方正武，盧奕霏，丁富功，王娜，康珍，侯澤豪，張迎新，王書(shū)平，馬東方，劉易科，朱展望

1.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025 2.主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心(長(zhǎng)江大學(xué))，湖北 荊州 434025 3.湖北荃銀高科種業(yè)有限公司，湖北 荊州 434025 4.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，湖北 武漢430064

1 材料與方法

1.1 材料處理

供試甜蕎品種為‘西農(nóng)9976’。選擇飽滿且大小均勻一致的種子，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的HgCl2溶液消毒3min，經(jīng)無(wú)菌水沖洗后整齊排放在鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，待種子萌發(fā)后移至培養(yǎng)盒中，于光照培養(yǎng)箱中(溫度設(shè)為25℃，光周期為光照12h/黑暗12h)培養(yǎng)至兩葉一心后進(jìn)行干旱脅迫處理。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)PEG-6000溶液脅迫梯度，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%、10%和12%，以等量蒸餾水作為對(duì)照。每天分別向各培養(yǎng)盒中補(bǔ)充適當(dāng)蒸餾水并搖勻，以保持各處理液濃度的相對(duì)穩(wěn)定。每個(gè)處理重復(fù)3次。分別在處理后1、3d和5d剪取葉片，測(cè)定各生理生化指標(biāo)。

1.3 相對(duì)含水量的測(cè)定

參照鄒琦[20]的方法，稍加修改。每個(gè)處理隨機(jī)剪取5株葉片，立即稱(chēng)取樣品的鮮重(mFW)；隨后將葉片浸入蒸餾水中12h取出，經(jīng)濾紙吸去表面水分后，立即稱(chēng)取葉片的飽和鮮重(mSFW)。隨后將葉片置于烘箱中，120℃殺青30min后，80℃烘干至恒重，冷卻后稱(chēng)干重(mDW)。相對(duì)含水量(RWC)計(jì)算公式如下：

1.4 酶液制備

稱(chēng)取甜蕎葉片0.3g置于預(yù)冷的研缽中，加入pH=7.8的50mmol/L磷酸緩沖液5mL，冰浴研磨，勻漿液轉(zhuǎn)入15mL離心管中，再經(jīng)磷酸緩沖液分2次沖洗研缽，合并于上述離心管中，于4℃下3000r/min離心20min，取上清液低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率及過(guò)氧化氫(H2O2)含量的測(cè)定

H2O2含量的測(cè)定參照劉建新[22]的方法稍加修改，以nmol/g FW表示。將1mL酶液與0.1mL 5%硫酸鈦及0.2mL濃氨水混合，待沉淀形成后3000r/min離心10min，棄上清，沉淀用丙酮反復(fù)沖洗5次，直到去除植物色素，靜置沉淀后用2mol/L硫酸5mL溶解，在410nm波長(zhǎng)處測(cè)其光密度。

1.6 酶活性的測(cè)定

1)SOD活性的測(cè)定。參照張盼盼等[23]的方法稍加修改，反應(yīng)液含3mL 130mmol/L甲硫氨酸、3mL 750μmol/L NBT、10mL 100μmol/L EDTA-Na2、50mL 50mmol/L pH 7.8磷酸緩沖液以及20mL蒸餾水，測(cè)定時(shí)，將0.3mL 酶液與8.6mL 反應(yīng)液、0.3mL 1.3μmol/L核黃素混合后于4000lx熒光燈下光照20min，以緩沖液作空白，在560nm波長(zhǎng)下測(cè)其光密度。以抑制NBT光化還原作用50%的酶量為1個(gè)酶活性單位(U)。

2)POD活性的測(cè)定。采用楊淑慎[24]的愈創(chuàng)木酚法，在470nm波長(zhǎng)下測(cè)其光密度，以每分鐘內(nèi)D470nm變化0.01為1個(gè)酶活性單位(U)。

3)CAT活性的測(cè)定。參照BA等[25]的方法，以每分鐘內(nèi)D240nm減少0.01為1個(gè)酶活性單位(U)。

1.7 MDA含量的測(cè)定

參照WANG等[21]的方法稍加修改，以nmol/mg pro表示。將2mL 0.6%TBA (硫代巴比妥酸)與2mL酶液混合后100℃水浴加熱30min，迅速冰浴降溫，4000r/min離心后測(cè)532、600nm和450nm波長(zhǎng)下的光密度。

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)測(cè)量3次。采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析、Origin 9.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG-6000脅迫對(duì)甜蕎幼苗葉片相對(duì)含水量的影響

