陳春麗，沈 力，沈夢(mèng)露，王婷婷，鄧鑫州*

[1.湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院) 腫瘤科，湖北 十堰442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，湖北 十堰442000]

宮頸癌是導(dǎo)致中青年女性癌癥患者死亡重要原因[1]。p16INK4a與宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和宮頸癌的發(fā)生發(fā)展具有緊密的聯(lián)系，p16INK4a蛋白的表達(dá)水平能夠有效反映機(jī)體感染HR-HPV后對(duì)DNA整合狀態(tài)、致瘤風(fēng)險(xiǎn)的大小以及癌基因的表達(dá)活性[2-4]。因此，作為新一代的子宮頸細(xì)胞學(xué)檢查方法，p16INK4a免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)有潛力成為優(yōu)選女性宮頸癌篩查方法，為早期宮頸癌診斷提供重要幫助。本研究通過(guò)比較p16INK4a免疫細(xì)胞化學(xué)染色、宮頸薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查(TCT)及高危人乳頭瘤病毒(HR-HPV)檢測(cè)對(duì)宮頸癌篩查的結(jié)果，旨在評(píng)價(jià)p16INK4a染色作為人群宮頸病變初篩及早期診斷宮頸癌的可行性及有效性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象于2019年2月至2019年12月招募湖北十堰地區(qū)1927例女性作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡在25-50歲，有性生活史；②既往無(wú)宮頸病變或?qū)m頸癌病史；③既往未行子宮放療或?qū)m頸切除手術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病；②全身基礎(chǔ)條件差，合并其他系統(tǒng)的嚴(yán)重疾病。所有受檢者均簽署知情同意書(shū)，并接受宮頸HR-HPV檢測(cè)、TCT、p16INK4a檢查。本項(xiàng)目經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1宮頸細(xì)胞學(xué)檢查 采集樣本利用AutoCyte制片機(jī)(TriPathImaging公司，美國(guó))制成宮頸脫落細(xì)胞液基薄片，經(jīng)染色后封片。閱片標(biāo)準(zhǔn)為2001版Bethesda陰道或?qū)m頸細(xì)胞學(xué)診斷的系統(tǒng)[5]。當(dāng)結(jié)果TCT高于低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)/不典型腺細(xì)胞(AGC)為陽(yáng)性。

1.2.2高危HPV檢測(cè) 采用CobasX480核酸自動(dòng)提取儀和CobasZ480擴(kuò)增分析儀(Roche公司，美國(guó))進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)全自動(dòng)樣品制備與即時(shí)PCR擴(kuò)增技術(shù)得到HPV16型、18型、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68的混合結(jié)果。

1.2.3p16INK4a免疫細(xì)胞染色 利用p16INK4a蛋白單克隆鼠抗人抗體(森盈生物科技有限公司，深圳)進(jìn)行多聚螯合物酶法染色。在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)p16INK4a位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈深棕色和棕黃色。發(fā)現(xiàn)p16INK4a著色的細(xì)胞≥1個(gè)即為陽(yáng)性。染色結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 p16INK4a陰性(左)，p16INK4a陽(yáng)性(右)，×100倍

1.2.4陰道鏡活檢病理診斷 初篩時(shí)任一項(xiàng)目結(jié)果陽(yáng)性即需接受陰道鏡下宮頸管搔刮加四象限定點(diǎn)加隨機(jī)活檢(POI)方案活檢。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2017版中國(guó)宮頸癌篩查及異常管理相關(guān)問(wèn)題專家共識(shí)[6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS25軟件處理數(shù)據(jù)。率的比較采用卡方檢驗(yàn)、Fisher確切概率法。不同方法識(shí)別CIN的靈敏度、特異度的差異比較采用McNemar檢驗(yàn)。閱片醫(yī)師判讀p16INK4a和TCT檢測(cè)結(jié)果的一致性通過(guò)計(jì)算Kappa值進(jìn)行比較，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總體篩查結(jié)果完成篩查人群共計(jì)1927例，任一篩查項(xiàng)目為陽(yáng)性者比率為13.91%(268/1927)，其中p16INK4a陽(yáng)性率7.06%(136/1927)，TCT陽(yáng)性率為4.77%(92/1927)，HR-HPV陽(yáng)性率8.46%(163/1927)。首篩陽(yáng)性人群中回叫應(yīng)答率為83.21%(223/268)，均接受陰道鏡檢查，病理診斷結(jié)果176例為非CIN(單純HPV感染或慢性宮頸炎)，27例為CIN1期病變，11例為CIN2期病變，9例為CIN3期病變。

