徐 飛，陳維達，郭溟浩，陳澤濤

(山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 老年醫(yī)學科，山東 濟南 250014)

肺癌(lung cancer,LC)是全球腫瘤相關死亡的主要原因之一，其高發(fā)病率、高病死率成為世界關注的焦點。然而，傳統(tǒng)的治療手段以及分子靶向藥物、腫瘤免疫療法并沒有為晚期或復發(fā)患者帶來理想的利益。面對上述治療困境，進一步探究肺癌的發(fā)生發(fā)展機制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，尋找有效的治療方法與藥物，是肺癌研究領域亟需解決的問題。

既往根據(jù)細胞形態(tài)，將細胞死亡分為3種類型：凋亡(apoptosis)、自噬(autophagy)和細胞壞死(necrosis)。2012年，一種鐵依賴性的脂質過氧化損傷導致的新型非凋亡細胞死亡模式被提出，命名為“鐵死亡” (ferroptosis)[1]。它本質上是由膜脂修復酶——谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase 4,GPX4)活性失效、細胞內脂質過氧化物代謝障礙、鐵依賴的脂質活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)大量累積所致的細胞死亡，在形態(tài)學、遺傳學、生化特征上與凋亡、壞死、自噬具有顯著差異[1]。在形態(tài)學上，鐵死亡主要表現(xiàn)為線粒體體積縮小、線粒體膜密度增加、線粒體嵴減少甚至消失、外膜破裂，而無細胞核濃縮、染色質邊緣化[1]。與正常細胞相比，腫瘤細胞對鐵需求量增加，ROS水平明顯升高，正是這種對鐵的高依賴性和高水平ROS，使得腫瘤細胞更容易發(fā)生鐵死亡[1]。因此，誘導腫瘤細胞鐵死亡成為一種新型的抗肺癌治療策略。本文將對鐵死亡調節(jié)機制、鐵死亡與肺癌的關系作一綜述，以期為肺癌的治療提供理論基礎。

1 鐵死亡的調節(jié)機制

鐵代謝、氨基酸和谷胱甘肽代謝以及脂質代謝是鐵死亡的3大生化過程。

1.1 鐵代謝

鐵在食物中主要以Fe3+形式存在，經(jīng)腸道鐵還原酶如細胞色素B、血紅素加氧酶1(HO-1)等還原成Fe2+，并在二價金屬轉運蛋白1(divalent metal transporter 1,DMT1)的作用下轉運至小腸上皮細胞(intestinal epithelial cell,IEC)，被IEC吸收[2]。在鐵死亡過程中DMT1表達上調[2]。IEC所吸收的鐵(Fe2+)在膜鐵轉運蛋白(ferroportin 1,FPN1)的作用下被運輸至細胞外，并在腸細胞基地外側被多銅氧化酶蛋白氧化為Fe3+，與轉鐵蛋白(transferrin,TF)結合形成TF-Fe3+復合物，經(jīng)血液循環(huán)，運輸至各組織與臟器[2]。循環(huán)中的TF-Fe3+與細胞膜表面上的轉鐵蛋白受體1 (transferrin receptor 1,TFR1)結合，經(jīng)胞吞作用進入細胞，F(xiàn)e3+被釋放，繼而被前列腺六跨膜表皮抗原3(six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3,STEAP3)還原為Fe2+，經(jīng)DMT1進入細胞質[2-3](圖1)。細胞質中的Fe2+稱為不穩(wěn)定鐵池，具有代謝活性，在多種生物功能中發(fā)揮作用，如凋亡、壞死、鐵死亡等。當細胞內鐵過載和抗氧化能力不足時，游離的Fe2+，一方面，通過芬頓反應直接催化脂質過氧化物，產(chǎn)生大量羥自由基，激起強烈的氧化應激反應，產(chǎn)生大量的ROS，誘發(fā)鐵死亡[2]；另一方面，作為輔助因子，增強各種代謝酶(如LOX家族脂氧合酶、PDH1)活性，促進脂質ROS的生成[2]。因此，鐵是鐵死亡的必要元素，鐵代謝是鐵死亡的必要過程。

