孫 瑩，李相軍，于鵬躍，姜一寧，宋燕珂，李 峣，汪 敏，趙麗艷*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春130041；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院 實(shí)驗(yàn)藥理與毒理學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春130021；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春130021)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤，約占所有原發(fā)性腦瘤的30%，占所有惡性腦腫瘤的80%[1]，近年來(lái)的發(fā)病率呈不斷升高趨勢(shì)。目前的治療方法包括外科切除、放療和化學(xué)療法的結(jié)合，但是患者術(shù)后極易復(fù)發(fā)，預(yù)后差。膠質(zhì)瘤患者發(fā)生靜脈血栓栓塞(VTE)的風(fēng)險(xiǎn)較高，尤其是高級(jí)別膠質(zhì)瘤(WHO Ⅲ-Ⅳ級(jí))患者，發(fā)生率高達(dá)17%-34%[2]。VTE的發(fā)生與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后不良和生存率惡化密切相關(guān)[3]。在血栓形成的過(guò)程中，組織因子(TF)作為外源性凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)因子，起著十分重要的作用。本研究利用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了膠質(zhì)瘤組織中TF的表達(dá)，探討TF與VTE發(fā)生率的相關(guān)性，對(duì)膠質(zhì)瘤患者合并VTE的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估有重要的參考價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

該研究獲得了吉林大學(xué)第二醫(yī)院和吉林大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。選擇2018年7月至2019年7月吉林大學(xué)第一醫(yī)院收治的30例膠質(zhì)瘤患者作為研究對(duì)象，男性15例，女性15例，年齡32-74歲，平均(51.83±11.39)歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)影像學(xué)、病理明確診斷為膠質(zhì)瘤；(2)初次發(fā)病、首次手術(shù)切除；(3)術(shù)前未接受放、化療及其他治療；(4)入組病例具有較完整的臨床及病理學(xué)信息。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他病患，如自身免疫病、血液系統(tǒng)病、血友病等；(2)應(yīng)用抗凝治療或抗血小板治療；(3)發(fā)生膠質(zhì)瘤前有血栓病史；(4)有其他惡性腫瘤病史。所有患者均行手術(shù)切除，病理診斷明確腫瘤分級(jí)，收取其經(jīng)手術(shù)切除的腫瘤腦組織標(biāo)本。按WHO分級(jí)Ⅰ-Ⅱ級(jí)低級(jí)別膠質(zhì)瘤組15例，Ⅲ-Ⅳ級(jí)高級(jí)別膠質(zhì)瘤組15例。其中Ⅰ級(jí)毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤2例，Ⅱ級(jí)少突星形細(xì)胞瘤5例，Ⅱ級(jí)少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤6例，Ⅱ級(jí)彌漫型星形細(xì)胞瘤1例，Ⅱ級(jí)多形性黃色星形細(xì)胞瘤1例，Ⅲ級(jí)間變型星形細(xì)胞瘤4例，Ⅳ級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤11例。并選擇同期膠質(zhì)瘤手術(shù)患者的癌旁正常腦組織標(biāo)本8例作為對(duì)照組，患者年齡30-68歲，平均(47.13±13.17)歲。

1.2 主要試劑和儀器

兔抗人TF一抗購(gòu)自中國(guó)Abclonal公司，QuickBlock封閉液購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司，通用型試劑盒(小鼠/兔聚合物法檢測(cè)系統(tǒng))、DAB顯色試劑盒、中性樹(shù)膠購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，蘇木素染液購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，ECLIPSE 80i正置顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法

按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。在顯微鏡下以400×放大倍數(shù)拍攝切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野。使用Image J軟件對(duì)TF蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析。半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]如下：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3 分；陽(yáng)性率0-5%為0分，5%-20%為1分，20%-45%為2分，>45%為3分。最終得分為染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例得分之積，0分為陰性(-)，1-3分為弱陽(yáng)性(+)，4-6分為陽(yáng)性(++)，7-9分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 臨床資料的分析

基線資料比較，高級(jí)別組和低級(jí)別組患者的年齡、性別和BMI無(wú)明顯差異(P>0.05)，具有可比性。術(shù)前，高級(jí)別組PC、MPV、PT高于低級(jí)別組，高級(jí)別組MPV/PC、APTT低于低級(jí)別組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高級(jí)別組FIB高于低級(jí)別組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后，高級(jí)別組MPV和MPV/PC比值高于術(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低級(jí)別組PC低于術(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低級(jí)別組MPV/PC比值和FIB高于術(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組膠質(zhì)瘤患者血液學(xué)標(biāo)志物的比較