2.2 不同級(jí)別宮頸病變不同檢測(cè)方法的陽(yáng)性率比較根據(jù)病例診斷結(jié)果將首篩陽(yáng)性的患者分為非CIN組、低級(jí)別病變組(CIN1期)和高級(jí)別病變組(CIN2期、3期)。在非CIN組中p16INK4a陽(yáng)性率高于TCT陽(yáng)性率(χ2=5.142，P=0.029)，低于HR-HPV的陽(yáng)性率(χ2=6.372，P=0.016)；在低級(jí)別病變組中p16INK4a的陽(yáng)性率與TCT和HR-HPV檢測(cè)相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在高級(jí)別病變組，p16INK4a陽(yáng)性率也與TCT和HR-HPV檢測(cè)相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，以非CIN組、低級(jí)別病變組和高級(jí)別病變組為序，p16INK4a的陽(yáng)性率明顯提高，隨著CIN病變級(jí)別的提高呈現(xiàn)出趨勢(shì)性增加(χ2=9.074，P=0.002)，詳見(jiàn)表1。

表1 不同篩查方法陽(yáng)性率的比較[n(%)]

2.3 p16INK4a與TCT閱片結(jié)果一致性比較共有1595例p16INK4a、1768例TCT標(biāo)本由兩位閱片經(jīng)驗(yàn)豐富的高年資病理學(xué)醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立盲法閱片。對(duì)p16INK4a結(jié)果判讀的陰性一致率、陽(yáng)性一致率和整體一致性均明顯高于TCT(P<0.001)，其中對(duì)TCT閱片結(jié)果的Kappa值為0.573，而對(duì)p16INK4a閱片結(jié)果的Kappa值為0.944，詳見(jiàn)表2。

2.4 p16INK4a、TCT以及HPV檢查在宮頸癌篩查中的效能比較在排除45例首篩陽(yáng)性但未接受陰道鏡檢查明確診斷的患者，最終納入1882例受檢者進(jìn)行篩查效能分析。p16INK4a、TCT及HR-HPV檢測(cè)篩出CIN病變的的靈敏度分別為82.98%(39/57)、74.47%(35/57)和87.23%(41/57)，特異度依次為85.78%(1574/1835)、74.93%(1365/1835)和86.76%(1592/1835)。其中靈敏度p16INK4a與HR-HPV均明顯大于TCT(P<0.05)，但二者間無(wú)明顯差異(P>0.05)，而特異度p16INK4a與TCT明顯大于HR-HPV(P<0.05)，但二者間無(wú)明顯差異(P>0.05)。

表2 p16INK4a與TCT檢查結(jié)果判讀一致性比較(%)

3 討論

TCT與HR-HPV檢測(cè)是目前宮頸癌篩查的主要方法,其中HR-HPV檢測(cè)應(yīng)用最為廣泛，具有較高的敏感性，但是特異度低，可能會(huì)產(chǎn)生過(guò)度干預(yù)或者不必要的陰道鏡轉(zhuǎn)診，提高了醫(yī)療成本，并有可能引起受檢者的焦慮緊張情緒[7]；而TCT檢查的敏感度相對(duì)較低，由于判讀具有主觀性，結(jié)果容易因閱片醫(yī)師的不同而產(chǎn)生差異，可能會(huì)導(dǎo)致誤診漏診，對(duì)技術(shù)人才的依賴性也較高，在資源匱乏的地區(qū)難以實(shí)現(xiàn)大范圍的篩查工作[8]。因此，臨床上亟待改進(jìn)宮頸癌的篩查方法，通過(guò)探尋更精確有效而又客觀易行的生物學(xué)標(biāo)志物來(lái)對(duì)宮頸癌的篩查方案進(jìn)行優(yōu)化十分必要。

p16INK4a能夠判斷機(jī)體是否因HPV感染而影響宮頸細(xì)胞周期調(diào)控[9]。與傳統(tǒng)宮頸癌篩查方法相比，通過(guò)對(duì)子宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行p16INK4a免疫細(xì)胞染色，能夠根據(jù)細(xì)胞著色結(jié)果進(jìn)行判讀，而不僅僅依靠細(xì)胞的形態(tài)，因此最大限度地降低了主觀因素帶來(lái)的偏倚[10]。因此p16INK4a檢查經(jīng)過(guò)短期的系統(tǒng)培訓(xùn)即可閱片，對(duì)病理醫(yī)師診斷經(jīng)驗(yàn)的要求較低。另一方面，雖然HR-HPV檢測(cè)能夠篩查出宮頸病變的患者，但目前尚無(wú)足夠的證據(jù)表明其能反映病變的程度[11]。而Wu等[12]則發(fā)現(xiàn)，p16INK4a染色能夠有效地鑒別低級(jí)別與高級(jí)別的CIN。在本次研究中，隨著宮頸病變程度的加重，p16INK4a的陽(yáng)性率明顯呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。p16INK4a染色能夠?qū)R-HPV持續(xù)感染的細(xì)胞進(jìn)行定位，進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行觀察判斷，能夠很大程度地增強(qiáng)甄別不典型細(xì)胞的能力，從而提高篩查的準(zhǔn)確率。在非CIN組中p16INK4a陽(yáng)性率低于HR-HPV的陽(yáng)性率，但高于TCT陽(yáng)性的比率，而在低級(jí)別和高級(jí)別病變組中p16INK4a的陽(yáng)性率與TCT和HR-HPV檢測(cè)相近，同樣能夠準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)可能發(fā)生的病變風(fēng)險(xiǎn)。