1.2 氨基酸和谷胱甘肽代謝

谷氨酸/胱氨酸轉運體system Xc-，作為跨膜蛋白，由兩個亞基組成——輕鏈SLC7A11(也稱為xCT)和重鏈SLC3A2(也稱為CD98)[1](圖1)。xCT為其主要功能亞基，由SLC7A11基因編碼合成，對胱氨酸和谷氨酸有高度的特異性，負責主要的轉運活動；SLC3A2，主要作為伴侶蛋白，維持xCT蛋白的穩(wěn)定性。System Xc-調控著胞外胱氨酸和胞內谷氨酸以1∶1比例交換進出細胞[1]。谷氨酸(glutamic acid,Glu)、半胱氨酸(cysteine,Cys)和甘氨酸(glycine,Gly)在谷氨酸-半胱氨酸連接酶(glutamate cysteine ligase,GCL)和谷胱甘肽合成酶(glutamylcysteine synthetase,GSS)的催化下，生成還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)(圖1)。谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidases,GPXs)是一種進化上高度保守的酶，以GSH為輔助因子，將過氧化物(如R-OOH)還原為相應的醇(如R-OH)，從而限制鐵依賴的有毒自由基的形成(如R-O·)，抑制脂質ROS的生成[1](圖1)。GPX4是鐵死亡中最核心的調控因子，胞內GSH含量直接影響GPX4酶活性。

圖1 鐵死亡調節(jié)機制示意圖 Fig 1 Regulatory mechanism of ferroptosis

1.3 脂質代謝

脂質過氧化是指自由基或非自由基等氧化劑從多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)的二烯丙基亞甲基群中獲取一個不穩(wěn)定的氫原子，通過氧化作用生成大量脂質過氧化自由基和過氧化氫的過程[4]。細胞內PUFAs的含量決定著細胞脂質過氧化程度以及對鐵死亡的敏感性。細胞經(jīng)鐵死亡誘導劑erastin處理后，PUFAs花生四烯酸等和PUFA衍生物煙油酸鹽等含量明顯減少[5]。許多參與調控脂肪酸合成的因子和信號分子，如谷氨酰胺分解反應、檸檬酸合成酶和乙酰輔酶A羧化酶等脂氧合酶，通過介導脂質氧化參與調控鐵死亡過程[6]。

酯?；o酶A合成酶長鏈家族成員4(acyl-CoA synthetase long-chain familymember4,ACSL4)是鐵死亡脂質代謝的助力者。一方面，ACSL4和磷脂膽堿?；D移酶3(lysophosphatidylcholine acyltrans-ferase 3,LPCAT3)將游離的長鏈多不飽和脂肪酸活化，促進溶血卵磷脂轉換為卵磷脂，參與氧化細胞膜磷脂質的合成，進而介導鐵死亡過程[7]；另一方面，ACSL4將花生四烯酸輔酶A酯化成?；o酶 A(coenzyme A,CoA)，用于脂肪酸氧化和鐵死亡所需多不飽和脂肪酸的生物合成[7]。CoA的缺失使得脂質過氧化底物減少，鐵死亡程度下降[7]。在PUFAs相關的磷脂質中，含有花生四烯酸(arachidonoyl,AA)或腎上腺酸(adrenoyl,AdA)的磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamines,PEs)，是鐵死亡中脂質氧化作用的關鍵底物，能夠被15-脂氧合酶(15-LOX)氧化生成脂質過氧化氫(H2O2)，促進鐵死亡[8]。當ACSL4基因敲除或功能抑制時，AA或AdA酯化過程受阻，細胞內脂質過氧化物產(chǎn)生減少，鐵死亡被抑制[7]。

