賀新國，郭保根

成都市雙流區(qū)中醫(yī)醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 成都 610020

慢性胃炎主要由幽門螺桿菌(H.pylori，Hp)感染所引起，感染Hp后少有自發(fā)清除，因此慢性胃炎長期持續(xù)存在，部分發(fā)展為慢性多灶性萎縮性胃炎，胃癌的發(fā)生危險(xiǎn)明顯高于普通人群[1]。不同地區(qū)，不同人群抗生素耐藥差異較大，盲目濫用抗生素更易增加細(xì)菌耐藥[2]。研究發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)子泵抑制劑(PPI)三聯(lián)療法對Hp 感染的根除率在少數(shù)地區(qū)已呈明顯下降趨勢，部分歐洲國家的Hp感染根除率已低于80%[3]。通過藥敏試驗(yàn)選擇敏感抗生素是提高Hp根除率的有效方法，但標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌培養(yǎng)+藥敏實(shí)驗(yàn)由于培養(yǎng)條件的限制，不宜在臨床展開。本研究通過使用靈敏度高、特異性好的RT-PCR 方法和基因芯片檢測法，針對萎縮性胃炎患者，檢測胃鏡活檢標(biāo)本中Hp 及其對常用抗菌藥物的耐藥性，了解與萎縮性胃炎相關(guān)性強(qiáng)的Hp耐藥水平及耐藥基因突變情況，旨在為本地區(qū)的Hp的根除治療治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年6 月至2020 年6月在成都市雙流區(qū)中醫(yī)醫(yī)院消化內(nèi)科經(jīng)胃鏡檢查確診的Hp相關(guān)萎縮性胃炎患者210例，其中男性115例，女性95 例，分離得到菌株200 株。納入標(biāo)準(zhǔn)：初次到醫(yī)院就診并行胃鏡檢查者；之前未曾接受Hp 感染根除治療；年齡18～80 歲；診斷符合慢性萎縮性胃炎(中國慢性胃炎共識(shí)意見2012年)。排除標(biāo)準(zhǔn)：近2周內(nèi)服用過抗生素、激素、抑酸藥、鉍劑；嚴(yán)重的心肝肺、腎臟疾病者；有胃部手術(shù)史者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理審查委員會(huì)同意，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 Hp鑒定 胃鏡檢查時(shí)，同時(shí)取2部位組織進(jìn)行檢測(胃竇和胃體各2塊)，立即置于10%中性甲醛溶液中固定，送病理科檢測。①HE染色觀察：胃鏡活檢組織經(jīng)10%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋后進(jìn)行常規(guī)切片、HE 染色，鏡下觀察，排除急性、慢性炎癥及潰瘍性病變。②改良Giemsa Hp染色觀察：采用Hp染色試劑盒(Giemsa法，北京益利精細(xì)公司)，操作步驟按說明書進(jìn)行，鑒定Hp。

1.2.2 Hp 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，調(diào)整菌懸液濃度至6×107CFU/mL，均勻涂抹于酪蛋白綿羊血平皿(成都精博瑞生物科技有限公司)，貼上藥敏試紙后置于微需氧袋，37℃溫度下培養(yǎng)3 d，測量抑菌圈直徑，參照中國食品藥品檢定研究院制定的抗菌藥物藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)判斷Hp對常規(guī)抗生素的耐藥情況。

1.2.3 RT-PCR方法檢測Hp及其耐藥性 ①組織DNA 提?。何附M織蠟塊切10 um 厚蠟卷，按照QIAamp DNA mini kit(Qiagen,Germany)，試劑盒操作步驟提取組織DNA。②RT-PCR 擴(kuò)增及耐藥性檢測：采用RT-PCR方法，擴(kuò)增Hp 23s rRNA和gyrA基因，鑒定Hp。③Hp 克拉霉素及左氧氟沙星耐藥性檢測：采用 RT-PCR，檢 測 Hp23s rRNA 基 因 V 區(qū) A2142G、A2143G、T2182C 突變和 gyrA 基因 N87K (C261A)、D91N(G271A)突變；人RNP基因作為內(nèi)對照。

1.2.4 可視化基因芯片檢測Hp 對克拉霉素和左氧氟沙星的耐藥表型和基因型 提取胃黏膜DNA，制備基因芯片(深圳普瑞康研制開發(fā)的幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療檢測試劑盒(基因芯片法))，檢測本地區(qū)幽門螺桿菌對克拉霉素和左氧氟沙星的耐藥表型和基因型。對于針對克拉霉素耐藥位點(diǎn)設(shè)計(jì)的4 條探針(6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)和9號(hào))，當(dāng)某一條探針的平均灰度值為另三條的兩倍及以上時(shí)，或者只有一條探針有信號(hào)時(shí)，則判斷此條探針為陽性。針對喹諾酮耐藥位點(diǎn)第87位氨基酸設(shè)計(jì)的四條探針(10號(hào)、11號(hào)、12號(hào)和13號(hào))，判讀標(biāo)準(zhǔn)同于克拉霉素耐藥位點(diǎn)的探針的判讀。針對喹諾酮耐藥位點(diǎn)第91 位氨基酸設(shè)計(jì)的三條探針(14 號(hào)、15 號(hào)和16號(hào))，判讀標(biāo)準(zhǔn)也同于克拉霉素耐藥位點(diǎn)的探針的判讀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hp 的耐藥清單 對分離的200 株菌株進(jìn)行7 中常用抗生素的藥敏試驗(yàn)，其中甲硝唑耐藥140 株(70%)，左氧氟沙星耐藥 77 株(38.5%)，克拉霉素耐藥31株(15.5%)，阿莫西林耐藥20株(10%)，呋喃唑酮、慶大霉素和四環(huán)素耐藥各2株(1%)。

