劉函西，呂浩，郭廣雨，劉冬旭，石巖，孫志君，張澤鑫，張艷嬌，文瑩楠，王潔琦，劉春燕，陳慶山，辛大偉，王錦輝

大豆根瘤菌HH103突變對結(jié)瘤能力的影響

劉函西1，呂浩1，郭廣雨2，劉冬旭1，石巖1，孫志君1，張澤鑫1，張艷嬌1，文瑩楠1，王潔琦1，劉春燕1，陳慶山1，辛大偉1，王錦輝1

1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2哈爾濱農(nóng)業(yè)科學(xué)院，哈爾濱 150028

大豆是重要的經(jīng)濟(jì)作物，能夠為人類提供大量的植物蛋白和油脂。大豆在生長過程中，能夠與根瘤菌形成共生體系進(jìn)行共生固氮，該形式的共生固氮能夠?qū)⒖諝庵械牡獨(dú)膺€原成氨，為大豆生長發(fā)育提供豐富氮源。根瘤菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)是根瘤菌中重要的蛋白分泌結(jié)構(gòu)，能夠通過分泌Ⅲ型效應(yīng)因子在共生體系建立過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。根瘤菌編碼一種ATP轉(zhuǎn)移酶，是根瘤菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的重要組成部分，能夠保障根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子向宿主細(xì)胞的正常分泌。【】探索突變情況下對根瘤菌結(jié)瘤能力的影響，提高大豆-根瘤菌共生體系的固氮效率，為大豆農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供必要的參考和支持。通過三親雜交和同源重組，在起始密碼子ATG下游插入了一個抗性基因，利用PCR擴(kuò)增和Southern blot對插入情況進(jìn)行驗證，從而構(gòu)建插入突變體HH103ΩrhcN。利用大豆染料木苷（Genistin）對野生型根瘤菌HH103及HH103ΩrhcN突變體進(jìn)行誘導(dǎo)，并對處理組合對照組進(jìn)行胞外蛋白純化，通過Western blot檢測突變對根瘤菌III型效應(yīng)因子NopC及NopT分泌的影響。利用雙層缽植物培養(yǎng)系統(tǒng)對大豆Williams82進(jìn)行野生型根瘤菌HH103和HH103ΩrhcN突變體接種，分析突變對根瘤表型的影響。利用前期收集的100份基因型差異的大豆品種進(jìn)行結(jié)瘤能力鑒定，分析根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子分泌異常情況下在不同基因型大豆品種中的結(jié)瘤表現(xiàn)。通過PCR擴(kuò)增和Southern blot驗證了成功構(gòu)建的HH103ΩrhcN突變體，胞外蛋白鑒定表明突變能夠抑制根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子NopC和NopT分泌。利用HH103ΩrhcN突變體和野生型HH103在Williams82進(jìn)行結(jié)瘤鑒定，結(jié)果表明，突變能夠顯著抑制根瘤數(shù)和根瘤干重。對100份基因型差異的大豆品種進(jìn)行結(jié)瘤鑒定，結(jié)果表明，突變能夠引起其中80份大豆資源根瘤數(shù)目降低，13份根瘤數(shù)目顯著升高，7份不發(fā)生顯著性變化。突變能夠引起根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子的異常分泌，進(jìn)而能夠影響共生體系的建立。根瘤菌III型效應(yīng)因子在大豆-根瘤菌共生體系形成過程中發(fā)揮著重要作用，并且不同基因型大豆遺傳背景對根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子具有不同應(yīng)對反應(yīng)。

