)核(MDR-TB)高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一。2010年第五次中國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查的結(jié)果顯示,中國(guó)現(xiàn)有活動(dòng)性肺結(jié)核患者總數(shù)為523萬(wàn)，其中傳染性肺結(jié)核患者總數(shù)為134萬(wàn)。特別值得注意的是，此次調(diào)查顯示中國(guó)肺結(jié)核患者耐多藥率為6.8%，情況十分嚴(yán)重[1]。WHO估算2016年中國(guó)結(jié)核病患病人數(shù)約為78萬(wàn)人，其中MDR-TB患者約5.8萬(wàn)人[2]。

結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的快速檢測(cè)是結(jié)核病臨床診斷一直以來(lái)的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。傳統(tǒng)的檢測(cè)如涂片鏡檢，其靈敏度較低；細(xì)菌的培養(yǎng)(包括固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng))，需要數(shù)周時(shí)間；而藥敏實(shí)驗(yàn)不僅耗時(shí)長(zhǎng)，更需要在生物安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行相關(guān)操作，在一般的區(qū)縣結(jié)防機(jī)構(gòu)和醫(yī)院中難以推廣，難以滿(mǎn)足臨床的需要[3]。因此，近年來(lái)，分子診斷技術(shù)因其快速及高靈敏度，被更多的應(yīng)用于結(jié)核的檢測(cè)[4]。

重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心自2016年7月采用熒光PCR熔解曲線(xiàn)法對(duì)病人利福平和異煙肼的耐藥性進(jìn)行檢測(cè)。本研究將通過(guò)對(duì)臨床數(shù)據(jù)的回顧性分析，評(píng)估熒光PCR熔解曲線(xiàn)法在結(jié)核病臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心2016年7月至2018月7月進(jìn)行過(guò)熒光PCR熔解曲線(xiàn)法結(jié)核檢測(cè)的患者1 048例，其中男性630例，女性418例，年齡8-83歲。樣品包含痰液，腦脊液，膿液，纖支鏡灌洗液，胸水和穿刺液。

1.2 主要試劑與儀器

CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad)；MGIT960結(jié)核菌快速培養(yǎng)儀(BD)；thermo scientific高速冷凍離心機(jī)；Genexpert全自動(dòng)熒光定量PCR工作站及MTB/RIF檢測(cè)試劑盒(Cephid)；利福平耐藥檢測(cè)試劑盒和異煙肼耐藥檢測(cè)試劑盒，Lab-Aid 820 結(jié)核分枝桿菌核酸提取試劑盒和Lab-Aid 824 核酸提取儀購(gòu)自廈門(mén)致善生物。

1.3 方法

1.3.1分離培養(yǎng) 樣品培養(yǎng)前處理按照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》[5]中關(guān)于堿處理-中和離心沉淀法的要求進(jìn)行，并按照BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)操作說(shuō)明書(shū)將前處理后的沉淀物接種于MGIT960培養(yǎng)管。

1.3.2結(jié)核菌的藥敏試驗(yàn) 改良羅氏比例法參照《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》的要求操作[6]；Genexpert按Cephid公司操作指南進(jìn)行；熒光PCR熔解曲線(xiàn)法參照試劑盒配套說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，所有樣品用Lab-Aid 820 結(jié)核分枝桿菌核酸提取試劑盒和Lab-Aid 824 核酸提取儀處理，提取基因組DNA；取5 μl核酸加入含20 μl PCR反應(yīng)液的PCR管中，放入CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增和熔解曲線(xiàn)分析。PCR程序如下：UNG處理50℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；預(yù)變性95℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；Touchdown循環(huán)95℃ 15 s，70℃ 20 s(每個(gè)循環(huán)下降1℃)，13個(gè)循環(huán)；PCR循環(huán)76℃ 25 s，95℃ 15 s，57℃ 20 s，76℃ 25 s，42個(gè)循環(huán)。熔解分析：95℃ 2 min，40℃ 2 min，45℃-85 ℃(設(shè)置在此階段每1 ℃采集FAM和TET通道熒光信號(hào))，1個(gè)循環(huán)。當(dāng)樣品的熔解溫度(Tm)與陽(yáng)性對(duì)照的Tm一致(誤差不超過(guò)1℃)時(shí)判定為野生型；樣本的Tm低于陽(yáng)性對(duì)照2℃或2℃以上時(shí)判定為突變型。當(dāng)利福平或異煙肼任一抗生素檢測(cè)體系有兩個(gè)通道以上有有效信號(hào)時(shí)，判定檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌。金標(biāo)準(zhǔn)為分枝桿菌培養(yǎng)或Genexpert任一檢驗(yàn)TB陽(yáng)性判定該標(biāo)本為T(mén)B陽(yáng)性。

