廖倩，羅堯堯，王婷，章津銘▲，白俊毅

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137;2.成都肛腸?？漆t(yī)院，四川 成都 610000)

中醫(yī)認(rèn)為結(jié)直腸癌屬于“腸風(fēng)”“臟毒”“腸蕈”“腸積”“積聚”等病的范疇，由于先天或后天的正氣不足、脾胃損傷導(dǎo)致氣滯、血瘀、痰結(jié)、 濕聚、熱毒等相互糾結(jié)，日久積滯而成有形之腫塊[1]。特別是經(jīng)歷手術(shù)和化療的病人正氣進一步受到損害，因此術(shù)后病人最關(guān)鍵的是益氣健脾。

扶康湯處方來源于我國著名的中醫(yī)肛腸病學(xué)專家、成都肛腸?？漆t(yī)院創(chuàng)始人黃濟川先生的臨床驗方。該方由黃芪、麥芽、白芍、山楂、黨參、建曲、白術(shù)、山藥、甘草組成，君藥為黃芪，其性溫味甘，歸脾、肺二經(jīng)，具有補中益氣、固表益衛(wèi)的功效，為補氣藥之上乘[2]；山藥益氣養(yǎng)陰，與黃芪配伍既滋胃陰又補脾氣達到健脾益胃的效果[2-3]；麥芽、山楂、建曲皆入脾胃，與黃芪、白術(shù)、黨參配伍使組方補益脾胃之力更勝[2，4]；白芍養(yǎng)血斂陰，與黃芪、白術(shù)、黨參配伍起到補氣生血的功效[2]；甘草補脾益氣，調(diào)和諸藥[2]；全方共奏益氣扶正、健脾和胃之效，臨床用于減輕結(jié)直腸癌術(shù)后化療導(dǎo)致的一系列由于正氣不足、脾胃虧虛所產(chǎn)生的不良反應(yīng)[5]。目前關(guān)于扶康湯的資料較少，臨床使用為湯劑，為了使扶康湯更好的滿足臨床用藥及時、靈活的需求，課題組將扶康湯開發(fā)成口服液。

方中9味藥有效成分以水溶性為主[6-12]，因此采用水提醇沉法制備口服液。方中表兒茶素為山楂中主要的多酚類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用；芍藥苷是一種水溶性單萜類糖苷，有研究表明[13]其能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和入侵，可能是潛在治療結(jié)直腸癌有效的藥物；甘草在中藥復(fù)方中運用十分廣泛，甘草苷為其主要的活性成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[14]。因此將表兒茶素、芍藥苷、甘草苷作為水提工藝的指標(biāo)成分，采用單因素試驗法和正交試驗法對水提工藝進行優(yōu)化，以三種成分含量和為評價指標(biāo)優(yōu)選水提工藝。采用薄層鑒別法(TLC)對方中黃芪、白芍2味藥進行定性鑒別，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物

芍藥苷對照品(埃法生物，批號：AF9030313，純度98%)，表兒茶素對照品(埃法生物，批號：AF8030805，純度98%)，甘草苷對照品(四川維克奇生物科技有限公司，批號：wkq17110812，純度≥98%)，白芍對照藥材(四川維克奇生物科技有限公司，批號：ycwkq19052106)，黃芪對照藥材(埃法生物，批號：AF8073110)，凈山楂(四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號：1906053)，甘草片(四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號：1907043)，白術(shù)(四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號：D1905083)，黨參片(四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號：1902016)，白芍(四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號：1905073)，山藥(四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號：1905095)，炒建曲(四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號：1904075)，麥芽(四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號：1906022)，黃芪(康美藥業(yè)股份有限公司，批號：190550441)，中藥材經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)裴瑾教授鑒定，符合2015年版《中國藥典》一部相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑

乙腈(西格瑪奧德甲里奇貿(mào)易有限公司，批號：WXBD0236Y)、甲醇(色譜純，西格瑪奧德甲里奇貿(mào)易有限公司，批號：WXBD0614Y)，磷酸(色譜純，成都諾爾施科技有限責(zé)任公司，批號：2019111501)，純水。

1.3 儀器

島津高效液相色譜儀(LC-2030C3D)，Diamonsil C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm),分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，型號：CPA225D)，數(shù)控超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司，型號：DL-720D)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海泉杰儀器有限公司，型號：N-1100)，水浴鍋(上海泉杰儀器有限公司，型號：OSB-2100)，循環(huán)水式多用真空泵(河南省予華儀器有限公司，型號：SHZ-D(III))，液體加熱器(潮州市一壺百飲電器實業(yè)有限公司，型號：FTS-10A)，優(yōu)普系列超純水儀(四川優(yōu)普超純科技有限公司，型號UPK-1-10T)。