大豆；根瘤菌；III型效應(yīng)因子；；共生

0 引言

【研究意義】大豆是世界范圍種植廣泛的重要經(jīng)濟(jì)作物，能夠為人類提供豐富的油脂和植物蛋白[1]。隨著中國人民生活質(zhì)量的提高，中國對大豆的需求逐年上升，已成為世界最大的大豆進(jìn)口國。隨著化肥施用量的增加，大豆生產(chǎn)對化肥的依賴越來越大[2-3]，導(dǎo)致土壤板結(jié)加劇、水體富營養(yǎng)化和重金屬富集等環(huán)境問題[4-5]。作為高需氮作物，大豆在長期的進(jìn)化過程中通過與根瘤菌相互作用，在根部發(fā)育并形成根瘤。根瘤能夠?qū)⒖諝庵械牡獨(dú)飧咝мD(zhuǎn)化成化合態(tài)氮，使大豆適應(yīng)低氮環(huán)境，維持大豆正常的生長發(fā)育[6-7]。所以充分發(fā)揮大豆根瘤菌共生固氮作用，是減少化肥施用、保障糧食安全、減輕能源壓力、減少環(huán)境污染和提高土壤肥力、保障農(nóng)業(yè)、環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的有效措施[8-9]，因此，對大豆-根瘤菌共生體系建立機(jī)制及固氮機(jī)制的研究具有十分重要的現(xiàn)實意義。【前人研究進(jìn)展】前人研究發(fā)現(xiàn)，大豆-根瘤菌共生體系形成過程中涉及復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)交換，根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子是由Ⅲ型分泌系統(tǒng)向宿主細(xì)胞中分泌的一系列蛋白質(zhì)，在根瘤菌侵染和根瘤形成過程中能夠發(fā)揮重要調(diào)控作用[10]。根瘤菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)（type Ⅲsecretion system，T3SS）是一種類注射器的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，是由多種蛋白組成[11]，其中NopA和NopB是Ⅲ型效應(yīng)分泌系統(tǒng)中針頭的組成部分，NopX是分泌系統(tǒng)的基本構(gòu)成[12-15]，RhcN和RhcJ也是Ⅲ型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的組成部分之一，是最基本的結(jié)構(gòu)蛋白，它們的缺失會直接造成整個Ⅲ型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的破壞，影響Ⅲ型效應(yīng)因子的正常分泌[16-18]。近年來，對Ⅲ型效應(yīng)因子研究進(jìn)展表明，NopC是根瘤菌特異的效應(yīng)蛋白，NopC位于NopA的上游，由于NopA是T3SS菌毛的結(jié)構(gòu)組成成分，所以NopC也應(yīng)該是T3SS的組成成分[19]。NopC突變后并不影響其他效應(yīng)因子的分泌，腺苷酸環(huán)化酶測定顯示NopC能促進(jìn)宿主植物結(jié)瘤[19]。對于NopP的研究，在根瘤菌HH103中，的表達(dá)依賴于黃酮類化合物和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子TtsI，并影響大豆根和芽中致病相關(guān)基因的表達(dá)[20]。在根瘤菌NGR234中，Ⅲ型效應(yīng)因子突變后能改變其在非洲山毛豆和扁豆上的結(jié)瘤數(shù)量[21]。所以根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子作用機(jī)制及大豆響應(yīng)Ⅲ型效應(yīng)因子機(jī)理的研究對闡明大豆-根瘤菌共生體系形成機(jī)制具有重要作用。【本研究切入點(diǎn)】RhcN是Ⅲ型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的組成部分，能夠為根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子的分泌提供能量，保證Ⅲ型效應(yīng)因子的正常分泌[16-18]。不同大豆品種具有不同的遺傳背景，造成其與根瘤菌的共生固氮具有一定的差異，但根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子在該種差異中能發(fā)揮的作用并未得到深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對中華根瘤菌HH103的T3SS結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行基因突變，得到突變體HH103ΩrhcN，并用PCR和Southern blot鑒定。通過表達(dá)分析，確定能夠影響Ⅲ型效應(yīng)因子的分泌。對HH103ΩrhcN突變體以及野生型菌株HH103進(jìn)行100份核心種質(zhì)結(jié)瘤試驗，通過對兩者結(jié)瘤結(jié)果的比對，進(jìn)一步明確Ⅲ型效應(yīng)因子結(jié)構(gòu)基因突變后對共生結(jié)瘤的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

費(fèi)氏中華根瘤菌HH103（源于西班牙塞維利亞大學(xué)Francisco Javier López-Baena實驗室），利福平（Rif）抗性；大腸桿菌DH5α。

Williams82和大豆核心種質(zhì)100份（源于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)陳慶山實驗室保存）。

質(zhì)粒提取試劑盒（TaKaRa公司，DC201-01），缺氮植物營養(yǎng)液（1 L包含MgSO40.5 mol·L-1、Na2MoO40.2 mmol·L-1、MnSO42 mmol·L-1、H3BO34 mmol·L-1、CaCl22 mol·L-1、CoSO40.2 mmol·L-1、K2SO40.5 mol·L-1、CuSO44 mmol·L-1、KH2PO41 mol·L-1、ZnSO41 mmol·L-1和C6H5FeO720 mmol·L-1）。

1.2 突變體的構(gòu)建

1.2.1 重組自殺載體pJQ200SK-rhcN-Km的構(gòu)建 從NCBI生物信息數(shù)據(jù)庫中，獲取HH103基因組中的序列，提取全基因組序列，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，片段的引物命名為rhcN-F和rhcN-R。將擴(kuò)增片段連接pGWC載體，連接體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。測序獲得pGWC-rhcN。選取的酶切位點(diǎn)Ⅰ（5'-ACTAGT-3'），突變位置的上下游各15 bp堿基序列作為上游引物，該引物反向互補(bǔ)序列作為對應(yīng)的下游引物，以pGWC-rhcN為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用Ⅰ消化后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，測序獲得突變結(jié)果pGWC-rhcN-DpnⅠ?？剐云蜳CR擴(kuò)增以pEASY-Blunt為模板，在擴(kuò)增引物兩端加上Ⅰ酶切位點(diǎn)序列，引物命名為Km-KpnⅠ-F、Km-KpnⅠ-R。將抗性片段插入，連接體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，測序后得到pGWC-rhcN-Km。選取酶切位點(diǎn)Ⅰ和Ⅰ，用引物SacI-rhcN-XbaⅠ-F（R）擴(kuò)增pGWC-rhcN-Km，將擴(kuò)增片段和重組自殺載體分別進(jìn)行雙酶切，將酶切后的片段和重組自殺載體進(jìn)行連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化DH5α后測序，命名為pJQ200SK-rhcN-Km。