2.2 TF在膠質(zhì)瘤腦組織中的表達(dá)及與腫瘤組織學(xué)分級(jí)的相關(guān)性

結(jié)果顯示，TF陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)。對(duì)照組TF陽(yáng)性率為3.24±1.21，以陰性為主，腦膠質(zhì)瘤組織中TF陽(yáng)性率為29.77±11.84，以陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性為主，兩組陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)；低級(jí)別組TF陽(yáng)性率為18.84±3.30，以陽(yáng)性為主，高級(jí)別組TF陽(yáng)性率為40.7±4.86，以強(qiáng)陽(yáng)性為主，兩組陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)，見(jiàn)圖1和表2。Spearman相關(guān)分析表明，TF表達(dá)與膠質(zhì)瘤組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)(rs=0.663，P<0.0001)。

注：(A)對(duì)照組；(B)低級(jí)別組；(C)高級(jí)別組

表2 不同WHO分級(jí)膠質(zhì)瘤患者腫瘤腦組織中的TF表達(dá)比較(例)

2.3 TF與VTE的發(fā)生相關(guān)

隨訪期間，有6例低級(jí)別、12例高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者術(shù)后發(fā)生了VTE，并且低級(jí)別和高級(jí)別組中發(fā)生VTE患者的TF表達(dá)水平明顯高于未發(fā)生VTE患者(P<0.01)，見(jiàn)表3。以是否發(fā)生VTE為因變量，Logistic回歸分析顯示，術(shù)前PC、MPV、PT、APTT和FIB與發(fā)生VTE不相關(guān)(P>0.05)；而TF陽(yáng)性率與發(fā)生VTE有相關(guān)性(95%CI:1.043-1.594，P=0.019)。見(jiàn)圖2。

表3 兩組膠質(zhì)瘤患者VTE的發(fā)生情況及對(duì)應(yīng)的TF陽(yáng)性率

圖2 各因素與VTE之間的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

腫瘤與凝血關(guān)系的研究一直被人們所關(guān)注。據(jù)報(bào)道，癌癥患者VTE的發(fā)病率是普通患者的4-5倍[5]，這被認(rèn)為是癌癥患者死亡的高風(fēng)險(xiǎn)因素。一項(xiàng)前瞻性觀察隊(duì)列研究數(shù)據(jù)顯示，對(duì)213例不同類(lèi)型的原發(fā)性腦腫瘤患者(其中89%的患者患有高級(jí)別膠質(zhì)瘤)隨訪2年期間，29例(13.6%)患者發(fā)生了VTE。VTE的6個(gè)月、12個(gè)月和24個(gè)月的風(fēng)險(xiǎn)分別為10.1%、13.3%和14.8%。血栓指數(shù)事件包括下肢深靜脈血栓15例，肺栓塞13例，上肢深靜脈血栓1例，其中有2例致死性肺栓塞[6]。VTE的發(fā)展與膠質(zhì)瘤患者2年內(nèi)死亡風(fēng)險(xiǎn)增加30%相關(guān)[7]。評(píng)估膠質(zhì)瘤患者合并VTE的風(fēng)險(xiǎn)，制定相應(yīng)的治療策略，對(duì)改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后情況并延緩其生存時(shí)間，具有重要的臨床意義。

血小板來(lái)源于骨髓造血組織中的巨核細(xì)胞產(chǎn)生，在止凝血中發(fā)揮著極為重要的作用。血小板參與靜脈血栓的發(fā)生和發(fā)展主要是通過(guò)血小板胞質(zhì)蛋白的釋放作用于其臨近的血細(xì)胞，促進(jìn)TF、凝血酶等，以及血小板自身表面受體與血液細(xì)胞的相互作用[8-9]。本研究中高級(jí)別組術(shù)前FIB值高于低級(jí)別組，F(xiàn)IB水平升高可以促進(jìn)血小板的聚集，有利于血栓的形成。高級(jí)別組與低級(jí)別組術(shù)后MPV/PC比值明顯高于術(shù)前，說(shuō)明外科手術(shù)后血栓風(fēng)險(xiǎn)增加。這是由于手術(shù)導(dǎo)致血管內(nèi)膜受損，大量TF分泌入血，在啟動(dòng)外源性凝血途徑的同時(shí)激活內(nèi)源性凝血途徑，使得凝血-抗凝系統(tǒng)失衡，加重腦膠質(zhì)瘤病人血液高凝狀態(tài)。有文獻(xiàn)報(bào)道，膠質(zhì)瘤患者術(shù)前可表現(xiàn)為血液高凝狀態(tài)，并與術(shù)后VTE的發(fā)生呈正相關(guān)[10]，血液學(xué)標(biāo)志物水平與膠質(zhì)瘤組織學(xué)分級(jí)有關(guān)[11]。在本研究中，高級(jí)別組與低級(jí)別組術(shù)前PC、MPV、PT和APTT的比較雖然存在差異，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是由于本研究納入的樣本量不足所導(dǎo)致。