為了驗(yàn)證本研究中免疫細(xì)胞染色p16INK4a作為篩查宮頸癌的生物學(xué)標(biāo)志物的穩(wěn)定性，本次研究對(duì)兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的高年資閱片醫(yī)師的結(jié)果進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示二者的p16INK4a判讀結(jié)果無(wú)論是陰性還是陽(yáng)性的樣本判讀的一致性都很高，明顯大于對(duì)TCT判讀的陽(yáng)性一致率，進(jìn)一步證明了p16INK4a染色結(jié)果判讀具有客觀性和可重復(fù)性，受閱片醫(yī)師的影響很小。在既往報(bào)道中，有學(xué)者也通過(guò)兩名醫(yī)師對(duì)宮頸癌篩查細(xì)胞學(xué)Ki-67/p16雙染結(jié)果進(jìn)行判讀，其陽(yáng)性、陰性、整體一致性的Kappa值分別為0.641、0.629以及0.612[13]。而另一項(xiàng)研究中，通過(guò)7名醫(yī)師對(duì)HPV陽(yáng)性女性的細(xì)胞樣本Ki-67/p16雙染結(jié)果進(jìn)行判讀，整體一致性的Kappa值為0.74[14]。

本研究還對(duì)p16INK4a篩查識(shí)別高級(jí)別宮頸病變的特異度及靈敏度進(jìn)行了分析，分別為95.3%和90.0%，與TCT靈敏度和HR-HPV檢測(cè)陽(yáng)性的特異度均無(wú)明顯差異。近來(lái)歐洲一項(xiàng)大型橫斷面臨床研究中，通過(guò)招募27349名女性進(jìn)行HPV檢測(cè)、巴氏細(xì)胞學(xué)檢查和p16INK4a/Ki-67雙染檢測(cè)，結(jié)果顯示p16INK4a/Ki-67雙染在識(shí)別CIN2期病變和CIN3期病變時(shí)的特異度為95.2%和94.8%，與巴氏細(xì)胞學(xué)檢查相當(dāng)(95.4%和95.1%)，但是p16INK4a的識(shí)別靈敏度卻明顯高于巴氏細(xì)胞學(xué)檢查(86.7% vs 68.5%和87.4% vs 73.6%)[15]，說(shuō)明p16INK4a能夠更加精準(zhǔn)地對(duì)人群宮頸病變情況進(jìn)行篩查，尤其是在細(xì)胞學(xué)檢查尚不發(fā)達(dá)的地區(qū)，p16INK4a染色可能是TCT的有效替代方案。

綜上所述，本研究認(rèn)為p16INK4a染色在以人群為基礎(chǔ)的宮頸癌初篩中對(duì)宮頸病變識(shí)別特異度與TCT相當(dāng)，敏感度與HR-HPV檢測(cè)相當(dāng)，在宮頸癌的早期識(shí)別中具有一定優(yōu)勢(shì)。p16INK4a染色作為新一代宮頸細(xì)胞檢查技術(shù)，其結(jié)果易判讀，可重復(fù)，客觀性強(qiáng)，兼具高特異度與高敏感性，有潛力成為大范圍人群普篩與精確轉(zhuǎn)診的優(yōu)選技術(shù)。并且，p16INK4a染色簡(jiǎn)捷快速、成本較低，符合我國(guó)國(guó)情，適合在廣大基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)中實(shí)施，但由于本研究?jī)H為橫斷面研究，具有一定局限性，將來(lái)需納入更大樣本量進(jìn)行長(zhǎng)期的前瞻性研究，從而進(jìn)一步評(píng)估p16INK4a染色對(duì)于宮頸病變轉(zhuǎn)歸及預(yù)后的預(yù)測(cè)作用。