1.2.2 三親雜交 將根瘤菌HH103劃線于含Rif的TY固體培養(yǎng)基。將帶有Helper質(zhì)粒的大腸桿菌劃線于含Km的LB固體培養(yǎng)基，將帶有pJQ200SK-rhcN- Km的大腸桿菌劃線于含有Km、Gent的LB固體培養(yǎng)基。過夜培養(yǎng)直至長出單克隆；將3種菌挑單克隆分別于5 mL相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600值為0.6；取3種菌，每個各取1 mL，分別放于1.5 mL離心管中，離心12 000 r/min離心30 s，棄上清，用1 mL無抗TY重懸；取重懸后的HH103菌液200 μL，其余2種菌各100 μL加入到1.5 mL離心管中，離心12 000 r/min離心30 s，棄上清，用20 μL無抗TY重懸；將20 μL的混合菌液滴到無抗TY固體培養(yǎng)基平板上過夜培養(yǎng)；過夜培養(yǎng)后，刮取大斑劃線到含Rif/Km的TY固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，直至長出單克??；將單克隆繼續(xù)劃線到含Rif/Km的TY固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，重復(fù)3次；將經(jīng)過3次篩選的單克隆劃線于含有5%蔗糖的Rif/Km的TY固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，重復(fù)3次；篩選到的突變體命名為HH103ΩrhcN。

1.3 突變體的驗證

1.3.1 突變體的PCR鑒定 利用引物rhcN-F（R）以及rhcN-F和-R 2對引物分別擴(kuò)增野生型根瘤菌HH103及突變菌株HH103ΩrhcN，通過電泳的方法，觀察到目的條帶，測序驗證突變體HH103ΩrhcN。

1.3.2 突變體的Southern blot鑒定 提取野生型HH103和突變體HH103ΩrhcN的基因組；標(biāo)記探針，設(shè)計探針引物，擴(kuò)增突變體基因組，膠回收片段，沸水浴10 min，迅速插入冰中。DIG-High Prime（vial1）與變性的DNA混勻，37℃過夜，65℃水浴終止反應(yīng)，-20℃保存；消化好的樣品瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳；堿變性處理、轉(zhuǎn)膜、預(yù)雜交、雜交、洗膜、顯影[22]，將雜交膜DNA面朝上放在顯影夾上，加1 mL CSPD，室溫靜止避光溫浴5 min。37℃避光10 min，獲取Southern blot結(jié)果驗證照片。

1.4 Western blot驗證Ⅲ效應(yīng)因子NopC及NopT的分泌

對野生型根瘤菌HH103和突變體HH103ΩrhcN在含有相應(yīng)抗生素培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每種菌培養(yǎng)2組，待OD600=0.8時，一組加入染料木苷，而另一組作為空白對照，28℃，200 r/min培養(yǎng)40 h；4℃，菌液8 000 r/min離心20 min，收集上清液。在上清液中，加入3倍體積的10%三氯乙酸，-20℃靜置20 h；將溶液10 000 r/min離心30 min，用事先預(yù)冷的80%丙酮對沉淀進(jìn)行清洗，重復(fù)2次，最后將沉淀用適量8 mol·L-1尿素進(jìn)行稀釋；最后利用NopC和NopT的兔源抗體進(jìn)行Western blot檢測[23]。

1.5 突變體結(jié)瘤能力鑒定及大豆核心種質(zhì)根瘤表型分析

取Williams82的種子30粒，用氯氣滅菌法對大豆種子表面進(jìn)行滅菌，滅菌時長為12 h。在無菌操作臺內(nèi)吹去種子表面氯氣，將種子種入高溫滅菌的雙層缽中，并在溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光16 h/暗/8 h，溫度為25℃[24]。待大豆生長到Vc[25]期時，用注射器在大豆根部土層下直接接種2 mL OD600值為0.2的費(fèi)氏中華根瘤菌HH103菌液和突變體HH103ΩrhcN菌液，保證每個植株接種細(xì)菌的個數(shù)在109左右，接種30 d后對結(jié)瘤數(shù)目及根瘤干重等性狀進(jìn)行調(diào)查，并利用SPSS軟件對不同處理數(shù)據(jù)進(jìn)行-test檢驗，進(jìn)行顯著性分析。