2 實驗方法

2.1 扶康湯提取液制備

稱取麥芽30 g，山楂20 g，建曲20 g，白術(shù)15 g，山藥30 g，黃芪30 g，白芍15 g，黨參15 g，甘草10 g，9味藥共185 g，按四因素三水平L9(34)正交表安排的工藝條件用煎煮法提取，過濾后濃縮至一定體積。

2.2 表兒茶素、芍藥苷、甘草苷含量測定方法

2.2.1 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)，采用0.1%磷酸(A)-乙腈(B)為流動相，檢測波長為220 nm，進樣量10 μL，柱溫30℃，流速為1.00 mL/min，洗脫條件見表1。

表1 流動相洗脫條件

2.2.2 對照品溶液制備

精密稱取表兒茶素、芍藥苷、甘草苷各9.58 mg、9.66 mg、10.47 mg，加甲醇制成濃度分別為0.958 mg/mL、0.966 mg/mL、1.047 mg/mL的對照品母液。

2.2.3 供試品溶液制備

吸取2.1項下提取液10 mL于容量瓶中，超聲處理5 min，振蕩搖勻，取適量過0.22 μm濾膜后制成供試品溶液，采用相同提取和處理方法，將不含山楂、白芍、甘草的處方飲片提取制得陰性供試品。

2.2.4 專屬性試驗

取2.2.2項下對照品溶液及2.2.3項下供試品溶液及陰性供試品溶液按2.2.1項下條件進行測定。

2.2.5 線性關(guān)系

取表兒茶素母液，加甲醇稀釋成濃度為0.128 mg/mL、0.102 4 mg/mL、0.051 2 mg/mL、0.025 6 mg/mL、0.012 8 mg/mL、0.006 4 mg/mL的系列對照品溶液。取芍藥苷母液，加甲醇稀釋成濃度為0.966 mg/mL、0.483 mg/mL、0.241 5 mg/mL、0.120 8 mg/mL、0.060 4 mg/mL、0.030 2 mg/mL的系列對照品溶液。取甘草苷母液，加甲醇稀釋成濃度為1.047 mg/mL、0.523 5 mg/mL、0.261 75 mg/mL、0.130 9 mg/mL、0.065 4 mg/mL、0.032 7 mg/mL的系列對照品溶液。按2.2.1項下色譜條件進行測定，以濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.5 精密度實驗

取2.2.2項下對照品母液，按2.2.1項下色譜條件重復(fù)進樣6次，計算表兒茶素、芍藥苷、甘草苷濃度的RSD值。

2.2.6 重復(fù)性實驗

取2.2.3項下供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件重復(fù)進樣6次，計算表兒茶素、芍藥苷、甘草苷濃度的RSD值。

2.2.7 穩(wěn)定性實驗

取2.2.3項下供試品溶液，于放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h后按2.1.2項下色譜條件進行測定，計算表兒茶素、芍藥苷、甘草苷濃度RSD值。

2.2.8 加樣回收實驗

精密量取已知含量的供試品6份，加入一定量的表兒茶素、芍藥苷、甘草苷對照品。按2.1.2項下色譜條件進行測定，計算加樣回收率及RSD值。

2.3 單因素及正交設(shè)計優(yōu)選提取工藝

2.3.1 加水倍數(shù)對提取工藝的影響

取處方比例九味藥，分別加6、8、10、12倍水，浸泡0.5 h，提取2次，每次1 h，測定表兒茶素、芍藥苷、甘草苷含量。

2.3.2 浸泡時間對提取工藝的影響

取處方比例九味藥，加8倍量水，分別浸泡0 h、0.5 h、1 h、1.5 h，提取2次，每次1 h，測定表兒茶素、芍藥苷、甘草苷含量。

2.3.3 提取時間對提取工藝的影響

取處方比例九味藥，加8倍量水，浸泡0.5 h，提取2次，每次分別提取0.5 h、1 h、1.5 h、2 h，測定表兒茶素、芍藥苷、甘草苷含量。

2.3.4 考察因素及水平

根據(jù)單因素考察結(jié)果及以往經(jīng)驗，選擇加水倍數(shù)、浸泡時間、提取時間、提取次數(shù)為主要影響提取工藝的因素，因素水平表見表2。

表2 因素水平表

2.3.5 評價指標(biāo)及結(jié)果分析

以表兒茶素、芍藥苷、甘草苷為指標(biāo)成分，以三者含量之和(W總)為最終評價指標(biāo)。

計算公式為：W=CV/MW總=W表+W芍+W甘

W代表指標(biāo)成分的含量(mg/g)；C代表各指標(biāo)成分濃度(mg/mL)；V代表溶液體積(mL)；M代表含指標(biāo)成分的飲片質(zhì)量(g)。