2 鐵死亡與肺癌的關系

2.1 鐵死亡與肺癌發(fā)生發(fā)展

2.1.1 鐵離子：流行病學和實驗室研究證實，鐵超載與肺癌的發(fā)生發(fā)展有關，高鐵攝入量與肺癌風險之間存在顯著正相關性。一項臨床試驗數(shù)據(jù)表明，肺癌患者的血清鐵、鐵蛋白、總鐵結合力明顯高于健康對照組，血清鐵濃度越高，患肺癌風險越大[9]。與之結果一致的是，臺灣一項研究對2018年至2009年309 443名的招募時，非腫瘤人群進行中位隨訪時間為7.07年的隨訪，其中8 060例確診腫瘤，3 066例因腫瘤死亡，高血清鐵(>120 μg/dL)增加了惡性腫瘤的發(fā)病與死亡風險，且與腫瘤發(fā)病率與病死率成正相關[10]。大量基礎研究表明，過量的鐵會誘發(fā)凋亡、壞死和鐵死亡[3]。鐵死亡誘導劑erastin促進ROS的累積和細胞死亡，外源性鐵顯著增強erastin所誘導的細胞死亡，而鐵離子螯合劑(deferoxamine,DFO)能夠逆轉erastin所引起的細胞死亡現(xiàn)象[1]。在裸鼠肺癌腫瘤模型中，過表達轉鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1,TFR1加快肺癌細胞對鐵的吸收速度，促進腫瘤生長，縮短小鼠生存期[11]。熱休克蛋白B1(heat shock protein B1，HSPB1)通過抑制TFR1循環(huán)，降低細胞內鐵離子濃度；HSPB1的失活有助于鐵的積累，促進erastin所誘導的腫瘤細胞鐵死亡[12]。值得一提的是，雖然鐵可以通過芬頓反應促進脂類ROS生成，但其他途徑(如H2O2)造成的ROS累積并不會引起鐵死亡。因此，鐵在鐵死亡中的作用機制和應用方面的許多問題仍然沒有答案。

2.1.2 SLC7A11：SLC7A11為一種潛在的肺癌生物標志物，與癌旁組織相比，SLC7A11在NSCLC組織中高表達，與生存期成負相關[13]。在體內外，SLC7A11均能促進肺癌細胞的增值與轉移，敲減SLC7A11可逆轉上述現(xiàn)象[13]。在人肺腺癌細胞系A549中，SLC7A11通過介導胱氨酸攝取幫助肺癌細胞在細胞應激下重建氧化還原穩(wěn)態(tài)，減少ROS的生成，具有促進腫瘤的作用；反之，siRNA干擾敲低SLC7A11表達，降低細胞內GSH含量，抑制A549細胞增殖[13]。

在KARS突變型肺腺癌患者中，SLC7A11高表達，與肺癌進展呈正相關[14]。與之對應的是，在KARS突變的肺腺癌細胞系中，胞內胱氨酸、GSH含量較高。敲除SLC7A11基因或阻斷SLC7A11功能，能夠降低胞內胱氨酸攝取、抑制細胞內GSH的生物合成，在體外顯著抑制腫瘤生長與轉移、延長小鼠生存期，在體內選擇性殺傷KARS突變的肺癌細胞[14]。KARS突變型肺腺癌細胞對SLC7A11的缺失更為敏感，這為KARS突變肺癌的治療帶來希望。

2.1.3 GPX4：GPX4在癌組織中的表達高于正常組織，與肺癌TNM分期、淋巴轉移和遠處轉移成正相關，與患者預后、生存期呈負相關；肺癌細胞系亦呈現(xiàn)GPX4高表達狀態(tài)[15]。過表達GPX4能夠促進肺癌細胞增殖，抵抗鐵死亡；反之，siRNA 敲減GPX4表達或RSL3抑制GPX4活性，抑制H1299、A549和NCI-H460細胞增殖、遷移、侵襲，而鐵死亡抑制劑ferrostatin-1(Fer-1)可逆轉上述現(xiàn)象[15]。這意味著抑制GPX4能夠誘導肺癌細胞發(fā)生鐵死亡，靶向GPX4可能是一種新的肺癌治療模式。