取試驗所需100份種質(zhì)資源的種子各10粒，接種30 d后對結(jié)瘤數(shù)目及根瘤干重等性狀進(jìn)行調(diào)查，并利用SPSS軟件對不同處理數(shù)據(jù)進(jìn)行-test檢驗，進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 突變體HH103ΩrhcN的PCR鑒定

三親雜交得到的突變體HH103ΩrhcN及野生型菌株HH103，利用引物rhcN-F（R）以及rhcN-F和Km-R擴(kuò)增HH103ΩrhcN，進(jìn)行PCR鑒定（圖1）。野生型HH103利用引物rhcN-F和rhcN-R擴(kuò)增的條帶大小應(yīng)為長度，為1 300 bp，突變型菌株HH103ΩrhcN擴(kuò)增的條帶大小應(yīng)為和長度，為2 300 bp。野生型HH103利用引物rhcN-F和Km-SpeI-R擴(kuò)增，由于其不含插入的片段結(jié)果應(yīng)無條帶，突變型菌株HH103ΩrhcN擴(kuò)增的條帶大小應(yīng)為上臂和的長度，為1 500 bp（圖1）。由結(jié)果篩選出正確突變體HH103ΩrhcN，擴(kuò)增結(jié)果與理論相符。

M: Trans 2K Plus DNA marker; 1: HH103ΩrhcN（rhcN-F，rhcN-R）; 2: HH103（rhcN-F，rhcN-R）; 3: HH103ΩrhcN（rhcN-F，Km-SpeⅠ-R）; 4: HH103（rhcN-F，Km-SpeⅠ-R）

2.2 突變體HH103ΩrhcN的Southern blot鑒定

進(jìn)一步驗證突變體HH103ΩrhcN的真實性，采用地高辛標(biāo)記和檢測試劑盒進(jìn)行突變體Southern blot鑒定。對野生型根瘤菌HH103和HH103ΩrhcN的基因組用2種內(nèi)切酶酶切。選用內(nèi)切酶時避免選用目的基因和內(nèi)部的內(nèi)切酶，以免將突變片段切碎影響驗證結(jié)果。從雜交結(jié)果可以看出每種酶切后突變體的雜交片段比野生型的雜交片段約長1 000 bp（圖2），即插入卡那霉素片段的大小，進(jìn)一步證明突變體HH103ΩrhcN篩選成功。

1：HH103ΩrhcN突變體基因組HindⅢ酶切結(jié)果；2：HH103基因HindⅢ酶切結(jié)果；3：HH103ΩrhcN突變體基因組SacⅠ酶切結(jié)果；4：HH103基因組SacⅠ酶切結(jié)果

2.3 rhcN突變抑制Ⅲ型效應(yīng)因子的分泌

通過對野生型根瘤菌HH103和突變體中Ⅲ型效應(yīng)因子NopC和NopT的分泌進(jìn)行Western blot驗證。結(jié)果表明，突變后能夠抑制Ⅲ型效應(yīng)因子NopC和NopT的分泌（圖3）。

+：存在Genistein的誘導(dǎo)；-：不存在Genistein的誘導(dǎo)

2.4 rhcN突變能夠抑制根瘤的形成

利用Williams82對野生型根瘤菌HH103和根瘤菌HH103ΩrhcN突變體進(jìn)行結(jié)瘤鑒定，大豆植株Vc期時進(jìn)行根瘤菌接種，接種30 d后對根瘤表型進(jìn)行統(tǒng)計和分析（圖4和圖5）。與接種野生型HH103相比，突變能夠引起根瘤數(shù)目的顯著較少，也能夠引起根瘤干重的顯著降低。大豆根系中一定數(shù)目的根瘤對于大豆的氮源供給是非常必要的，突變能夠引起根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子的分泌受到抑制，造成根瘤菌侵染和根瘤發(fā)育受到影響，說明根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子對于大豆-根瘤菌共生體系的正常建立是必要的。

2.5 HH103ΩrhcN突變體結(jié)瘤表型鑒定

利用來自不同積溫帶的全國大豆種質(zhì)核心資源的100份品種對野生型根瘤菌HH103、突變型根瘤菌HH103ΩrhcN進(jìn)行結(jié)瘤鑒定，重復(fù)10次，對接種后30 d的植株對結(jié)瘤數(shù)目及根瘤干重等性狀進(jìn)行調(diào)查，對表型數(shù)據(jù)的最大值、最小值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)結(jié)瘤情況進(jìn)行分析（表1和電子附表1），結(jié)果表明，突變能夠引起80份大豆資源根瘤數(shù)目減少，13份根瘤數(shù)目顯著升高，7份不發(fā)生顯著性變化。說明在大豆-根瘤菌共生體系形成過程中發(fā)揮著重要作用，并且不同的大豆遺傳背景具有不同應(yīng)對反應(yīng)。