1.3.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用Microsoft Excel軟件進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 13．0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)結(jié)果

1 048例標(biāo)本中，MGIT960培養(yǎng)和Genexpert共檢測(cè)到619例TB陽(yáng)性，429例陰性。陽(yáng)性標(biāo)本中，培養(yǎng)法檢測(cè)到314例，Genexpert檢測(cè)到574例，熔解曲線(xiàn)法檢測(cè)到318例。三種方法的敏感度分別為MGIT960 50.73%，Genexpert 92.73%，PCR熔解曲線(xiàn)法51.37%。PCR熔解曲線(xiàn)法的特異度為93.24%(400/429)。

2.2 結(jié)核分枝桿菌藥敏檢測(cè)結(jié)果

共有185例標(biāo)本同時(shí)完成了表型藥敏檢測(cè)和PCR熔解曲線(xiàn)法檢測(cè)。PCR熔解曲線(xiàn)法檢測(cè)利福平藥敏的靈敏度為93.2%，特異度為80.2%，符合率為84.3%；檢測(cè)異煙肼藥敏的靈敏度為92.6%，特異度為86.3%，符合率為88.6%。見(jiàn)表1。

表1 PCR熔解曲線(xiàn)法與比例法檢測(cè)RIF和INH藥敏結(jié)果比較

3 討論

結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段，也是制定結(jié)核病治療方案的重要依據(jù)。長(zhǎng)期以來(lái)，結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要還是依靠涂片鏡檢和細(xì)菌培養(yǎng)，存在靈敏度低(涂片鏡檢)和操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)(結(jié)核細(xì)菌培養(yǎng))等缺點(diǎn)，而獲得結(jié)核藥敏需時(shí)更長(zhǎng)[4]。利福平和異煙肼是治療結(jié)核病的主要一線(xiàn)藥物，同時(shí)耐這兩種藥物的結(jié)核稱(chēng)為耐多藥結(jié)核(MDR-TB)。MDR-TB治療難度大、治愈率低、病死率高，發(fā)現(xiàn)不及時(shí)會(huì)導(dǎo)致新的耐藥產(chǎn)生和MDR-TB的傳播[2,7]。目前發(fā)現(xiàn)基因突變是結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制，如利福平的耐藥主要由rpoB基因突變引起，異煙肼的耐藥相關(guān)基因有inhA，katG和ahpC等[8]。

熒光PCR熔解曲線(xiàn)是近年來(lái)應(yīng)用于結(jié)核檢測(cè)的一種分子檢測(cè)方法，具有準(zhǔn)確，快速，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，被用于檢測(cè)對(duì)利福平，異煙肼，喹諾酮類(lèi)，乙胺丁醇以及吡嗪酰胺等藥物耐藥的結(jié)核病[9-13]。但是目前的研究主要是用分離培養(yǎng)獲得的菌株作為檢測(cè)樣品，直接以臨床標(biāo)本作為檢測(cè)樣品的研究還較少[10,14-16]。

本研究選取2016年7月至2018年7月在重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心檢驗(yàn)科進(jìn)行熒光PCR熔解曲線(xiàn)結(jié)核檢測(cè)的1 048例病例，將其檢測(cè)結(jié)果分別與培養(yǎng)和Genexpert的結(jié)果比較其對(duì)結(jié)核檢測(cè)的靈敏度。結(jié)果顯示，熒光PCR熔解曲線(xiàn)法的檢測(cè)靈敏度(51.37%)與MGIT960液體培養(yǎng)(50.73%)相近，但低于Genexpert(93.24%)。其原因可能是，第一，熒光PCR熔解曲線(xiàn)法和Genexpert雖然都是基于熒光PCR的檢測(cè)方法，但是Genexpert一個(gè)檢測(cè)用的樣品量較大(1 ml)，而熒光PCR熔解曲線(xiàn)法的上樣量小(5 μl DNA)；第二，熒光PCR熔解曲線(xiàn)法樣品需處理提取核酸，難免會(huì)導(dǎo)致樣品量的損失，因此降低了其靈敏度。

與傳統(tǒng)藥敏比較，PCR熔解曲線(xiàn)法檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥的靈敏度高(>90%)，特異度和符合率較高(>80%)，與之前對(duì)痰液的研究結(jié)果一致[17]，說(shuō)明PCR熔解曲線(xiàn)法不僅可以用來(lái)檢測(cè)痰液也可以用來(lái)檢測(cè)其他臨床樣品。

總之，通過(guò)本研究，熒光PCR熔解曲線(xiàn)法可以直接對(duì)臨床樣本快速檢測(cè)結(jié)核菌及其耐藥性，具有有效、可靠、靈敏度高的特點(diǎn)，能夠及時(shí)對(duì)臨床制定治療方案提供依據(jù)。