2.1.4 FSP1：FSP1是一種獨立于經(jīng)典GPX4信號通路的鐵死亡抑制因子和非線粒體CoQ抗氧化劑系統(tǒng)的關鍵成分[16]。當肺癌細胞GPX4基因缺失時，F(xiàn)SP1被豆蔻?；揎?，利用NAD(P)H還原CoQ10，生成親脂性自由基捕獲抗氧化劑(radical-trapping antioxidants,RTA)阻止脂質過氧化，從而抑制鐵死亡[16]。FSP1表達水平越高，肺癌細胞鐵死亡抵抗程度越大，而FSP1抑制劑(iFSP1)可逆轉FSP1所致的鐵死亡抵抗，增加肺癌細胞對鐵死亡的敏感性，促進肺癌細胞發(fā)生鐵死亡[16]。目前，對于FSP1的研究還處于萌芽階段，后續(xù)還需進一步研究。

2.2 鐵死亡與化療藥物耐藥

順鉑(cisplatin，DDP)通過促進脂質過氧化，升高MDA、ROS，促進HO-1和NQO-1的表達，誘導肺癌細胞鐵死亡，而這一過程可被Fer-1所抑制[17]。Nrf2/xCT通路的激活是NSCLC細胞耐順鉑的主要機制之一。Erastin和索拉菲尼通過抑制Nrf2下游靶基因xCT的表達，耗竭GSH，誘發(fā)鐵死亡，降低細胞活性，增強NSCLC細胞對順鉑的敏感性[18]。相反，過表達SLC7A11增強肺癌細胞對順鉑的耐藥性[18]。將SLC7A11的表達與1 400種候選抗癌藥物的效力聯(lián)系起來，其中，與39種藥物藥效呈正相關，與296種藥物藥效呈負相關，提示SLC7A11可作為谷胱甘肽介導的抗癌藥物耐藥性的預測因子，預測多種化學藥物敏感性[19]。

與A549細胞相比，A549-DDP細胞(A549順鉑耐藥株)高表達GPX4[20]。抑制GPX4可增強順鉑的細胞毒性作用；反之，過表達GPX4導致順鉑細胞毒性減弱[20]。與單純順鉑或GPX4特異性抑制劑RSL3治療相比，順鉑聯(lián)合RSL3顯著抑制了H1299和A549細胞活性、遷移與侵襲，MDA、ROS、脂質過氧化物含量升高，提示RSL3可增強順鉑的敏感性[20-21]。

此外，鐵自噬被證實促進癌細胞鐵死亡。在這一過程中，鐵蛋白降解，鐵離子從內涵體釋放到細胞質內不穩(wěn)定的鐵池中，從動態(tài)鐵池釋放的過量的鐵通過芬頓反應，產(chǎn)生大量的ROS，誘發(fā)鐵死亡。順鉑處理肺癌細胞所引起的細胞內鐵離子濃度、MDA和ROS含量升高、鐵蛋白(ferritin 1,FTH1)表達下降，被自噬抑制劑3-MA所逆轉，提示順鉑能夠誘發(fā)鐵自噬[20]。在體外，與順鉑組相比，順鉑聯(lián)合RSL3組FTH1水平下降，自噬標志物LC3B Ⅱ/LC3BⅠ比值升高、P62蛋白水平下降，細胞內鐵離子濃度和MDA含量增加[20]?？傊?，上述現(xiàn)象表明，順鉑能夠通過介導鐵自噬，誘發(fā)鐵死亡。