左圖為接種HH103時大豆根系和根瘤形態(tài)，右圖為接種HH103ΩrhcN時大豆根系和根瘤形態(tài)

*表示在p＜0.05水平差異顯著 *for the difference was significant at P＜0.05 level

*表示在＜0.05水平差異顯著；**表示在＜0.01水平差異極顯著

*: The difference was significant at the＜0.05 level; **: the difference was extremely significant at the＜0.01 level

3 討論

根瘤菌能夠編碼RhcN蛋白，是一種ATP轉(zhuǎn)移酶，是根瘤菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)重要的結(jié)構(gòu)蛋白，在效應(yīng)因子的分泌過程中，能夠為效應(yīng)因子提供必不可少的能量，保障效應(yīng)因子由根瘤菌分泌到宿主細(xì)胞中[18]。在其他根瘤菌菌種中，關(guān)于RhcN突變的研究較多，根瘤菌NGR234 RhcN突變能夠顯著抑制豇豆根瘤的產(chǎn)生[21]，根瘤菌DOA9 RhcN突變能夠引起美洲合萌根瘤的顯著減少[26]，與本研究根瘤菌HH103 RhcN突變之后對大豆根瘤表型產(chǎn)生影響相似，表明根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子在大豆-根瘤菌共生體系建立過程中發(fā)揮重要作用。在根瘤菌HH103中，現(xiàn)已報道的Ⅲ型效應(yīng)因子有10種，分別為NopA、NopB、NopAA（GunA）、NopC、NopD、NopL、NopM、NopP、NopT和NopZ[27]，但是HH103不同的效應(yīng)因子發(fā)揮著不同的調(diào)控作用。NopAA（GunA）屬于一種糖基水解酶，已被證實能夠分解細(xì)胞壁調(diào)控根瘤菌的侵染，其突變情況下抑制根瘤的產(chǎn)生[28]。NopC被證實能夠分泌到大豆宿主細(xì)胞中，并且在根瘤發(fā)育階段也能發(fā)揮調(diào)控作用，在根瘤菌侵染過程中，NopC能夠誘導(dǎo)大豆病程相關(guān)基因的表達(dá)，并且NopC突變情況下同樣抑制根瘤的形成[19]。根瘤菌HH103Ⅲ型效應(yīng)因子的作用機(jī)制并未得到解析，對根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子在共生結(jié)瘤中的研究，特別是大豆響應(yīng)根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子基因的功能解析能夠為研究共生結(jié)瘤機(jī)制提供重要的理論支持。利用根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子及大豆響應(yīng)Ⅲ型效應(yīng)因子信號網(wǎng)絡(luò)對根瘤菌和大豆的相關(guān)改造，能夠為大豆-根瘤菌共生體系高效結(jié)瘤和固氮的研究提供一種新的思路和可能。

本研究收集了來自不同地區(qū)的100份大豆種質(zhì)資源，其分別來自東北、黃淮海和華南三大大豆種植區(qū)，品種之間具有明顯的基因型和生態(tài)型差異。利用野生型根瘤菌HH103和根瘤菌HH103ΩrhcN突變體對該100份大豆種質(zhì)資源進(jìn)行根瘤表型鑒定，結(jié)果表明，突變能夠引起其中80份大豆資源根瘤數(shù)目降低，13份根瘤數(shù)目顯著升高，7份不發(fā)生顯著性變化，此表型鑒定結(jié)果說明RhcN突變情況下能夠引起大部分的大豆種質(zhì)根瘤表型顯著降低。而100份種質(zhì)材料中，13份根瘤數(shù)目顯著升高，7份不發(fā)生顯著性變化，表明20份大豆品種的基因型造成了該表型的差異。根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子已經(jīng)被證實能夠影響根瘤菌與大豆宿主之間的親和性，并且利用大豆與根瘤菌相互作用的基因型特異性及共生親和性能夠進(jìn)行根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子相關(guān)信號通路研究及實際生產(chǎn)應(yīng)用[29]。自1966年開始，利用不同大豆材料的基因型差異，越來越多與共生結(jié)瘤相關(guān)的大豆基因被定位和應(yīng)用。例如（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）和（）[30]。其中，（）和（）是被研究較多的建立共生密切相關(guān)的基因[31-32]。與根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子NopP具有互作關(guān)系，并且能夠調(diào)控宿主大豆對根瘤菌的特異性識別[33]。能夠調(diào)控大豆對根瘤菌的親和敏感性，可響應(yīng)根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子影響大豆-根瘤菌共生體系的建立[34]。作者所在實驗室在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，HH103和NopL突變體能夠在栽培品種東農(nóng)594和Charleston引起明顯的根瘤表型差異，通過構(gòu)建以東農(nóng)594和Charleston為父母本的RIL群體，對大豆響應(yīng)進(jìn)行QTL定位和挖掘，鑒定出了大豆能夠響應(yīng)的基因和[35]，說明利用大豆基因型差異對Ⅲ型效應(yīng)因子的研究是可行的。利用本研究篩選的大豆種質(zhì)材料進(jìn)行大豆遺傳群體的構(gòu)建可以對大豆共生相關(guān)基因，尤其是響應(yīng)Ⅲ型效應(yīng)因子的大豆基因進(jìn)行挖掘，通過進(jìn)一步的功能解析為探究Ⅲ型效應(yīng)因子作用機(jī)制提供重要支撐，同時利用基因型差異的大豆種質(zhì)材料可以進(jìn)行遺傳改良，進(jìn)一步培育高結(jié)瘤和高固氮大豆新品種。