2.3.6 驗證試驗

按處方比例稱取飲片3份，按優(yōu)選提取工藝結(jié)果進行驗證試驗。

2.4 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立

2.4.1 口服液制備及性狀[15-17]

取處方比例9味藥共185 g，第1次加入10倍量水，第2、3次加入8倍水，煎煮1 h，煎煮3次，合并3次水煎液，靜置36 h，過濾，濾液濃縮至約1 000 mL，加入1 mg/mL的甜蜜素和0.5%的苯甲酸鈉，加水定容至1 000 mL，攪勻，滅菌，即得。觀察口服液性狀。

2.4.2 含量測定

以2.3.6項下驗證試驗的結(jié)果為參照，以其含量和平均值的80%作為下限，為控制扶康湯口服液的含量提供參考。

2.4.3 黃芪定性鑒別[2，18-19]

供試品溶液制備：取扶康湯口服液50 mL，用水飽和正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用1%NaOH溶液洗滌3次，每次20 mL，棄NaOH溶液層，正丁醇液用正丁醇飽和水洗至中性，棄水液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL即得。

陰性溶液制備：按比例稱取缺黃芪的處方，按供試品制備方法制備。

黃芪對照藥材制備：精密稱取0.5 g黃芪對照藥材，加水飽和正丁醇60 mL，加熱回流60 min，過濾，濾液用1%NaOH溶液洗滌3次，每次20 mL，棄NaOH溶液層，正丁醇液用正丁醇飽和水洗至中性，棄水液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL即得。

按TLC法[2015版《中國藥典》(四部)]試驗，取黃芪對照藥材、陰性溶液、供試品溶液各5 μL點于硅膠G板上，以乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷-水(20∶11∶7.5∶5)為展開劑展開，取出后晾干，于紫外光燈(365 nm)下檢視。

2.4.4 白芍定性鑒別[2，20-21]

供試品溶液制備：取扶康湯口服液50 mL，用乙醚提取2次，每次30 mL，棄乙醚液，水層用正丁醇萃取2次，每次20 mL，合并提取液，水浴蒸干，殘渣加乙醇1 mL即得。

陰性溶液制備：按比例稱取缺白芍的處方，按供試品制備方法制備。

芍藥苷對照品制備：精密稱取5.510 mg芍藥苷對照品，制成每1 mL乙醇含1.102 mg芍藥苷的對照品溶液。

白芍對照藥材：精密稱取0.5 g白芍對照藥材，加水煎煮1 h，濾過，按供試品制備方法制備。

按TLC法[2015版《中國藥典》(四部)]試驗，取芍藥苷對照品、白芍對照藥材、陰性溶液、供試品溶液各5 μl點于硅膠G板上，以三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水(8∶4∶1∶1)為展開劑展開，取出后晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，105℃加熱直到顯色。

3 實驗結(jié)果

3.1.1 專屬性試驗

結(jié)果如圖1所示，陰性溶液中沒有檢測出表兒茶素、芍藥苷、甘草苷3種成分，因此確定陰性溶液對3種成分的測定無影響。

注：A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性溶液；1.表兒茶素；2.芍藥苷；3.甘草苷

3.1.2 線性關(guān)系

以濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到表兒茶素回歸方程為Y=36 737 365.3500X-336.674 8(R2=1.000 0)，芍藥苷回歸方程為Y=9 063 541.515 0X+2 870.545 7(R2= 0.999 4)，甘草苷回歸方程為Y=30 740 294.040 0X-167 632.552 6(R2=0.999 8)，線性范圍依次為0.006 4～0.128 mg/mL、0.030 2 ～0.966 mg/mL、0.032 7 ～1.047 mg/mL。

3.1.3 精密度實驗

兒茶素、芍藥苷、甘草苷濃度RSD依次為1.75%、1.89%、1.23%，表示儀器精密度良好。

3.1.4 重復(fù)性實驗

表兒茶素、芍藥苷、甘草苷濃度RSD依次為1.03%、1.32%、2.88%，表示重復(fù)性良好。

3.1.5 穩(wěn)定性實驗

表兒茶素、芍藥苷、甘草苷濃度RSD依次為1.28%、2.46%、2.97%，表示供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.6 加樣回收實驗

表兒茶素、芍藥苷、甘草苷的平均加樣回收率分別為100.22%、103.49%、99.52%，RSD分別為1.65%，2.90%，2.96%，表示本方法回收率良好。結(jié)果如表3所示。