干旱脅迫下，甜蕎幼苗葉片的物質(zhì)積累隨著PEG-6000溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(見(jiàn)表1)，表現(xiàn)為10%和12%的PEG-6000干旱脅迫下幼苗鮮重和飽和鮮重顯著低于對(duì)照(P<0.05)，且12%的PEG6000脅迫5d時(shí)受害最為嚴(yán)重，與對(duì)照相比，鮮重和飽和鮮重分別顯著減低了69.20%、38.39%。同時(shí)，葉片相對(duì)含水量隨干旱脅迫水平的提高和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而呈持續(xù)降低趨勢(shì)(見(jiàn)圖1)。在5%的PEG-6000的低水平干旱脅迫下，脅迫3d和5d甜蕎幼苗相對(duì)含水量顯著低于對(duì)照；當(dāng)脅迫水平達(dá)到10%時(shí)，與對(duì)照相比，脅迫1、3d和5d的葉片相對(duì)含水量分別顯著下降8.44%、23.52%和50.34%；在12%的PEG-6000脅迫5d時(shí)相對(duì)含水量下降幅度最大，與對(duì)照相比降低了58.04%。

表1 PEG-6000脅迫下甜蕎幼苗的葉片鮮重、飽和鮮重和干重

圖1 PEG-6000脅迫下甜蕎幼苗葉片的相對(duì)含水量Fig.1 Leaf relative water content in common buckwheat seedling under PEG-6000 stress

2.2 PEG-6000脅迫對(duì)甜蕎幼苗葉片中產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

產(chǎn)生速率 (b)H2O2含量 圖2 PEG-6000脅迫下甜蕎幼苗葉片的超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率、H2O2的含量Fig.2 production rate and H2O2 contents in common buckwheat seedling leaves under PEG-6000 stress

2.3 PEG-6000脅迫對(duì)甜蕎幼苗葉片中SOD、POD 和CAT 活性的影響

(a)SOD活性 (b)POD活性 (c)CAT活性 圖3 PEG-6000協(xié)迫下甜蕎幼苗葉片的SOD、POD和CAT酶活性Fig.3 Activities of SOD，POD，CAT in common buckwheat seedling leaves under PEG-6000 stress

2.4 PEG-6000脅迫對(duì)甜蕎幼苗葉片中MDA含量的影響

圖4 PEG-6000脅迫下甜蕎幼苗葉片的MDA含量Fig.4 MDA contents in common buckwheat seedling leaves under PEG-6000 stress

圖5 MDA、活性氧與抗氧化酶的相關(guān)性Fig.5 Correlation of MDA，Reactive oxygen species and antioxidant enzymes

MDA是植物器官在逆境條件下膜脂過(guò)氧化作用的主要產(chǎn)物之一，甜蕎幼苗葉片中MDA含量隨著PEG-6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢(shì)，且干旱處理始終顯著高于對(duì)照(見(jiàn)圖4)。在輕度(5%的PEG-6000)干旱脅迫下，MDA含量增長(zhǎng)緩慢；在中度(10%的PEG-6000)干旱脅迫下，脅迫1d、3d和5d的MDA含量分別較對(duì)照提高了12.06%、25.62%和44.39%(P<0.05)；在重度(12%的PEG-6000)干旱脅迫下，與對(duì)照相比提高了10.89%、43.35%和51.04%(P<0.05)。表明甜蕎幼苗葉片細(xì)胞膜產(chǎn)生了不同程度的膜質(zhì)過(guò)氧化。

2.5 MDA、活性氧與抗氧化酶的相關(guān)性

3 討論

綜上所述，甜蕎幼苗易受干旱脅迫影響，在輕度脅迫(5%的PEG-6000)和短期(1、3d)的中度脅迫(10%的PEG-6000)及重度脅迫(12%的PEG-6000)下，抗氧化酶類(lèi)能夠?qū)钚匝踹M(jìn)行有效的清除，植株表現(xiàn)出一定的受害現(xiàn)象，但葉片相對(duì)含水量仍維持在較高水平，而在長(zhǎng)期(5d)、持續(xù)的中度脅迫(10%的PEG-6000)和重度脅迫(12%的PEG-6000)下，過(guò)量積累的活性氧超出了抗氧化酶類(lèi)的清除能力，氧化和抗氧化平衡狀態(tài)受到破壞，細(xì)胞膜受傷害程度增加，含水量較低，植株受害嚴(yán)重。