2.2 HpgyrA基因N87K(C261A)、D91N(G271A)突變情況 通過對耐左氧氟沙星菌株38 株和敏感菌株10 株進(jìn)行g(shù)yrA 基因序列分析，N87K(C261A)突變耐藥菌株有15 株，敏感組0 株，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；D91N (G271A)突變耐藥菌株有13 株，敏感組0株，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 HPgyrA基因N87K(C261A)、D91N(G271A)突變情況[株(%)]

2.3 Hp23s rRNA 基因 V 區(qū) A2142G 、A2143G、T2182C 突變情況 通過對耐克拉霉素菌株31 株和敏感菌株10株進(jìn)行23s rRNA基因序列分析，A2142G突變耐藥菌株17 株，敏感菌株2 株，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；A2143G 突變耐藥菌株 13 株，敏感菌株 1株，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜00.05)；T2182C 突變耐藥菌株15 株，敏感菌株4 株，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞00.05)，見表2。

表2 Hp23s rRNA基因V區(qū)A2142G、A2143G、T2182C突變情況[株(%)]

3 討論

Hp 感染后，部分患者由慢性非萎縮性胃炎發(fā)展為慢性萎縮性胃炎，其中部分可演變發(fā)展為胃癌[4]。萎縮是從非萎縮性胃炎向癌演變過程中重要的病變階段。根除Hp 可消除炎癥反應(yīng)，使萎縮發(fā)展減慢或停止。然而，隨著抗菌藥物廣泛及長時(shí)間使用，Hp 耐藥率增高，增加根除Hp 的治療難度[5]。其次，受藥物影響及檢測Hp方法的局限性，出現(xiàn)Hp檢驗(yàn)假陰性，貽誤抗Hp治療時(shí)機(jī)，導(dǎo)致胃黏膜慢性炎癥持續(xù)，腺體萎縮。更為重要的是，不同國家或同一國家不同地區(qū)Hp對抗菌藥物的耐藥性差異較大，Hp相關(guān)性胃黏膜的萎縮發(fā)生率也存在很大差異，目前本地區(qū)尚無Hp耐藥率及相關(guān)性胃黏膜的萎縮發(fā)生率研究指導(dǎo)臨床用藥。

喹諾酮類藥物通過抑制細(xì)菌復(fù)制過中的DNA 回旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的活性發(fā)揮抑菌作用[6]。而DNA回旋酶中的A、B兩個(gè)亞單位結(jié)構(gòu)分別由gyrA和gyrB 基因編碼，因此當(dāng)gyrA 基因發(fā)生突變時(shí)即可影響細(xì)菌的耐藥性。gyrA 基因突變的常見方式主要是編碼 N87K(C261A)、D91N(G271A)的突變[7]。本次研究結(jié)果顯示，N87K(C261A)、D91N(G271A)突變的耐藥菌株和敏感菌株比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明本地區(qū)Hp 對左氧氟沙星的耐藥性主要源于C261A、G271A 的基因突變。有研究認(rèn)為，N87K、D91N的改變是Hp 耐左氧氟沙星的主要原因，與本研究結(jié)果相符合[8]?？死顾啬軌蚺cHp23s rRNA基因V區(qū)中的核糖體亞基進(jìn)行結(jié)合，通過抑制肽?；D(zhuǎn)移酶的功能而阻止細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，發(fā)揮抑菌作用[9]。當(dāng)23s rRNA基因的某個(gè)點(diǎn)位發(fā)生突變時(shí)，核糖體結(jié)構(gòu)隨之改變，影響克拉霉素與其的有效結(jié)合，進(jìn)而未能阻止蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生耐藥性[10]。本研究結(jié)果顯示，A2142G、A2143G突變耐藥菌株和敏感菌株比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；T2182C突變耐藥菌株和敏感菌株比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明本地區(qū)Hp對克拉霉素的耐藥性主要源于A2142G、A2143G 的基因突變。相關(guān)文獻(xiàn)指出，A2143G 突變在克拉霉素耐藥性的產(chǎn)生過程中期主導(dǎo)作用[11]，但在根除Hp的治療中卻可以和阿莫西林產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，增強(qiáng)治療效果，而A2142G突變則無次效果。因此，在本地區(qū)Hp 相關(guān)萎縮性胃炎的根除治療中可通過聯(lián)合用藥的方式提高Hp根除率。

綜上所述，Hp耐克拉霉素的主要原因是A2142G、A2143G 基因的突變，耐左氧氟沙星的主要原因是編碼N87K、D91N 的基因C261A、G271A 發(fā)生突變，因此，在胃鏡檢查發(fā)現(xiàn)上述基因突變時(shí)，應(yīng)避免使用克拉霉素和左氧氟沙星，更換或聯(lián)合應(yīng)用其他敏感抗生素。