4 結(jié)論

在共生結(jié)瘤過程中，不同基因型大豆在響應(yīng)根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子過程中具有不同的表現(xiàn)。根瘤菌Ⅲ型效應(yīng)因子在根瘤菌侵染、根瘤發(fā)育、固氮過程及根瘤衰老等過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

[1] 沈瓊, 劉小和. 我國油料、植物油的進(jìn)口特征及品種間的替代性分析. 中國農(nóng)村經(jīng)濟(jì), 2006(5): 25-31.

SHEN Q, LIU X H. Analysis on the import characteristics of my country's oilseeds and vegetable oils and the substitution among varieties. China's Rural Economy, 2006(5): 25-31. (in Chinese)

[2] 魏培梅. 國際大豆供求背景下中國大豆出口貿(mào)易現(xiàn)狀及對策. 對外經(jīng)貿(mào)實務(wù), 2019(9): 45-49.

WEI P M. China's soybean export trade status and countermeasures under the background of international soybean supply and demand. Foreign Economic and Trade Practices, 2019(9): 45-49. (in Chinese)

[3] 馬利平. 生物有機(jī)肥替代化肥減施對大豆土壤微生物多樣性的影響[D]. 哈爾濱: 黑龍江大學(xué), 2019.

MA L P. Effects of reduced application of bio-organic fertilizer instead of chemical fertilizer on soybean soil microbial diversity[D]. Harbin: Heilongjiang University, 2019. (in Chinese)

[4] Foley J A, Ramankutty N, Brauman K A, Cassidy E S, Gerber J S, Johnston M, MUELLER N D, CONNELL C O, RAY D K, WEST P C, BALZER C, BENNETT E M, CARPENTER S R, HILL J, MONFREDA C, POLASKY S, Rockstr?m J, SHEEHAN J, SIEBERT S, TILMAN D, ZAKS D P. Solutions for a cultivated planet. Nature, 2011, 478(7369): 337-342.

[5] Rockstrom J, Steffen W, Noone K, PERSSON A, CHAPIN F S, LAMBIN E F, LENTON T M, SCHEFFER M, FOLKE C, SCHELLNHUBER H J, NYKVIST B, DE WIT C A, HUGHES T, DER LEEUW S V, RODHE H, SORLIN S, SNYDER P K, COSTANZA R, SVEDIN U, FALKENMARK M, KARLBERG L, CORELL R W, FABRY V J, HANSEN J, WALKER B, LIVERMAN D, RICHARDSON K, CRUTZEN P, FOLEY J A. A safe operating space for humanity. Nature, 2009, 461(7263): 472-475.

[6] Contador Carolina A, Lo Siu-Kit, Chan Siu H J, Lam H M. Metabolic analyses of nitrogen fixation in the soybean microsymbiontusing constraint-based modeling. Msystems, 2020, 5(1): e00516-e00519.

[7] Willems A, Collins M D. Phylogenetic analysis ofandbased ongene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology, 1993, 43(2): 305-313.

[8] Peoples M B, Herridge D F, Ladha J K. Biological nitrogen fixation: An efficient source of nitrogen for sustainable agricultural production. Plant and Soil, 1995, 174(1/2): 3-28.

[9] Kiers E T, Hutton M G, Denison R F. Human selection and the relaxation of legume defenses against ineffective rhizobia. Proceedings of the Royal Society B, 2007, 274(1629): 3119-3126.

[10] Hu Y, Huang H, Cheng X, SHU X, WHITE A P, STAVRINIDES J, KOSTER W, ZHU G, ZHAO Z, WANG Y. A global survey of bacterial type III secretion systems and their effectors. Environmental Microbiology, 2017, 19(10): 3879-3895.

[11] Habenstein B, EI MAMMERI N, TOLCHARD J, LAMON G, TAWANI A, BERBON M, LOQUET A. Structures of type III secretion system needle filaments. Current topics in microbiology and immunology, 2020(427): 109-131.

[12] Martin K, Allan D J. Identification of protein secretion systems and novel secreted proteins in.. Bmc Genomics, 2008, 9(1): 55.