3.3 單因素及正交設(shè)計優(yōu)選提取工藝

3.3.1 加水倍數(shù)對提取工藝的影響

得到表兒茶素、芍藥苷、甘草苷含量和分別為25.40 mg/g、29.00 mg/g、25.92 mg/g、26.49 mg/g。因此加水倍數(shù)選擇8、10、12倍進行下一步正交試驗。

3.3.2 浸泡時間對提取工藝的影響

得到表兒茶素、芍藥苷、甘草苷含量和分別為26.00 mg/g、29.00 mg/g、27.77 mg/g、25.89 mg/g。因此浸泡時間選擇0 h、0.5 h、1h進行下一步正交試驗。

3.3.3 提取時間對提取工藝的影響

得到表兒茶素、芍藥苷、甘草苷含量和分別為18.35 mg/g、28.58 mg/g、30.81 mg/g、27.99 mg/g。因此煎煮時間選擇1 h、1.5 h、2 h進行下一步正交試驗。

3.3.4 評價指標(biāo)及結(jié)果分析

由正交實驗數(shù)據(jù)結(jié)果(表4)直觀分析可知，最佳提取工藝為A2B2C2D3，即加水10倍、浸泡0.5 h、煎煮1.5 h、煎煮3次。影響因素的主次為：D(煎煮次數(shù))>A(加水倍數(shù))>C(煎煮時間)>B(浸泡時間)。因B因素極差最小，因此將B項作為誤差項進行方差分析。得到方差分析結(jié)果如表5所示。因素D的P值<0.05，表明煎煮次數(shù)對提取工藝結(jié)果有顯著影響，因素A和因素C則對結(jié)果影響不顯著。因此為了節(jié)約生產(chǎn)成本及提高生產(chǎn)效率，最終確定提取工藝為A1B1C1D3，但考慮藥材要吸水，因此第1次加10倍水，第2、3次時加8倍，不用浸泡煎煮1 h，煎煮3次。

表3 加樣回收實驗表

表4 L9(34)正交試驗表(n=9)

表5 方差分析表

3.3.5 驗證試驗

結(jié)果見表6，表兒茶素、芍藥苷、甘草苷含量和平均值為36.21 mg/g，RSD為1.33%。因此認(rèn)為本試驗提取工藝的優(yōu)化條件是合理可行的。

表6 驗證結(jié)果

3.4 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立

3.4.1 口服液制備及性狀

本品為棕褐色液體，味甜，氣微香。

3.4.2 含量測定

1 mL扶康湯口服液中表兒茶素、芍藥苷、甘草苷分別不得低于0.016 mg、0.184 mg、0.152 mg。

3.4.3 黃芪定性鑒別

供試品色譜中，與對照品及對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同的黃色熒光。如圖2所示。

注：從左到右依次為黃芪對照藥材；陰性溶液；供試品溶液(3次)

3.4.4 白芍定性鑒別

供試品色譜中，與對照品及對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同的藍(lán)紫色斑點。如圖3所示。

注：從左到右依次為芍藥苷對照品；白芍對照藥材；陰性溶液；供試品溶液(3次)

4 討論

傳統(tǒng)湯劑在煎煮過程中由于煎煮時間、煎煮次數(shù)、加水倍數(shù)等存在差異導(dǎo)致湯劑質(zhì)量受到影響，且貯存、攜帶也不方便。因此將傳統(tǒng)湯劑開發(fā)制成口服液能減少服藥體積，口感更易接受，貯存攜帶方便，方便臨床使用。本實驗著重考察了扶康湯口服液的提取工藝，未對純化工藝進行考察，綜合考慮醫(yī)院生產(chǎn)成本及生產(chǎn)設(shè)備等方面，試驗選擇靜置36 h達到純化目的，但是在后期口服液放置過程中出現(xiàn)了少許渾濁沉淀，因此在進一步試驗中將改進扶康湯口服液的純化工藝。在矯味劑的選擇中，比較了三氯蔗糖和甜蜜素加入后的口感，發(fā)現(xiàn)甜蜜素的口感更好，因此選擇甜蜜素作為矯味劑；通過測量水煎液的pH值在5.0左右，因此選用苯甲酸鈉作為防腐劑[15]。

在薄層鑒別中，參照《中國藥典》2015年版一部中黃芪、白芍2種藥材的鑒別均未能使成分有效分離，通過查閱文獻，經(jīng)過多次試驗，黃芪和白芍薄層鑒別斑點清晰、分離度好、陰性對照無干擾，重現(xiàn)性好，可作為扶康湯口服液質(zhì)量控制方法。