2.3 鐵死亡與放療抵抗

經(jīng)放射治療(ionizing radiation,IR;簡稱放療)處理后，NSCLC細胞ROS含量升高，ACSL4、SLC7A11、GPX4表達升高，線粒體縮小，膜密度增強，為典型的鐵死亡形態(tài)學特征；鐵死亡抑制劑Fer-1可逆轉IR所引起的細胞死亡，提高NSCLC細胞活性[22]。采用CRISPR/Cas9技術沉默H460和A549細胞中ACSL4表達后，ACSL4的缺失顯著減弱了erastin所誘導的肺癌細胞鐵死亡，促進放療抵抗[22]。過表達SLC7A11或GPX4基因削弱IR所誘導的脂質過氧化反應，降低鐵死亡標志基因PTGS2的表達，抑制鐵死亡，增強NSCLC細胞的放療抵抗性[22]。與正常NSCLC細胞相比較，GPX4在放療抵抗性NSCLC細胞中表達明顯升高[23]。RNA干擾技術沉默GPX4后，放療抵抗性A549(A549-R)和H460(H460-R)對鐵死亡的敏感性增強[23]。因此，鐵死亡激活劑erastin能夠增強A549-R和H460-R細胞對放療的敏感性，降低NSCLC細胞對放療的耐藥性，促進細胞死亡；反之，鐵死亡抑制劑DFO可部分“挽救”erastin所誘導的細胞死亡[23]。MicroRNA(miRNA)是一種非編碼RNA，參與調控多種癌基因表達，在放療抵抗性NSCLC細胞中，miR-7-5p表達升高，miR-7-5p通過下調線粒體鐵轉運蛋白，降低Fe2+濃度，減弱芬頓反應，降低細胞內ROS含量，抑制鐵死亡，增強細胞放射抵抗性[24]。

2.4 鐵死亡與免疫治療

T細胞介導的細胞免疫在腫瘤發(fā)生發(fā)展中過程中發(fā)揮重要作用。在免疫治療過程中活化的CD8+T細胞能夠增強腫瘤細胞內鐵死亡特異性的脂質過氧化反應；反之，鐵死亡的激活有助于免疫治療的抗腫瘤效果[25]。CD8+T細胞釋放的IFN-γ下的表達，抑制胱氨酸的攝取，促進脂質過氧化和鐵死亡[25]。耗竭胞內胱氨酸或阻斷PD-L1免疫檢查點，顯著增強T細胞介導的抗腫瘤免疫，誘導腫瘤細胞鐵死亡[25]。同時，臨床數(shù)據(jù)顯示，在黑色素患者中，胱氨酸相關轉運蛋白SLC7A11和SLC3A2的表達與CD8+T細胞的數(shù)量、IFN-γ的表達水平以及患者的預后成負相關[25]。雖然目前針對肺癌，T細胞與鐵死亡的關系未明確指出，但是，不難發(fā)現(xiàn)T細胞促進腫瘤細胞鐵死亡是一種潛在的治療方法，有助于增強免疫治療療效。

3 總結

鐵死亡，作為一種新發(fā)現(xiàn)的細胞死亡形式，在腫瘤治療中表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢和巨大的潛力。許多侵襲性和抗藥性的癌細胞對鐵死亡的敏感性，以及美國FDA批準六甲蜜胺(altretamine)、索拉菲尼(sorafenib)、二氧化硅納米顆粒(silica nanoparticles)作為鐵死亡誘導劑用于腫瘤治療，這使得人們對鐵死亡的治療潛力產(chǎn)生了很高的期望。雖然，近年來鐵死亡相關研究取得了巨大的進展，但仍有一些懸而未決的問題有待解決，如鐵死亡中ROS的特殊性、鐵死亡在免疫治療中的具體作用等。此外，不同組織間細胞對鐵死亡的敏感性存在很大的差異，對鐵死亡誘導劑索拉菲尼、erastin等敏感性也具有顯著的個體間差異。因此，尋找能夠反映細胞、個體對鐵死亡敏感性的生物指標、發(fā)現(xiàn)新的鐵死亡誘導劑，對于提高對鐵死亡相關疾病的認識、肺癌診療水平具有重要意義。鐵死亡將成為腫瘤治療的一種新策略，打破目前肺癌治療的瓶頸，為肺癌患者帶來利益。