[13] Kim W S, Krishnan H B. A nopA deletion mutant ofUSDA257, a soybean symbiont, is impaired in nodulation. Current microbiology, 2014, 68(2): 239-246.

[14] Lorio J C, Kim W S, Krishnan H B. NopB, a soybean cultivar-specificity protein fromUSDA257, is a type III secreted protein. Molecular plant-microbe interactions, 2004, 17(11): 1259-1268.

[15] Marie C, Deakin W J, Viprey V, KOPCINSKA J, GOLINOWSKI W, KRISHNAN H B, PERRET X, BROUGHTON W J. Characterization of Nops, nodulation outer proteins, secreted via the type III secretion system of NGR234. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2003, 16(9): 743-751.

[16] Tampakaki A P. Commonalities and differences of T3SSs in rhizobia and plant pathogenic bacteria. Frontier in Plant Science, 2014, 5: 114.

[17] Krishnan H B, Lorio J, Kim W S, JIANG G, KIM K Y, DEBOER M, PUEPPKE S G. Extracellular proteins involved in soybean cultivar-specific nodulation are associated with pilus-like surface appendages and exported by a type III protein secretion system inUSDA257. Molecular plant-microbe interactions, 2003, 16(7): 617-625.

[18] Viprey V, Del Greco A, Golinowski W, BROUGHTON W J, PERRET X. Symbiotic implications of type III protein secretion machinery in Rhizobium. Molecular microbiology, 1998, 28(6): 1381-1389.

[19] Jiménez-Guerrero I, Pérez-Montao F, Carlos M, Javier O F, López-Baena F J, Peter M. NopC is a rhizobium- specific type 3 secretion system effector secreted by()HH103. PLoS ONE, 2015, 10(11): e0142866.

[20] Lopezbaena F J, Monreal J A, Perezmontano F, GUASCHVIDAL B, BELLOGIN R A, VINARDELL J M, OLLERO F J. The absence of Nops secretion inHH103 increasesexpression in williams soybean. Molecular Plant-microbe Interactions, 2009, 22(11): 1445-1454.

[21] Skorpil P, Saad M M, Boukli N M, KOBAYASHI H, ARES ORPEL F, BROUGHTON W J, DEAKIN W J. NopP, a phosphory-lated effector of. strain NGR234, is a major determinant of nodulation of the tropical legumesand. Molecular Microbiology, 2005; 57: 1304-1317.

[22] 朱華晨, 許新萍, 李寶健. 一種簡捷的Southern印跡雜交方法. 中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2004(4): 128-130.

ZHU H C, XU X P, LI B J. A simple southern blot hybridization method. Journal of Sun Yat-sen University (Natural Science Edition), 2004(4): 128-130. (in Chinese)

[23] 龍火生, 楊公社, 龐衛(wèi)軍. 一種改進(jìn)的Western雜交方法. 畜牧獸醫(yī)雜志, 2003(3): 11-13.

LONG H S, YANG G S, PANG W J. An improved western hybridization method. Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2003(3): 11-13. (in Chinese)

[24] 李志輝, 傅豪, 靳巧玲, 段紅光, 戴晉, 吳鶴敏. 大豆日光溫室加代應(yīng)用研究初報. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 21(2): 88-91.

LI Z H, FU H, JIN Q L, DUAN H G, DAI J, WU H M. Preliminary report on the application of soybean solar greenhouse. Hebei Agricultural Sciences, 2017, 21(2): 88-91. (in Chinese)

[25] 于妍, 劉芳, 唐敬仙. 大豆生育期類型劃分研究進(jìn)展. 北京農(nóng)業(yè), 2015(8): 27.

YU Y, LIU F, TANG J X. Research progress on classification of soybean growth period. Beijing Agriculture, 2015(8): 27. (in Chinese)

[26] Kimbrel J A, Thomas W J, Jiang Y, CREASON A L, THIREAULT C A, SACHS J L, CHANG J H. Mutualistic co-evolution of type iii effector genes inand. PLoS Pathogens, 2013, 9(2): e1003204.

[27] López-Baena F, Ruiz-Sainz J, Rodríguez-Carvajal M, Vinardell J. Bacterial molecular signals in the-soybean symbiosis. International Journal of Molecular Sciences, 2016, 17(5): 755.

[28] JIMéNEZ-GUERRERO i, perez-montano, zdyb a, beutler m, werner g, gottfert m, javier ollero f, maria yinardell j, lopez-baena f j. GunA of()HH103 is a T3SS-secreted cellulase that differentially affects symbiosis with cowpea and soybean. Plant and Soil, 2019, 435(1/2): 15-26.

[29] Triplett E W, Sadowsky M J. Genetics of competition for nodulation of legumes. Annual Review of Microbiology, 1992, 46: 399-428.