腦腫瘤合并VTE的病理生理機(jī)制尚不完全清楚，有學(xué)者提出了腦腫瘤合并VTE的風(fēng)險(xiǎn)與腫瘤細(xì)胞過(guò)度表達(dá)TF有關(guān)[12]。TF是外源性凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)因子，通過(guò)與其配體FVII結(jié)合，形成TF-FVIIa復(fù)合物，激活FX，啟動(dòng)外源凝血途徑，繼而經(jīng)過(guò)共同途徑生成凝血酶，導(dǎo)致血小板活化和聚集，纖維蛋白生成，最終達(dá)到止血的目的[13]。同時(shí)，TF與FVIII和FIX激活的內(nèi)源性凝血途徑有關(guān)，有助于血栓的形成和擴(kuò)大[14]。TF及其下游效應(yīng)物的上調(diào)不僅導(dǎo)致凝血系統(tǒng)的激活，而且還參與調(diào)控對(duì)癌癥進(jìn)展至關(guān)重要的致癌信號(hào)機(jī)制[15]。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)膠質(zhì)瘤患者腦組織標(biāo)本中TF蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)TF在腦膠質(zhì)瘤組織中特異高表達(dá)，并與腫瘤組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)，同時(shí)過(guò)表達(dá)TF的高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者其VTE發(fā)生率也明顯升高。膠質(zhì)瘤中TF表達(dá)增強(qiáng)的原因包括：①EGFR過(guò)表達(dá)，持續(xù)活化的EGFRvIII突變形式和HER2可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞TF基因的表達(dá)[16]；②PTEN丟失和VEGF過(guò)表達(dá)能夠上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的TF表達(dá)，而這兩個(gè)分子事件也是從低級(jí)別膠質(zhì)瘤向惡性膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)變的特征[17]；③缺氧[18]，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，缺氧條件下TF蛋白和mRNA表達(dá)急劇增加，這可能與血管生成素-2介導(dǎo)的血管損傷有關(guān)。

通過(guò)對(duì)患者的電話隨訪，發(fā)現(xiàn)高級(jí)別膠質(zhì)瘤病人機(jī)體比低級(jí)別膠質(zhì)瘤病人機(jī)體更易處于血液高凝狀態(tài)和發(fā)生血栓，在15例高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者中有12例發(fā)生了VTE。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)TF的表達(dá)與VTE的發(fā)生之間有關(guān)聯(lián)，TF表達(dá)每增加1倍，發(fā)生VTE的風(fēng)險(xiǎn)增加1.289倍。TF在膠質(zhì)瘤中的過(guò)表達(dá)及其與血栓形成的相關(guān)性，提示了TF在膠質(zhì)瘤合并VTE的過(guò)程中扮演重要角色，并有可能成為預(yù)測(cè)和評(píng)估膠質(zhì)瘤患者合并VTE風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物。一項(xiàng)研究表明，IDH1突變膠質(zhì)瘤中編碼TF的F3基因呈高度甲基化和下調(diào)，而與IDH1野生型膠質(zhì)瘤患者相比，IDH1突變膠質(zhì)瘤患者的血栓形成顯著減少[19]。同時(shí)，IDH1突變膠質(zhì)瘤的侵襲性也比IDH1野生型膠質(zhì)瘤小得多，阻斷TF信號(hào)能夠抑制IDH1野生型膠質(zhì)瘤的增殖和侵襲，降低其發(fā)生VTE的概率[20]。此外，研究[21]發(fā)現(xiàn)TF能控制腫瘤休眠狀態(tài)，并與炎癥細(xì)胞和血管的募集共同起作用。TF的抑制使U373膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)入休眠狀態(tài)長(zhǎng)達(dá)一整年，而在TF表達(dá)后迅速恢復(fù)生長(zhǎng)。本研究證實(shí)了TF在膠質(zhì)瘤組織中的高表達(dá)及其與腫瘤組織學(xué)分級(jí)的相關(guān)性，探討了在膠質(zhì)瘤合并VTE中TF的重要貢獻(xiàn)。鑒于TF在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和膠質(zhì)瘤發(fā)展中的作用，其作為評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤患者合并VTE風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物以及成為治療膠質(zhì)瘤靶點(diǎn)的潛能，有待更深入的研究。