[30] Hwang S, Ray J D, Cregan P B, ANDY KING C, DAVIES M K, PURCELL L C. Genetics and mapping of quantitative traits for nodule number, weight, and size in soybean (L. [Merr.]). Euphytica, 2014, 195(3): 419-434.

[31] YANG S, TANG F, GAO M, KRISHNAN H B, ZHU H.gene-controlled host specificity in the legume–rhizobia symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2010, 107(43): 18735-18740.

[32] Tang F, Yang S, Liu J, Zhu H., a gene controlling nodulation specificity in soybeans, encodes a thaumatin-like protein but not the one previously reported. Plant physiology, 2016, 170(1): 26-32.

[33] Sugawara M, Takahashi S, Umehara Y, LWANO H, TSURUMARU H, ODAKE H, SUZUKI Y, KONDO H, KONNO Y, YAMAKAWA T, SATO S, MITSUI H, MINAMISAWA K. Variation in bradyrhizobial NopP effector determines symbiotic incompatibility with-soybeans via effector-triggered immunity. Nature communications, 2018, 9(1): 3139.

[34] Faruque O M, Miwa H, Yasuda M, FUJII Y, KANEKO T, SATO S, OKAZAKI S. Identification ofgenes involved in incompatibility with soybean plants carrying theallele. Applied and environmental microbiology, 2015, 81(19): 6710-6717.

[35] Zhang Y, Liu X, Chen L, FU Y, LI C, QI Z, ZOU J, ZHU R, LI S, WEI W, WANG J, CHANG H, SHI Y, WANG J, LI Q, ZHU J, LI J, JIANG H, WU X, JIA C, YIN Z, HU Z, LIU C, CHEN Q, XIN D. Mining for genes encoding proteins associated with NopL ofHH103 using quantitative trait loci in soybean (Merr.) recombinant inbred lines. Plant and Soil, 2018, 431(1/2): 245-255.

Effect ofgene mutation on nodulation ability of soybean rhizobium HH103

LIU HanXi1, Lü Hao1, GUO GuangYu2, LIU DongXu1, SHI Yan1, SUN ZhiJun1, ZHANG ZeXin1, ZHANG YanJiao1, WEN YingNan1, WANG JieQi1, LIU ChunYan1, CHEN QingShan1, XIN DaWei1, WANG JinHui1

1College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030;2Harbinacademy of agricultural science, Harbin 150028

【】Soybean is an important economic crop, which is the main source of food and feed. Symbiosis is a special character of soybean to fix nitrogen in air and transferred into ammonia via rhizobia. Via symbiosis soybean can acquire enough nitrogen source for development. Rhizobial type Ⅲ effectors play pivotal roles in regulating the establishment of symbiosis. Thegene codes an ATP transferase, which can regulate the secretion of type Ⅲ effector of rhizobium into host cells.【】To elucidate the symbiotic mechanism will help to improve the nitrogen fixation efficiency of soybean-rhizobium symbiosis system and is useful for friendly agricultural development. 【】In this study,mutant was constructed by tri-parental mating method and inserted a kanamycin gene in the downstream ofstart codon. The mutant was confirmed by PCR and Southern blot. To detect whether the expression of other type Ⅲ effectors was affected bymutant. The expression of NopC and NopT were identified by induced by genistein via Western blot method. Nodulation experiment were performed in Leonard jars, to detect the nodule phenotype of Williams82 after inoculation with the wild strain HH103 and derived HH103ΩrhcN mutant. Finally, one-hundred soybean germplasms with different genotypes were used for nodulation experiment. 【】The results of PCR and Southern blot confirmed that HH103ΩrhcN mutant was successful, and the extracellular protein identification supported thatmutant can inhibit the secretion of type Ⅲ effectors NopC and NopT. The nodulation test of Williams82 showed thatmutation can significantly inhibit the nodule number and dry weight.Using HH103ΩrhcN mutant and wild type HH103, 100 core germplasm accessions were identified,these results showed thatmutation could reduce the root nodule phenotype of 80 soybean accessions, significantly increase the root nodule phenotype of 13 soybean accessions, and 7 soybean resources did not change significantly. 【】The results showed that the abnormal secretion of type Ⅲ effector factors of rhizobium could affect the establishment of symbiotic system.played an important role in the formation of soybean rhizobium symbiosis system, and different soybean genetic background had different responses.

soybean; rhizobium; type Ⅲ effector;; symbiosis

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.06.003

2020-09-03；

2020-10-26

黑龍江省自然科學(xué)基金杰出青年項目（JC2017006）

劉函西，E-mail：396525797@qq.com。通信作者陳慶山，E-mail：qshchen@126.com。通信作者辛大偉，E-mail：dwxin@neau.edu.com。通信作者王錦輝，E-mail：jinhuiwang113@126.com

（責(zé)任編輯 李莉）